刺五加多糖的提取与纯化方法与流程

本发明涉及多糖的提取与纯化领域，具体为刺五加多糖的提取与纯化方法。

背景技术

刺五加为五加科植物。

刺五加acanthopanaxsenticosus(rupr.etmaxim.)harms的干燥根和根茎或茎，具有益气健脾，补肾安神的功效。其性辛、微苦，温。刺五加中的主要活性成分为黄酮类、皂苷类及多糖类化合物，其中刺五加中的多糖能增强机体免疫力，对肿瘤有较强的抑制作用。

目前，多糖类化合物的提取技术常用的有热水提取、水提醇沉、碱提、酸提、微波提取、超声提取法，但针对刺五加多糖的提取纯化方法较少。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题在于提供刺五加多糖的提取与纯化方法，能够提高提取的浓度和纯度。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

刺五加多糖的提取与纯化方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化

(1)提取方法：超声波法提取

称取5g粉碎料，以料液比1:20配置成水溶液，在超声仪中进行超声提取；

(2)去蛋白质

sevage法去蛋白质：将提取液与有机浸提剂4:1混合，剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀，保留水层，重复多次，获得分离液；

3)干燥。

作为优选，所述步骤2)提取与纯化(1)提取方法：超声波提取方法中，超声波提取条件为温度：70℃，超声波功率：320w，超声波提取时间：2小时。

作为优选，所述有机浸提剂为体积比5:1的氯仿：正丁醇溶液。

作为优选，所述步骤2)提取与纯化(1)提取方法还可以用热水法提取：称取5g粉碎料，投入至水浴锅料液比1：15(去离子水)，90℃恒温蒸馏2h，放出煎液，残渣仍留于锅中，再加入15倍量的去离子水，与第一次操作一样，放出第2次煎液，与第一次合并，获得初提液，将初提液放入烧杯，静置过夜，分离获得提取液。

作为优选，所述步骤2)提取与纯化还可以用酶法进行提取与纯化：(1)称取5g粉碎料，投入至水浴锅料液比1：6(去离子水)，90℃恒温蒸馏1h；(2)水浴锅降温至45℃，加入酶液，并搅拌均匀，45℃保温1h；(3)水浴锅升温至100℃并保持1分钟以杀死酶；(4)80目过滤取滤液；(5)残渣加10倍水量，100℃保持2h，80目过滤；(6)将两步滤液合并，静置过夜，取上清液。

作为优选，所述(2)中酶液包括纤维素酶1.5％，木瓜蛋白酶0.8％，菠萝蛋白酶3.5％。

作为优选，还包括大孔树脂静态吸附进一步纯化：

hpd826树脂进行预处理；取预处理后的hpd826和步骤2)中最终获得的液体，在120次/min，25℃条件下震荡12h，进行吸附提取。

作为优选，所述大孔树脂静态吸附中用hpd100树脂替换hpd826树脂。

本发明提供了刺五加多糖的提取与纯化方法。该技术方案以刺五加为原料，通过超声波法、热水法和酶法进行多糖提取，然后除去蛋白质等杂质，通过正交试验寻找最佳实验条件，并对hpd826和hpd100两种树脂进行了优选，吸附多糖，通过紫外等方法进行表征，确定纯度以及大孔吸附效果，进而确定了最佳的提取和纯化方法，实验结果表明，刺五加多糖采用超声波法提取效果较好，而且采用hpd826树脂吸附效果较好。本发明为刺五加多糖的生产与应用奠定了基础，其制备方法简单易行，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为刺五加红外特征吸收光谱；

图2刺五加多糖gpc分子量测定；

图3为刺五加紫外特征吸收光谱；

图4为刺五加溶液的标准曲线。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

刺五加多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化

(1)提取方法：超声波法提取

称取5g粉碎料，以料液比1:20配置成水溶液，在超声仪中进行超声提取；

(2)去蛋白质

sevage法去蛋白质：将提取液与有机浸提剂4:1混合，剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀，保留水层，重复多次，获得分离液；

3)干燥。

实施例2

刺五加多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化

(1)提取方法：超声波法提取

称取5g粉碎料，以料液比1:20配置成水溶液，在超声仪中进行超声提取，超声波提取条件为温度：70℃，超声波功率：320w，超声波提取时间：2小时。；

(2)去蛋白质

sevage法去蛋白质：将提取液与有机浸提剂4:1混合，所用的有机浸提剂为体积比5:1的氯仿：正丁醇溶液，将混合液剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀，保留水层，重复多次，获得分离液；

3)干燥。

实施例3

刺五加多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化

(1)提取方法：热水法提取

称取5g粉碎料，投入至水浴锅料液比1：15(去离子水)，90℃恒温蒸馏2h，放出煎液，残渣仍留于锅中，再加入15倍量的去离子水，与第一次操作一样，放出第2次煎液，与第一次合并，获得初提液，将初提液放入烧杯，静置过夜，分离获得提取液。

(2)去蛋白质

sevage法去蛋白质：将提取液与有机浸提剂4:1混合，所用的有机浸提剂为体积比5:1的氯仿：正丁醇溶液，将混合液剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀，保留水层，重复多次，获得分离液；

3)干燥。

实施例4

刺五加多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化：酶法

(1)称取5g粉碎料，投入至水浴锅料液比1：6(去离子水)，90℃恒温蒸馏1h；(2)水浴锅降温至45℃，加入酶液，并搅拌均匀，45℃保温1h；加入的酶液包括纤维素酶1.5％，木瓜蛋白酶0.8％，菠萝蛋白酶3.5％。(3)水浴锅升温至100℃并保持1分钟以杀死酶；(4)80目过滤取滤液；(5)残渣加10倍水量，100℃保持2h，80目过滤；(6)将两步滤液合并，静置过夜，取上清液；(7)hpd826和hpd100两种树脂进行预处理，然后取预处理后的hpd826和hpd100各0.1g于锥形瓶中，在120次/min，25℃条件下震荡12h。

3)干燥。

实施例5

刺五加多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化

(1)提取方法：超声波法提取

称取5g粉碎料，以料液比1:20配置成水溶液，在超声仪中进行超声提取，超声波提取条件为温度：70℃，超声波功率：320w，超声波提取时间：2小时。；

(2)去蛋白质

sevage法去蛋白质：将提取液与有机浸提剂4:1混合，所用的有机浸提剂为体积比5:1的氯仿：正丁醇溶液，将混合液剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀，保留水层，重复多次，获得分离液；

(3)大孔树脂静态吸附

hpd826树脂进行预处理；取预处理后的hpd826和步骤2)中最终获得的液体，在120次/min，25℃条件下震荡12h，进行吸附提取。

3)干燥。

实施例6

刺五加多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

1)粉碎：粉碎成絮状；

2)提取与纯化

(1)提取方法：超声波法提取

称取5g粉碎料，以料液比1:20配置成水溶液，在超声仪中进行超声提取，超声波提取条件为温度：70℃，超声波功率：320w，超声波提取时间：2小时。；

(2)去蛋白质

sevage法去蛋白质：将提取液与有机浸提剂4:1混合，所用的有机浸提剂为体积比5:1的氯仿：正丁醇溶液，将混合液剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀，保留水层，重复多次，获得分离液；

(3)大孔树脂静态吸附

hpd100树脂进行预处理；取预处理后的hpd100和步骤2)中最终获得的液体，在120次/min，25℃条件下震荡12h，进行吸附提取。

3)干燥。

实施例7

本实施例用于通过实验方法考察以上实施例1～6所提供的刺五加多糖提取与纯化方法的技术效果：

1、仪器与试剂

刺五加、无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、浓盐酸、纤维素酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶

fa1604n型电子天平、yp601n电子天平、shb-ⅲ循环水式多用真空泵、hh-4数显恒温水浴锅、irprestige-21傅里叶红外光谱仪、tdz6-ws台式低速离心机、jj-1精密定时电动搅拌器、sk8200hp超声波清洗机、phsj-3f酸度计、uv-2550紫外可见分光光度计

2、实验方法

1)超声法提取刺五加多糖

将灵芝先进行粉碎至絮状，取5g以料液比1:20配置成水溶液。在超声仪中使用320w功率，70℃，进行超声2小时。

2)热水法提取刺五加多糖

将灵芝粉碎至絮状，取5g投入至水浴锅料液比1：6(去离子水)，90℃恒温蒸馏1h.降温至45℃，加入酶液(纤维素酶1.5％，木瓜蛋白酶0.8％，菠萝蛋白酶3.5％)，并搅拌均匀，45℃保温1h。升温至100℃并保持1分钟以杀死酶，80目过滤取滤液。残渣加10倍水量，100℃保持2h，80目过滤。将两步滤液合并，静置过夜，取上清液

3)酶法提取刺五加多糖

将灵芝粉碎至絮状，取5g投入至水浴锅料液比1∶6(去离子水)，90℃恒温蒸馏1h.降温至45℃，加入酶液(纤维素酶1.5％，木瓜蛋白酶0.8％，菠萝蛋白酶3.5％)，并搅拌均匀，45℃保温1h。升温至100℃并保持1分钟以杀死酶，80目过滤取滤液。残渣加10倍水量，100℃保持2h，80目过滤。将两步滤液合并，静置过夜，取上清液。

4)去蛋白

热水法和超声波法初次提取后的溶液分别进行sevage法去蛋白质，酶解法不用此步。

sevage法去蛋白质：将提取液与有机溶剂(氯仿：正丁醇＝5:1)4:1混合，剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，分去水层和有机层交界处变性蛋白质，除去沉淀(保留水层)。重复多次，并收集水层。

5)刺五加红外图谱分析

操作irprestige-21傅立叶变换红外光谱仪分析对刺五加多糖进行分析，作红外光谱图。

6)分子量的测量分析

测定刺五加多糖mp、mn、mw和pd的值。

7)大孔树脂静态吸附

hpd826和hpd100吸附优选：

①刺五加标准液的特征吸收波长为277nm。用uv-2550紫外可见分光光度计，在刺五加多糖特定波长277nm处测量刺五加标准溶液的吸光度a，并绘制出标准曲线。在相同温度相同时间内，在刺五加溶液的最大吸收波长处测定吸附后溶液的吸光度a，从标准曲线上可以得到吸附后溶液中刺五加的浓度。按照公式(1)、(2)计算吸附率(x)和吸附量(q)

式中：x为水凝胶的吸附率(％)，c0为溶液中刺五加的初始浓度(mg/l)，c为吸附后溶液中残余的刺五加的浓度(mg/l)，q为吸附量(mg/g)，m为吸附用的水凝胶的用量(g)，v为吸附溶液体积(ml)。

绘制刺五加溶液的标准曲线。

②使用容量瓶以1g/l刺五加溶液为原液配置出0.4g/l，0.3g/l，0.2g/l，0.1g/l的溶液备用。

③对hpd826和hpd100两种树脂进行预处理。

④取hpd826和hpd100各0.1g于五个锥形瓶中，再取四种备用品标准液25ml与四个锥形瓶中，第五个放入25ml蒸馏水最为空白试验，在120次/min，25℃条件下震荡12h。

⑤同法35℃下重复试验。

3、结果与讨论

1)刺五加红外图谱分析

如图1所示，3429cm^-1的吸收峰是-oh的伸缩振动吸收峰,2924cm^-1处的吸收峰是c-h的伸缩振动吸收峰,1725cm^-1处为羰基吸收峰1608cm^-1处的吸收峰是-oh的弯曲振动吸收峰，1414cm^-1-1380cm^-1处吸收峰是碳碳双键的变形吸收峰。在1322cm^-1处则是c-h弯曲振动吸收峰。1153cm^-1处的吸收峰是环上碳一氧(c-o)吸收峰。而在1077cm^-1-1025cm^-1处的吸收分为醇羟基-oh的变角所引起的。895cm^-1处所出现的特征吸收峰为β2型糖苷键,说明刺五加多糖β2多糖。

2)分子量的测量分析

表1gpc分子量测定

由图2和表1可知刺五加多糖的分子量较小，便于大孔树脂静态吸附。

3)热水法、超声法、酶法的提取效果

表2三种方法对刺五加提取的效果

由表2可知，热水法、超声法、酶法三种提取方法中超声波法提取刺五加多糖的效果最好。

4)大孔树脂静态吸附静态吸附研究

由图3和图4可得：标准曲线y＝8.645x-0.1693r²＝0.993

使用紫外可见分光光度计测定25℃条件下hpd100吸收后溶液中刺五加的浓度得表3。

表3hpd100在25℃条件下对刺五加多糖的吸附

使用紫外可见分光光度计测定35℃条件下hpd100吸收后溶液中刺五加的的浓度得表4。

表4hpd100在35℃条件下对刺五加多糖的吸附

使用紫外可见分光光度计测定25℃条件下hpd826吸收后溶液中刺五加的的浓度得表5。

表5hpd826在25℃条件下对刺五加多糖的吸附

使用紫外可见分光光度计测定35℃条件下hpd826吸收后溶液中刺五加的的浓度得表6。

表6hpd826在35℃条件下对刺五加多糖的吸附

由上述四表可以得到两种大孔树脂在35℃条件下吸附量均低于其在25℃温度下吸附量，而且hpd826吸附量受温度影响要低于hpd100，因此在温度变化较大或是较高温度条件下可以使用hpd826去对刺五加多糖进行吸附。

4、结论

本发明刺五加多糖提取的最佳条件为：粉碎的刺五加以料液比1:20配置成溶液，在320w，70℃的超声条件下进行超声提取2h，将提取液与有机溶剂(氯仿：正丁醇＝5:1)4:1混合，剧烈震荡20-30min，在3000r/min条件下离心15min，去除蛋白质。重复多次。然后在25℃温度下采用hpd826大孔树脂进行吸附，最后洗脱，获得刺五加多糖。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。