一种等离子体和超声改性的羊肚菌多糖的制备方法与应用与流程

本发明属于多糖制备领域，具体涉及一种等离子体和超声改性的羊肚菌多糖的制备方法与应用。

背景技术：

羊肚菌又名羊肚菜，隶属于子囊菌亚门盘菌纲盘菌目羊肚菌科羊肚菌属，分布在世界多个国家，在我国的陕西、甘肃和青海等20多个省市有广泛的分布。羊肚菌是一种珍贵的食药用真菌，其药用价值在我国《广谱菌》和《本草纲目》中有详细的记载。此外其营养丰富，味美可口，深受国内外市场的欢迎。传统医学认为，羊肚菌性平，味甘，能益肠胃，能化痰理气。随着人们对多糖生物活性和特殊药用功能认识的进一步加深,意识到多糖可能是羊肚菌生物活性和特殊药用功能的主要作用因子之一，研究表明羊肚菌多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。

多糖的性质改造逐渐成为近年来的研究热点。化学改性是一种常用的多糖改性方式。但是多糖的化学改性常常会用到一些有毒性的有机试剂，比如多糖的硫酸酯改性、磷酸酯改性和乙酰化改性，从而限制了改性多糖在食品中的应用。并且化学改性后的多糖性质不稳定，从而影响羊肚菌多糖在食品中抗菌效果的发挥。相比较化学改性，物理改性因其操作简单、经济方便和污染小等优点受到研究者的广泛关注。利用超声波对物质进行性质改造已经在环境、化工和食品受到了高度的关注。超声波降解大分子物质主要有两种途径：一是机械性断键作用；二是自由基的氧化还原反应。机械性断键作用是超声作用使物质的质点产生激烈而快速变化，分子在介质中产生周期性压缩和扩张，导致降解。自由基的氧化还原反应主要是由于超声波作用使液体产生空化效应，形成的空穴气泡太大而坍塌时产生局部高压和较大的温差，溶液裂解产生自由基。已经有研究报道了超声降解多糖导致其分子量降低，并改善了多糖的功能活性。有研究学者报道了无花果多糖经超声改性后，改变了其分子结构，化学键被断裂，从而降解为分子量较小的多糖，同时提高了无花果多糖的抗氧化能力。

等离子体由于高能量的优势，也经常被用来改变物质分子结构和功能特性。等离子体是指不断从外部对物质施加能量而使其电离成阴、阳电荷离子的物质状态。等离子体在自然界中广泛存在，被称之为第四态。通过对气体施加电场，使荷电粒子加速。由于粒子较重，被加速的都是电子，通过电子与较重粒子的碰撞而引起电离，最终可以人工形成等离子体。等离子体中的离子具有较高的能量，一般都高于聚合物中的化学键能，通过电场加速后等离子体完全有足够的能量引起聚合物表面的各种化学键断裂和重新组合，从而对化合物的性质进行改造。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，如：化学改性后有毒物质的残留和化学改性后多糖的性质不稳定等，本发明提供了一种等离子体和超声改性的羊肚菌多糖的制备方法。

具体的，本发明采取的技术方案是：

(1)制备羊肚菌多糖：

在羊肚菌发酵液中加入无水乙醇，进行第一次醇沉，第一次离心，将得到的沉淀物加入蒸馏水复溶，得到混合液；加入三氯乙酸，静置，第二次离心，收集上清液；加入无水乙醇进行第二次醇沉，第三次离心，向得到的沉淀物中加入蒸馏水复溶，将得到的羊肚菌多糖粗液进行透析，冷冻干燥，得到羊肚菌多糖；

(2)超声改性羊肚菌多糖：

将羊肚菌多糖溶于蒸馏水中，制成羊肚菌多糖溶液，然后进行超声处理，浓缩，冷冻干燥，得到超声改性羊肚菌多糖；

(3)等离子体改性羊肚菌多糖：

将超声改性的羊肚菌多糖，放于等离子体处理仪中，进行处理，得到等离子体处理的超声波改性羊肚菌多糖。

步骤(1)中，所述羊肚菌发酵液与无水乙醇的体积比为1:4；所述混合液与三氯乙酸的体积比为100:5；所述静置为静置过夜；所述第一次醇沉、第二次醇沉的温度均为4℃，时间均为12h；所述蒸馏水的温度均为65℃；所述透析时，使用的透析袋的最大截留分子量为6000da，蒸馏水透析24h，流水透析48h；

步骤(2)中，所述羊肚菌多糖溶液的质量体积浓度为1％；所述超声处理时，超声功率为400-500w，间歇比为5s/2s，超声时间为30分钟；

步骤(3)中，所述处理的功率为100-200w，所述处理的时间为3-5分钟。

本发明还提供了一种等离子体和超声改性的羊肚菌多糖的应用，所述等离子体和超声改性的羊肚菌多糖用于食品抗菌保鲜。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：

(1)本发明采用超声和等离子体技术对羊肚菌多糖进行性质改造，与传统的化学改性方式相比，如硫酸酯改性和磷酸酯改性等，克服了改性后有毒化学试剂残留的风险。本发明对羊肚菌多糖进行性质改造，旨在改善羊肚菌多糖的功能特性和生物活性，提高其抗菌能力，拓展其在食品行业中的应用。

(2)本发明利用超声和等离子体高能量的优势，改造羊肚菌多糖并提高其抗菌效果，避免了化学改性后多糖性质不稳定的弊端。

(3)利用等离子体和超声对羊肚菌多糖进行改性后，其抗菌效果提升显著，如图3所示，沙门氏菌经10mg/ml等离子体处理超声改性羊肚菌多糖处理后，其数量下降了1.54logcfu/ml。

附图说明

图1为本发明的超声改性的羊肚菌多糖在pbs中的杀菌效果；

图2为本发明的等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖在pbs中的抗菌结果；

图3为本发明的等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖在猪肉肉汤中的抗菌结果。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1：

(1)制备羊肚菌多糖：

向羊肚菌发酵液加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后，置于4℃冰箱中放置12h，进行第一次醇沉，将混合液于6000rpm，4℃的条件下第一次离心10分钟，收集沉淀物，将沉淀物复溶于65℃的蒸馏水中，得到混合液，并加入混合液体积5％的三氯乙酸，静置过夜；将加入三氯乙酸的混合液在6000rpm，4℃的条件下第二次离心10分钟，收集上清液，加入四倍体积乙醇，进行第二次醇沉，于6000rpm，4℃的条件下第三次离心10分钟，收集沉淀物，将沉淀物复溶于65℃的蒸馏水中复溶，得到羊肚菌多糖粗液；待羊肚菌多糖粗液冷却之后，加入透析袋(最大截留分子量为6000da)中，蒸馏水透析24h，流水透析48h；透析结束后将透析液置于真空冷冻干燥机，-80℃冻干24h，即可得到羊肚菌多糖。

(2)超声改性羊肚菌多糖：

将1％(w:v)的羊肚菌多糖溶于50ml的蒸馏水中，并将得到的羊肚菌多糖溶液放于超声波处理仪中处理30分钟，超声功率为400w，间歇比为5s/2s，超声结束后将多糖溶液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度为70℃；将得到的浓缩液置于冷冻干燥机中-80℃，20pa冻干24h，得到超声改性羊肚菌多糖。超声改性羊肚菌多糖的得率为57.1％。

(3)等离子体改性羊肚菌多糖：

将超声改性的羊肚菌多糖，放于等离子体处理仪中，用100w的冷等离子体处理5分钟，得到等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖。

实施例2：

(1)制备羊肚菌多糖：

羊肚菌多糖的制备方法同实施例1。

(2)超声改性羊肚菌多糖：

将1％(w:v)的羊肚菌多糖溶于50ml的蒸馏水中，并将得到的羊肚菌多糖溶液放于超声波处理仪中处理30分钟，超声功率为500w，间歇比为5s/2s，超声结束后将多糖溶液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度为70℃；将得到的浓缩液置于冷冻干燥机中-80℃，20pa冻干24h，得到超声改性羊肚菌多糖。超声改性羊肚菌多糖的得率为62.5％。

(3)等离子体改性羊肚菌多糖：

将超声改性的羊肚菌多糖，放于等离子体处理仪中，用200w的冷等离子体处理3分钟，得到等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖。

实施例3：

(1)制备羊肚菌多糖：

羊肚菌多糖的制备方法同实施例1。

(2)超声改性羊肚菌多糖：

将1％(w:v)的羊肚菌多糖溶于50ml的蒸馏水中，并将得到的羊肚菌多糖溶液放于超声波处理仪中处理30分钟，超声功率为450w，间歇比为5s/2s，超声结束后将多糖溶液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度为70℃；将得到的浓缩液置于冷冻干燥机中-80℃，20pa冻干24h，得到超声改性羊肚菌多糖。超声改性羊肚菌多糖的得率为65.3％。

(3)等离子体改性羊肚菌多糖：

将超声改性的羊肚菌多糖，放于等离子体处理仪中，用150w的冷等离子体处理4分钟，得到等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖。

本发明对羊肚菌多糖进行超声改性时，对于羊肚菌多糖溶液的质量体积浓度的选择进行了大量创造性的实验筛选，通过实验发现，最终选择羊肚菌多糖溶液的质量体积浓度为1％，是因为此浓度下的羊肚菌多糖溶液经过超声处理后，粒径和多分散系数较小，粒径分布较为集中，粒径较小有利于抗菌多糖更好的发挥抗菌效果。

实施例4超声改性的羊肚菌多糖的性能表征

(1)实验材料

(2)实验方法

a粒径、多分散系数(pdi)和zeta电势的测定

①将100mg超声改性的羊肚菌多糖溶于10ml去离子水中，制备母液。

②取1ml母液加入19ml的去离子水中，稀释后的母液采用激光粒度仪(nanozs90)测定其粒径和多分散系数(pdi)。zeta电势采用电位仪(nanozs90zeta)进行测定。

b抗菌效果评价

①沙门氏菌接种于营养肉汤液体培养基中，37℃振荡(150rpm)培养24h得到对数生长期的沙门氏菌。

②将对数生长期的沙门氏菌加入到无菌磷酸缓冲液中，梯度稀释至10³-10⁴cfu/ml的浓度范围内，然后加入超声处理的羊肚菌多糖(10mg/ml)和未处理的羊肚菌多糖(10mg/ml)。

③将经过不同处理的沙门氏菌37℃条件下培养3天，每隔24h测定沙门氏菌的残存菌数。利用平板计数法测定其残存菌数。不做任何处理的沙门氏菌菌悬液作为对照(control)。

(3)实验结果

a粒径、pdi和zeta电势

表1羊肚菌多糖和超声改性的羊肚菌多糖的参数表征

由表1可以看出，超声改性后羊肚菌多糖的粒径变小，粒径分布更加集中，zeta电势变化不大。说明超声断裂了多糖的分子链，使其分子粒径变小，同时超声避免了一些大粒径分子的存在，使得粒径分布更集中。羊肚菌多糖的抗菌效果与其粒径关系密切，粒径越小，粒径分布越集中，越有利于羊肚菌多糖与细菌的充分接触，从而提高羊肚菌多糖的抗菌效果。表1的实验结果说明羊肚菌多糖经超声改性后，粒径变小，粒径分布更集中，从而更有利于多糖抗菌效果的发挥。

b在磷酸缓冲液(pbs)中的抗菌结果

超声改性羊肚菌多糖的抗菌能力如图1所示，由图中可以看出，对照组中沙门氏菌的数量基本保持不变。与对照组相比，沙门氏菌经羊肚菌多糖处理后，其数量下降了1.3logcfu/ml，然而经超声改性羊肚菌多糖处理后，沙门氏菌的数量下降了1.93logcfu/ml，说明超声改性羊肚菌多糖的抗菌效果要优于未改性的羊肚菌多糖，表明超声处理提高了羊肚菌多糖的抗菌效果。

实施例5等离子处理的超声改性羊肚菌多糖的性能表征

(1)实验材料

(2)实验方法

a在磷酸缓冲液(pbs)中的抗菌效果评价

①沙门氏菌接种于营养肉汤液体培养基中，37℃振荡(150rpm)培养24h得到对数生长期的沙门氏菌。

②将对数生长期的沙门氏菌加入到无菌磷酸缓冲液中，梯度稀释至10⁴-10⁵cfu/ml的浓度范围内，然后加入等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖(10mg/ml)和超声改性羊肚菌多糖(10mg/ml)。

③将经过不同处理的沙门氏菌37℃条件下培养3天，每隔24h测定沙门氏菌的残存菌数。利用平板计数法测定其残存菌数。加入未改性的羊肚菌多糖作为对照(control)，不做任何处理的沙门氏菌菌悬液作为空白。

b在猪肉肉汤中的抗菌效果评价

①称取一定量刚购买的新鲜猪肉于均质袋中，加两倍体积的蒸馏水，使用均质机进行均质破碎，再使用四层纱布进行过滤，将滤液分装与蓝色盖试剂瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。

②向各试剂瓶中加入一定量生长至对数期的沙门氏菌，使得每个试剂瓶中沙门氏菌浓度大致为10^4-5cfu/ml。

③将一定量的等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖和超声改性羊肚菌多糖分别加入到上述试剂瓶中，使其浓度为10mg/ml，添加未改性羊肚菌多糖作为对照，不做任何处理的沙门氏菌作为空白。

④将上述不同的试剂瓶放入37℃的恒温培养箱中培养3天，每隔24h计算其残存菌数。残存菌落用平板计数法计算。

(3)实验结果

a在pbs中的抗菌结果

由图2可以看出，沙门氏菌经羊肚菌多糖和超声改性羊肚菌多糖处理后，其数量分别下降了1.28logcfu/ml和1.86logcfu/ml。然而沙门氏菌经等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖处理后，其数量下降了2.24logcfu/ml。这说明等离子处理的超声改性羊肚菌多糖的抗菌效果最佳，证明等离子体改善了羊肚菌多糖的性质，提升了羊肚菌多糖的抗菌效果。

b在猪肉肉汤中的抗菌效果

猪肉肉汤中含有丰富的营养物质，可以促进沙门氏菌的增长繁殖。由图3可以看出，10mg/ml的羊肚菌多糖在猪肉肉汤中抗菌效果微弱，猪肉肉汤中的沙门氏菌经超声改性羊肚菌多糖和等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖处理后，其数量分别下降了1.07logcfu/ml和1.54logcfu/ml。说明等离子体处理的超声改性羊肚菌多糖在猪肉肉汤中依然发挥最好的抗菌效果，证明等离子体可以提高羊肚菌多糖的抗菌能力。

因此，本发明制备的等离子体和超声改性的羊肚菌多糖可用于蔬菜水果、肉类食品的抗菌保鲜。