鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法与流程

本发明涉及生物毒株鉴别技术领域，具体涉及一种鉴定鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144的酶切位点及其方法。

背景技术：

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)是引起我国仔猪腹泻的重要病原，影响我国养猪业的发展，给猪场造成了巨大损失。各日龄猪均易感，哺乳仔猪感染率和病死率最高。在仔猪中以引起呕吐、脱水、水样腹泻和严重的肠炎为主要特征(刘政龙等，2015)。2010年，pedv变异毒株引起的ped在我国暴发，由于经典疫苗对流行的变异毒株的保护力不够，导致我国规模化养殖场陆续出现仔猪严重腹泻，大量死亡的情况(liwtetal.,2012,sunrqetal.,2012)。

目前，我国流行的主要pedv毒株为变异毒株，占比90％以上，成为危害我国养猪业重要病原之一。由于pedv毒株之间的交叉保护力不一样，毒株类型影响疫苗免疫效果，因此pedv变异弱毒疫苗的研发和其对应的鉴别方法的建立对于ped疫苗的推广、使用以及ped的防控具有重要意义。2013年本实验室分离到一株变异毒株，命名yn1(genbankno：kt021227)，经过vero细胞上连续传代至144代，获得了一种来源于高度适应细胞的毒株yn144(genbankno：kt021232)。通过动物实验证实已适应细胞的15代病毒yn-15(genbankno：kt021228.1)仍为强毒力野毒株，而yn-144为致弱毒株(chenfzetal.,2015)，随后对变异弱毒yn144进行了临床评估，证明该毒株安全性和对变异毒株引起的ped有很好的保护性,可作为疫苗候选株(刘洋，2016)。

目前检测pedv的经典疫苗毒株(cv777)的rt-pcr方法有很多，但还没有鉴别pedv变异弱毒的检测方法。经典疫苗毒株(cv777)的鉴别是根据orf3基因连续缺失49个核苷酸的特点，在基因缺失两端设计引物，通过rt-pcr方法扩增，所得到的经典疫苗毒株(cv777)orf3基因片段比经典野毒少49bp，从而可鉴别出pedv经典野毒与cv777疫苗株(李长龙等2014)。目前猪场流行的pedv的毒株主要为变异毒株，而来源于变异毒株的疫苗比经典毒株疫苗能提供更好的保护力，因此变异毒株和变异弱毒疫苗的鉴别在免疫与监测上至关重要。yn144为致弱的变异毒株，具有较好的安全性和临床应用效果(刘洋，2016)，是比较理想的弱毒疫苗候选株，

因此，建立区分变异弱毒株yn144诊断方法，对于yn144推广使用和ped防控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144的酶切位点及其方法。本研究通过比对分析传代致弱株yn144与强毒株yn15以及其他变异毒株的序列，找到yn144在s1基因存在“aacaggt”6个碱基的连续缺失，缺失两端可形成afliii酶切位点(acacgt)。因此本研究结合rt-pcr和酶切方法，建立鉴别变异弱毒yn144的方法，为新疫苗推广和使用提供了鉴别诊断的技术，从而更好指导疫苗使用，防控ped。

为实现上述目的，本发明设计了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144的酶切位点，所述酶切位点为acacgt。

本发明还提供了一种获得含有上述酶切位点的序列片段的引物对，所述引物对为：

v-f：5’-tcatccattagtgatgttgtgttagg-3’，如seqidno.1所示；

v-r：5’-cgacaacratrttttttccatcctg-3’，如seqidno.1所示；其中，

合并碱基r为a/g，合并碱基y为c/t。

本发明还提供了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144的方法，包括以下步骤：

1)获取待测目标样品；

2)提取待测目标样品的rna；

3)rna反转录成cdna；

4)以所获得的cdna为模板加入引物对进行rt-pcr扩增，扩增得到pcr产物后用琼脂糖凝胶电泳法分析，确定是否为猪流行性腹泻病毒变异毒株；

5)当待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株时，使用afliii酶对pcr产物进行酶切，确定变异毒株是否为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144。

进一步地，所述步骤4)中，引物对为

v-f：5’-tcatccattagtgatgttgtgttagg-3’，

v-r：5’-cgacaacratrttttttccatcctg-3’；其中，

合并碱基r为a/g，合并碱基y为c/t。

再进一步地，所述步骤4)中，

若电泳观测到大小为720bp，即确定待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株；

否之，即确定待测目标样品不是猪流行性腹泻病毒变异毒株。

再进一步地，所述步骤5)中，若pcr产物被酶切为523bp和197bp两条片段时，确定变异毒株为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144；

否之，确定变异毒株不为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144。

再进一步地，所述步骤4)中，rt-pcr反应体系为

反应体系：2×estaqmastermix12.5μl，上游引物v-f1μl(10μm)，下游引物v-r1μl(10μm)，去离子水6.5μl，dna模板4μl；

rt-pcr反应条件为94℃5min；95℃35s，58.4℃35s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

再进一步地，所述步骤5)中，

酶切反应体系：25μl酶切体系为：0.5μl(5u)afliii酶，0.5μgdna，2.5μl10×nebuffer；

酶切反应条件：酶切管置于37℃水浴锅中反应1～2h。

本发明的有益效果：

(1)本发明针对我国目前流行的猪流行性腹泻病毒变异毒株易变基因s序列特点设计了特异性的引物，建立了可扩增变异毒株的rt-pcr方法，该方法敏感性好，对pedv变异毒株的检出下限为1×10^0.7tcid50/100μl，对构建的标准质粒可检测到1.27×10³copies/μl。该方法可特异性扩增变异毒株得到720bp目的条带，与猪的其他重要病原无交叉反应，该方法可以用于临床检测pedv变异毒株，为临床上采取针对性的措施，预防和控制ped提供参考。

(2)本发明弥补现有猪流行性腹泻病毒学鉴定和诊断的技术不足，现有的检测方法不能区分变异弱毒株yn144。本发明建立的酶切方法，可达到同时快速鉴别变异毒株和变异弱毒株yn144的目的。本发明为变异弱毒yn144提供了可鉴别的诊断技术，为其作为变异弱毒疫苗使用和推广奠定了基础。

附图说明

图1：猪流行性腹泻病毒变异毒株s1基因序列的pcr扩增产物图，m：dl2000dnamarker，1：yn15，2：yn144，3：阴性对照；

图2：鉴别变异毒株rt-pcr方法的敏感性试验，m：dl2000dnamarker，1～8：1×10^4.7～1×10^-2.3tcid50/100μl；

图3：含s1基因的重组质粒dna敏感性试验，m：dl2000dnamarker，1～9：1.27×10⁹～1.27×10¹copies/μl；10：阴性对照；

图4：特异性试验，m：dl2000dnamarker，1：prrsv，2：csfv，3：tgev，4：rva，5：prv，6：pcv2，7：阳性对照，8:阴性对照；

图5：酶切图，m：dl2000dnamarker，1：未酶切的yn144，2：酶切后的yn15，3：酶切后的yn144阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1：rt-pcr引物对设计

根据genbank公布的猪流行性腹泻病毒变异毒株yn144和其他参考变异毒株s基因组序列，用dnastar软件进行序列比对找出s基因序列基因差异，设计1对引物，引物序列如表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，配制浓度为10μm。

表1rt-pcr引物

*引物位置参考yn144(kt021232.1)基因，合并碱基r:ag，y:ct.

实施例2：rt-pcr方法的建立

一、病毒rna提取

参照bioflux公司simplyp总rna提取试剂盒说明书操作，提取病毒基因组。具体步骤如下：取100μl病毒液或处理的样品上清液加到1.5ml无rna酶的离心管中，加入100μl的solutionr1，振荡混合30s，室温静置1min；加入solutionr2600μl，充分颠倒混匀，室温静置5min；套上收集管，将上清液吸入到spincolumn中，请勿吸起沉淀，4℃，12000r/min，离心30s，弃去收集管内的液体；向spincolumn中加入600μlwashbuffer，4℃，12000r/min，离心30s，弃去收集管内的液体；重复步骤4；将spincolumn重新放入收集管内，4℃，10000r/min，离心1min；将spincolumn转移到一个新的无rna酶的1.5ml离心管中，在膜的中央加入25μldepc水，室温静置1min，4℃，12000r/min，离心30s，获得总rna。

二、rna反转录合成cdna

按照反转录试剂盒说明书操作将rna反转录得到cdna。10μl反转录体系为2μlrtmastermix(rr036a)和8μlrna，反转录程序为37℃15min；85℃5s；4℃1min。反转录的产物cdna放在-20℃保存。

三、rt-pcr扩增

以pedv变异株yn15和yn144的cdna为模板，v-f和v-r为引物，进行rt-pcr扩增。25μl单重rt-pcr扩增体系为2×estaqmastermix12.5μl，v-f和v-r引物均为1μl(10μm)，去离子水6.5μl，dna模板4μl反应程序为:95℃5min；95℃35s，58.4℃35s，72℃30s(30个循环)；72℃10min。将pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察。结果如图1，变异毒株可扩增到分子量为720bp的目的条带。pcr产物分别克隆至pmd18-t载体，挑选阳性重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

实施例3：敏感性试验

分别采用稀释质粒和病毒两种方法分析该rt-pcr敏感性。

(1)梯度稀释病毒：测定变异毒株yn144的tcid50，用细胞培养基dmem连续10倍梯度稀释病毒，分别提取不同稀释度的病毒rna,反转录成cdna后作为模板进行rt-pcr，确定该方法能检测到最低的病毒量，结果敏感度可达到10^0.7tcid50/100μl，结果如图2。

(2)梯度稀释质粒：取变异弱毒株yn144重组质粒，连续10倍稀释后进行rt-pcr，确定该方法的敏感性，结果敏感度可达到1.27×10³copies/μl，结果如图3。

实施例4：特异性试验

用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、猪传染性胃肠炎(tgev)、猪轮状病毒(rv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)，观察是否能扩增出特异的条带。

以prrsv、csfv、tgev、rva、prv、pcv2的dna(或反转录cdna)为模板，进行rt-pcr方法进行扩增，同时设置阴阳性对照，结果如图4所示，仅pedv可扩增出目的片段，而其他病毒均未扩增出条带，表明该rt-pcr方法特异性高。

实施例5：酶切方法的建立

用v-f/r引物扩增yn144和yn15所得到的pcr产物作为酶切模板，按照说明书操作。25μl酶切体系为：0.5μlafliii酶，0.5μgdna，2.5μl10×nebuffer。将酶切管置于37℃水浴锅中作用1～2h，酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。yn144和yn15的扩增产物加入aflⅲ酶，同时设置阴性对照以及未加aflⅲ酶的yn144扩增产物作为对照。v-f/r引物扩增yn144的pcr产物经aflⅲ酶切后，720bp的形成523bp和197bp的两条带，而yn15仍是720bp的条带，由此可区分yn144，如图5。

实施例6：重复性试验

取病毒样品yn15、yn144，重复检测三次，rt-pcr扩增结果显示仅有yn15、yn144可扩增出720bp大小的条带，分别加入aflⅲ酶，酶切鉴定结果显示仅yn144可酶切形成523bp和197bp大小的两条带。三次结果一致，表明rt-pcr方法结合酶切方法可特异性鉴别yn144。

实施例7：临床样品的检测

用本发明建立的方法检测92份腹泻样品，设立阴性和阳性对照，可检测到pedv变异株39份，阳性率为42.39％(39/92)，39份pedv变异株扩增产物均不能被aflⅲ酶切，阴阳性对照成立。说明pedv变异毒株是主要的流行毒株，但临床腹泻样品中未见yn144引起的感染。结果表明，利用本发明的鉴别方法可以准确鉴定yn144。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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5.sunr,cair,cheny,liangp,chend,songc.outbreakofporcineepidemicdiarrheainsucklingpiglets,china.emerginfectdis,2012,18:161-163；6.chen，f.；zhu，y.；wu，m.；ku，x.；ye，s.；li，z.；guo，x.；he，q.comparativegenomicanalysisofclassicalandvariantvirulentparental/attenuatedstrainsofporcineepidemicdiarrheavirus.viruses2015，7，5525-553。

序列表

<110>华中农业大学

<120>鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株yn144的酶切位点及其方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工合成序列(syntheticsequence)

<400>1

tcatccattagtgatgttgtgttagg26

<210>2

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