杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法及应用与流程

本发明属于分子生物学及兽用生物制品技术领域，具体涉及杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及其应用。

背景技术：

猪瘟(classicalswinefever，csf)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征，主要危害家猪和野猪，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟的流行趋势发生了很大变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，且免疫失败的现象时有发生。这种新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。

目前，疫苗接种仍然是防制猪瘟的重要措施，但是传统疫苗由于是弱毒疫苗，不能区分感染和免疫动物(differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals，diva)，因而不能满足防制猪瘟的需求。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供了一种杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗，是通过杆状病毒表达系统表达的含有信号肽的猪瘟sp-e2蛋白，其中信号肽sp的序列如seqidno.1所示，表达e2蛋白的核酸序列如seqidno.2所示。

本发明所述的猪瘟e2亚单位疫苗的氨基酸序列如seqidno.3所示。

本发明进一步提供了所述猪瘟e2亚单位疫苗在防治猪瘟病毒感染中的应用。

本发明所述猪瘟sp-e2亚单位疫苗的制备方法，包括步骤如下：

1)构建含有e2及其信号肽目的基因的穿梭质粒，将其转化dh10bac感受态细胞，使其发生转座，通过蓝白斑筛选，获得重组杆粒；

2)将重组杆粒转染昆虫细胞，获得杆状病毒，并将杆状病毒在昆虫细胞上进行传代；

3)将p3代病毒液感染大量的昆虫细胞，纯化并获取e2蛋白；

4)利用sp-e2蛋白与seppic206水佐剂充分乳化，制得猪瘟sp-e2亚单位疫苗。

进一步地，该方法的具体操作步骤如下所述：

(1)目的基因的扩增

根据genbank设计引物sp-f、sp-r、e2-f和e2-r；

先以引物sp-f、sp-r扩增获得sp信号肽，以引物e2-f、e2-r扩增获得e2片段，再以sp信号肽、e2蛋白为模板，引物sp-f、e2-r扩增获得目的基因sp-e2；

引物sp-f、sp-r、e2-f和e2-r的序列如seqidno.4～7所示；

(2)穿梭质粒的构建

pfastbachtb质粒以ecorⅰ和xholⅰ限制性内切酶37℃酶切2h后回收，将酶切的载体与目的基因用同源重组酶37℃重组30min，转化ecoli感受态细胞，挑斑鉴定，阳性菌送测序；

(3)重组杆粒的获取

将阳性质粒转化dh10bac感受态细胞，48h后挑选白斑，用引物m13-f和m13-r进行pcr鉴定后抽提杆粒；

引物m13-f和m13-r的序列如seqidno.8～9所示；

(4)转染及杆状病毒的获取

用脂质体转染试剂ⅱreagent按照invitrogen说明书进行转染sf9细胞，27℃培养96h，细胞出现病变，收集p1代病毒液，将p1代病毒液重新感染highfive细胞，27℃培养96h后收获p2代病毒液，同样的方法获取p3代病毒液；

(5)sp-e2的westernblot鉴定

将p1代毒液加入长至70％-80％密度的highfive细胞的96孔板，27℃感染96h后进行westernblot鉴定，一抗为csfv的阳性血清、阴性血清及单抗，二抗为hrp标记的兔抗猪二抗、fitc标记的羊抗鼠二抗；

(6)sp-e2的ifa鉴定

将p1代毒液加入长至70％-80％密度的highfive细胞的96孔板，27℃感染48h后进行间接免疫荧光实验，一抗为csfv的阳性血清、阴性血清及单抗，二抗为fitc标记的兔抗猪二抗、fitc标记的羊抗鼠二抗；

(7)蛋白的表达及纯化

用50ml培养基在250ml摇瓶里培养highfive细胞，当细胞密度到达1.5×10⁶个/ml时，以moi＝1感染细胞，27℃，115rpm/h培养96h，4000rpm离心10min，收集上清，用镍柱纯化蛋白，将纯化的蛋白进行定量及westernblot鉴定。

发明原理描述：

猪瘟病毒为黄病毒科瘟病毒属成员，含有一个大的开放阅读框(openreadingframe，orf)，该阅读框编码一个含3898个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，加工形成4个结构蛋白(c、erns、e1和e2)和8个非结构蛋白(npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b)。其中囊膜糖蛋白e2是主要保护性抗原蛋白，可以诱导抗猪瘟的保护性免疫。

杆状病毒表达系统在近年来迅速发展，由于其操作简单、安全性高、可通过悬浮培养规模表达蛋白、有翻译后修饰作用、其蛋白的免疫原性及构想与天然蛋白相似等优点而得到广泛的应用。利用杆状病毒表达系统制备猪瘟e2亚单位疫苗免疫原性强，安全性好，通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能从根本上净化猪瘟病毒。

由于杆状病毒表达系统表达不同的猪瘟e2蛋白，其表达产量、免疫效果等方面有较大差异，导致杆状病毒表达系统表达的猪瘟e2亚单位疫苗还未普及

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明研制的sp-e2亚单位疫苗免疫小鼠后能够优先于其qz14-e2、hz08-e2蛋白的产生猪瘟的特异性抗体，且中和抗体水平远高于qz14-e2、hz08-e2蛋白；免疫猪后可诱导产生特异性抗体。

2、本发明的疫苗具有产量高，免疫原性强，安全性好，通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能够从根本上净化猪瘟病毒。

附图说明

图1为sp-e2重组杆状病毒构建示意图。

图2为目的基因pcr扩增及重组杆粒的pcr鉴定图(左图为目的基因的扩增图，右图为重组杆粒的pcr的鉴定图)。

图3为sp-e2蛋白在昆虫细胞中的表达结果(左图为sds-page结果，右图为westernblot图)。

图4为sp-e2蛋白在昆虫细胞中的ifa鉴定结果(sf9细胞感染bac-sp-e248h后，用猪瘟标准阳性血清、标准阴性血清，单抗ifa鉴定sp-e2在昆虫细胞的表达情况)。

图5为sp-e2、e2、csp-ce2、sp-ce2、csp-e2蛋白纯化鉴定结果(左图为蛋白10倍浓缩图，右图为蛋白2倍浓缩图)。

图6为小鼠免疫sp-e2亚单位疫苗0、7、14、21、28天的血清的中和效价、elisa及ifa结果。(图中a为血清的elisa结果，b为血清的中和效价，c为免疫7天的血清的ifa结果，d为免疫14天的血清的ifa结果)

图7为猪免疫sp-e2亚单位疫苗0、7、14、21、28天的血清阻断elisa结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，而不意图限制本发明的范围。

本发明蛋白的表达过程中所用引物的序列如下表所示：

实施例1猪瘟sp-e2蛋白的表达

1)目的基因的扩增

根据genbank设计引物sp-f、sp-r、e2-f、e2-r，先以sp-f、sp-r扩增获得sp信号肽，以e2-f、e2-r扩增获得e2片段，再以sp、e2为模板，sp-f、e2-r引物扩增获得目的基因sp-e2(如图2所示)。

2)穿梭质粒的构建

pfastbachtb质粒以ecorⅰ和xholⅰ限制性内切酶37℃酶切2h后回收，将酶切的载体与目的基因用同源重组酶37℃重组30min，转化ecoli感受态细胞，挑斑鉴定，阳性菌送测序。

3)重组杆粒的获取

将阳性质粒转化dh10bac感受态细胞，48h后挑选白斑，用m13引物进行pcr鉴定(如图2所示)后抽提杆粒。

4)转染及杆状病毒的获取

用脂质体转染试剂ⅱreagent按照invitrogen说明书进行转染sf9细胞，27℃培养96h，细胞出现病变，收集p1代病毒液，将p1代病毒液重新感染highfive细胞，27℃培养96h后收获p2代病毒液，同样的方法获取p3代病毒液。

5)sp-e2的westernblot鉴定

将p1代毒液加入长至70％-80％密度的highfive细胞的96孔板，27℃感染96h后进行westernblot鉴定，一抗为csfv的阳性血清、阴性血清及单抗，二抗为hrp标记的兔抗猪二抗、fitc标记的羊抗鼠二抗，结果如图3所示。

6)sp-e2的ifa鉴定

将p1代毒液加入长至70％-80％密度的highfive细胞的96孔板，27℃感染48h

后进行间接免疫荧光实验，一抗为csfv的阳性血清、阴性血清及单抗，二抗为fitc标记的兔抗猪二抗、fitc标记的羊抗鼠二抗，结果如图4所示。

7)蛋白的表达及纯化

用50ml培养基在250ml摇瓶里培养highfive细胞，当细胞密度到达1.5×10⁶个/ml时，以moi＝1感染细胞，27℃，115rpm/h培养96h，4000rpm离心10min,收集上清，用镍柱纯化蛋白，将纯化的蛋白进行定量及westernblot鉴定。

如图5所示，sp信号肽可使e2蛋白呈分泌表达，且能够提高ce2、e2的蛋白表达量。

实施例2本发明的猪瘟sp-e2蛋白亚单位疫苗的制备及动物免疫实验。

将实施例1表达的sp-e2蛋白与seppic206水佐剂以1：1的比例350rpm混匀10min,密封4℃避光保存。

试验例1

16只6周龄的雌性balb/c小鼠随机分为四组，每组4只，第一组皮下注射sp-e2蛋白50μg,第二组皮下注射hz08-e2蛋白50μg，第三组皮下注射qz14-e2蛋白50μg，第四组皮下注射pbs，首免14天时进行二次免疫，分别于首免后的0d、7d、14d、21的、28d采血，分别用间接elisa、间接免疫荧光，血清的中和实验，如图6所示，实验表明sp-e2亚单位疫苗免疫小鼠后能够优先于其qz14-e2、hz08-e2蛋白的产生猪瘟的特异性抗体，且中和抗体水平远高于qz14-e2、hz08-e2蛋白如图6所示。

试验例2

12头仔猪，随机分为4组，免疫组每组3头，免疫剂量分别为5μg、15μg、30μg，对照组1头，免疫dmem培养基，分别于免疫0d、7d、14d、21、28d采血,进行阻断elisa试剂盒检测，如图7所示，免疫5μg的猪在免疫21d时抗体转阳性，而免疫15μg、30μg的猪在免疫14d时抗体部分转阳性，21d时抗体全部转阳性，由此可以看出猪瘟sp-e2蛋白亚单位疫苗的免疫效果良好。

以上所述仅是本发明的实施方式。

应当指出，对于本技术邻域的技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也视为本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>72

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgataaaagtattaagagggcaggtcgtgcaaggtataatatggctgctgctggtgacc60

ggggcacaaggg72

<210>2

<211>993

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cggctgtcctgcaaggaagactacaggtatgcgatatcatcaaccaatgagatagggccg60

ctaggggctgaaggcctcaccaccacctggagagagtatagccatggtttgcagctggat120

gacgggactgtcagggccatctgcactgcggggtccttcaaagttatagcacttaatgtg180

gtcagtaggaggtacctggcatcattacacaagagggctttgcccacctcagtaacattt240

gaactcctatttgatgggactagcccagcaattgaggagatgggagatgactttggattt300

gggctgtgcccttttgacacaaccccagtggtcaaagggaagtacaataccactctatta360

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gcagtgagccccacaaccttaagaacagaagtggtgaagaccttcaagagagagaagcct480

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acactaagaaacaagtactatgagcccagggacagctattttcagcaatatatgcttaag960

ggcgagtaccaatactggtttgacctggacgtg993

<210>3

<211>355

<212>prt

<213>编码猪瘟e2-sp的氨基酸序列(artificialsequence)

<400>3

metilelysvalleuargglyglnvalvalglnglyileiletrpleu

151015

leuleuvalthrglyalaglnglyargleusercyslysgluasptyr

202530

argtyralaileserserthrasngluileglyproleuglyalaglu

354045

glyleuthrthrthrtrpargglutyrserhisglyleuglnleuasp

505560

aspglythrvalargalailecysthralaglyserphelysvalile

65707580

alaleuasnvalvalserargargtyrleualaserleuhislysarg

859095

alaleuprothrservalthrphegluleuleupheaspglythrser

100105110

proalailegluglumetglyaspasppheglypheglyleucyspro

115120125

pheaspthrthrprovalvallysglylystyrasnthrthrleuleu

130135140

asnglyseralaphetyrleuvalcysproileglytrpthrglyval

145150155160

ileglucysthralavalserprothrthrleuargthrgluvalval

165170175

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180185190

thrthrilevalglulysgluaspleuphetyrcyslystrpglygly

195200205

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210215220

vallysglncysargtrpcysglypheaspphelysgluproaspgly

225230235240

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245250255

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260265270

serthrgluglygluhisglucysleuileglyasnthrthrvallys

275280285

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290295300

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305310315320

asntyrthrlysthrleuargasnlystyrtyrgluproargaspser

325330335

tyrpheglnglntyrmetleulysglyglutyrglntyrtrppheasp

340345350

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355

<210>4

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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