一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法与流程

本发明属于水产养殖应用
技术领域：
，具体涉及一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法。
背景技术：
由于养殖密度过大、环境恶化和其它多种原因，导致近年来水产养殖细菌性疾病频发，造成巨大的经济损失。由于养殖者科学知识的缺乏和市场经济利益的驱使，滥用渔药特别是抗生素的现象普遍存在，导致水产致病菌的耐药性、水产品药残、环境污染及生态破坏等问题日益加剧。要从源头上解决抗生素滥用问题，关键是在治疗前进行药敏试验，从而在正确诊断的基础上对症下药。国际上常用的药敏试验方法是k-b纸片法，采用这种方法进行药敏试验要求将致病菌分离纯化，需要花一周左右的时间，而且必须在专业的微生物实验室条件下，由具备专业知识的人员完成，因此不适合在广大养殖者中推广。中国专利局于2007年2月28日公开的，授权公告号为“cn2874498y”的“药敏检测盒”，它用于动物疫病诊断检测，包括带检测孔１的检测盒２上盖有检测盒盖３，在检测盒２底面上刻有测量刻度４。它通过各种药物，直接按照试验目的加入检测孔中即可进行药敏试验，这种检测盒由于病毒、细菌没有培养，所获取的病毒、细菌有限，根本无法进行有效的检测。基于上述问题，本发明提供一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法，其操作简便，价格适中，适用于水产基层实现高效、精准的选药工作（防治淡水/海水细菌性疾病中）。技术方案：本发明的一方面提供一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法，包括以下步骤，a、准备：将手、剪刀和解剖容器清洗干净，并用75%医用酒精、水煮或火烧等形式对剪刀和解剖容器进行消毒。b、取样：选病症典型的濒死鱼虾等个体，清水洗净解剖部位；用剪刀解剖，观察病变，再次消毒剪刀后，剪取约黄豆大小的典型病灶直接放入装有增菌培养液的离心管，并旋紧离心管管盖，若检测水样，则直接取5-10滴水样滴入装有增菌培养液的离心管内，并旋紧离心管管盖。c、液体培养：用力振荡离心管数次后放置，且应避免阳光直射，之后每隔半个小时至1个小时用力振荡离心管数次，直到液体混浊。d、涂布：将离心管内液体倒入装有固体培养基的培养皿中心部位，应避免倒入离心管底的沉淀物，然后用涂布棒轻轻地在固体培养基上将液体涂抹均匀，并应避免将固体培养基表面划破。e、放置药敏贮药圈：将培养皿敞盖平放晾干，至表面基本干燥，然后取出药敏贮药圈，将药敏纸片朝下放入培养皿中，轻压，使纸片与培养基表面充分接触，盖上培养皿的盖子后倒扣，静置于温度在20度以上的地方8-15小时。f、结果判定：1）、出现透明区的药敏纸片中的药物均可作为备选药物，透明区较大的药敏纸片中的药物可作为优选药物，综合考虑本类病害的常用药种类、用药史、药价、给药方式、进出口规定的因素，选出最合适的抗生素；2）、如未长出细菌或细菌呈斑点状散布，则表明病害可能不是由细菌感染引起；3）、如细菌已布满整个培养盒，但未出现透明区，则表明在药敏贮药圈上的所有药敏纸片中的药物在标准使用剂量时对致病菌无效，建议其他产品重新进行选药。本技术方案的，药敏试剂盒包括装有增菌培养液的离心管、装有固体培养基的培养皿以及药敏贮药圈，其中所述药敏贮药圈，包括药敏贮药圈本体，及与药敏贮药圈本体相配合使用的辅助药敏贮药圈本体，及两端分别与药敏贮药圈本体、辅助药敏贮药圈本体连接的五个条形连接板，及均匀设置在药敏贮药圈本体上的第一锥形支撑柱、第二锥形支撑柱、第三锥形支撑柱，及设置在辅助药敏贮药圈本体上且与第一锥形支撑柱、第二锥形支撑柱、第三锥形支撑柱相配合使用的第四锥形支撑柱，其中，药敏贮药圈本体、条形连接板、辅助药敏贮药圈本体上分别设置有1-16的数字标号。与现有技术相比，本发明的一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法的有益效果在于：1、通过对发病个体和水样进行药敏检测，在检测后观察药敏贮药圈，出现透明区的药敏纸片中的药物均可作为备选药物，透明区较大的药敏纸片中的药物可作为优选药物，综合考虑本类病害的常用药种类、用药史、药价、给药方式、进出口规定的因素，选出最合适的抗生素，在正确诊断的基础上对症下药，避免了滥用渔药，特别是滥用抗生素的现象，防止水产品药残；2、最快仅需要12个小时即可完成，当天即可进行选药和相应的预防与治疗，操作简便，成本低，适用于水产养殖基层作为防治细菌性疾病的选药工作，并且对保护水产品养殖的生态环境起到积极作用。附图说明图1是本发明一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法中药敏试剂盒的药敏贮药圈的俯视结构示意图；图2是本发明一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法中药敏试剂盒的药敏贮药圈的立式侧结构示意图；图3是本发明一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法中药敏试剂盒的药敏贮药圈的立式结构示意图；图4是本发明一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法中药敏试剂盒的药敏贮药圈的主视结构示意图；其中，图中标号如下：1-药敏贮药圈本体、2-条形连接板、3-第一锥形支撑柱、4-第四锥形支撑柱、5-第二锥形支撑柱、6-第三锥形支撑柱、7-辅助药敏贮药圈本体。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。本发明的一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法，包括以下步骤，a、准备：将手、剪刀和解剖容器清洗干净，并用75%医用酒精、水煮或火烧等形式对剪刀和解剖容器进行消毒。b、取样：选病症典型的濒死鱼虾等个体，清水洗净解剖部位；用剪刀解剖，观察病变，再次消毒剪刀后，剪取约黄豆大小的典型病灶直接放入装有增菌培养液的离心管，并旋紧离心管管盖，若检测水样，则直接取5-10滴水样滴入装有增菌培养液的离心管内，并旋紧离心管管盖。c、液体培养：用力振荡离心管数次后放置，且应避免阳光直射，之后每隔半个小时至1个小时用力振荡离心管数次，直到液体混浊。d、涂布：将离心管内液体倒入装有固体培养基的培养皿中心部位，应避免倒入离心管底的沉淀物，然后用涂布棒轻轻地在固体培养基上将液体涂抹均匀，并应避免将固体培养基表面划破。e、放置药敏贮药圈：将培养皿敞盖平放晾干，至表面基本干燥，然后取出药敏贮药圈，将药敏纸片朝下放入培养皿中，轻压，使纸片与培养基表面充分接触，盖上培养皿的盖子后倒扣，静置于温度在20度以上的地方8-15小时。f、结果判定：1）、出现透明区的药敏纸片中的药物均可作为备选药物，透明区较大的药敏纸片中的药物可作为优选药物，综合考虑本类病害的常用药种类、用药史、药价、给药方式、进出口规定的因素，选出最合适的抗生素；2）、如未长出细菌或细菌呈斑点状散布，则表明病害可能不是由细菌感染引起；3）、如细菌已布满整个培养盒，但未出现透明区，则表明在药敏贮药圈上的所有药敏纸片中的药物在标准使用剂量时对致病菌无效，建议其他产品重新进行选药。本发明的一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法的药敏试剂盒包括装有增菌培养液的离心管、装有固体培养基的培养皿以及药敏贮药圈，其中如图1、图2、图3、图4所示的药敏贮药圈，包括药敏贮药圈本体1，及与药敏贮药圈本体1相配合使用的辅助药敏贮药圈本体7，及两端分别与药敏贮药圈本体1、辅助药敏贮药圈本体7连接的五个条形连接板2，及均匀设置在药敏贮药圈本体1上的第一锥形支撑柱3、第二锥形支撑柱5、第三锥形支撑柱6，及设置在辅助药敏贮药圈本体7上且与第一锥形支撑柱3、第二锥形支撑柱5、第三锥形支撑柱6相配合使用的第四锥形支撑柱4，其中，药敏贮药圈本体1、条形连接板2、辅助药敏贮药圈本体7上分别设置有1-16的数字标号。其中，所述药敏贮药圈的制备，包括以下步骤，a、药敏贮药圈的制造，整体结构选用质地坚硬，且耐高温的聚丙烯塑料原料制造而成；b、将药敏贮药圈制作前装入灭菌不锈钢桶里，放入自动高压灭菌锅内，高压灭菌10-20分钟；c、制作1-16种药物的药敏纸片，将药敏纸片粘贴于贮药圈的正面，然后装入真空包装袋抽成真空。本发明的一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法中所述装有增菌培养液的离心管的制备，包括以下步骤，a、将重量配比为5-15份的蛋白胨、3-8份的酵母提取物、5-15份的氯化钠倒入已装有600-1000份蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀；b、往烧杯中倒入盐酸或氢氧化钠，将烧杯中的溶液ph值调整到7.3±0.1，配制成增菌培养液；c、将烧杯中的溶液倒入可调式分液器，通过可调式分液器将增菌培养液注入离心管内，将盖子旋上但不旋紧，留半圈至一圈；d、将装有增菌培养液的离心管放在试管架上，再放入自动高压灭菌锅内，高压灭菌10-20分钟；e、灭菌结束后将离心管取出，然后旋紧离心管的管盖，放入真空包装袋内抽真空。本发明的一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法中所述装有固体培养基的培养皿的制备，包括以下步骤，a、将重量配比为5-15份的蛋白胨、3-8份的酵母提取物、5-15份的氯化钠、10-15份的琼脂倒入已装有600-1000份蒸馏水的三角烧瓶中，搅拌均匀；b、往三角烧瓶中倒入盐酸或氢氧化钠，将烧杯中的溶液ph值调整到7.3±0.1，制成培养液；c、将三角烧瓶放入自动高压灭菌锅内，高压灭菌10-20分钟；d、在超净台内对自动分液器的储液漏斗消毒，然后将冷却到55-65度的培养液倒入自动分液器的储液漏斗内，分装到培养皿中；e、将培养皿平放于超净台上，并打开超净台紫外灯，使培养液冷却凝固成固体培养基；f、将培养皿的盖子盖上，然后装入真空包装袋抽成真空。其中，所述步骤b中加入海水晶或者浓缩海水后，调整盐度到24-28之间，ph6.8-7.2之间，配制成增菌培养液；在装有固体培养基的培养皿的制备的步骤b中加入海水晶或者浓缩海水后，调整盐度到24-28之间，ph6.8-7.2之间，配制成培养液。本发明是一种应用于水产养殖药敏试剂盒的药敏检测方法的药敏试剂盒又分为淡水型和海水型，其中淡水型的药敏试剂盒用于对淡水养殖中的药敏检测，海水型的药敏试剂盒用于对海水养殖中的药敏检测。淡水型的药敏试剂盒的制备方法；1、装有增菌培养液的离心管的制备：a、将重量配比为5-15份的蛋白胨、3-8份的酵母提取物、5-15份的氯化钠倒入已装有600-1000份蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀。b、往烧杯中倒入盐酸或氢氧化钠，将烧杯中的溶液ph值调整到7.3±0.1，配制成增菌培养液。c、将烧杯中的溶液倒入可调式分液器，通过可调式分液器将增菌培养液注入离心管内，将盖子旋上但不旋紧，留半圈至一圈。d、将装有增菌培养液的离心管放在试管架上，再放入自动高压灭菌锅内，高压灭菌10-20分钟。e、灭菌结束后将离心管取出，然后旋紧离心管的管盖，放入真包装袋内抽真空。2、装有固体培养基的的培养皿的制备：a、将重量配比为5-15份的蛋白胨、3-8份的酵母提取物、5-15份的氯化钠、10-15份的琼脂倒入已装有600-1000份蒸馏水的三角烧瓶中，搅拌均匀。b、往三角烧瓶中倒入盐酸或氢氧化钠，将烧杯中的溶液ph值调整到7.3±0.1，制成培养液。c、将三角烧瓶放入自动高压灭菌锅内，高压灭菌10-20分钟。d、在超净台内对自动分液器的储液漏斗消毒，然后将冷却到55-65度的培养液倒入自动分液器的储液漏斗内，分装到培养皿中。其中对自动分液器的储液漏斗的消毒可以通过在超净台内将2.5%的次氯酸钠消毒剂倒入已清洗干净的自动分液器的储液漏斗内，连续分液10次。再倒入冷却到70℃左右时培养液，连续分液4次。e、将培养皿平放于超净台上，并打到超净台紫外灯，使培养液冷却凝固成固体培养基。f、将培养皿的盖子盖上，然后装入真空包装袋抽成真空。3、药敏贮药圈的制备：a、药敏贮药圈的制造，选用质地坚硬，耐高温的聚丙烯塑料原料制造而成；b、将药敏贮药圈制作前装入灭菌不锈钢桶里，放入自动高压灭菌锅内，高压灭菌10-20分钟；c、制作1-16种药物的药敏纸片，将药敏纸片粘贴于药敏贮药圈的正面，然后装入真空包装袋抽成真空。根据淡水养殖出现的细菌性疾病，通常可以选用阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、复方新诺明smz、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、土霉素、盐酸沙拉沙星、卡那霉素、乳酸诺氟沙星、多粘菌素b、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、林可霉素共16种药物的药敏纸片。海水型的药敏试剂盒的制备方法；海水型的药敏试剂盒在制备时与淡水型药敏试剂盒的为在装有增菌培养液的离心管的制备的步骤b中加入海水晶或者浓缩海水后，调整盐度到24-28之间，ph6.8-7.2之间，配制成增菌培养液，以适于对海水养殖中产生的细菌进行培养，并且离心管在封装时最好充入一定量二氧化碳气体。根据海水养殖出现的细菌性疾病，通常可以选用阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、复方新诺明smz、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、土霉素、盐酸沙拉沙星、卡那霉素、乳酸诺氟沙星、多粘菌素b、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、林可霉素共16种药物的药敏纸片。实施例：1）称取蛋白胨10g酵母提取物5g,氯化钠10g，倒入已装有800ml左右蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀；用盐酸或氢氧化钠调整ph到7.3±0.1，再用蒸馏水定容至1000ml，配制成增菌培养液；将以上增菌培养液装入可调式分液器中，往每个离心管里加入1.5ml增菌培养液，将盖子轻轻旋上但不旋紧，约留半圈或一圈；最后将装有增菌培养液的离心管分别放入不锈钢的试管架上，再放入自动高压灭菌锅内，0.102mpa(121℃)，高压灭菌15分钟；灭菌结束后将离心管取出，旋紧离心管管盖，放入真空包装袋抽真空。每个真空包装带装1支离心管。2）称取蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g，琼脂12g，倒入已装有800ml左右蒸馏水的三角烧瓶中，搅拌均匀；用盐酸或氢氧化钠调整ph到7.3±0.1，再用蒸馏水定容至1000ml，配制成培养液；将装有培养液的三角烧瓶放入自动高压灭菌锅内，0.102mpa(121℃)，高压灭菌15分钟，灭菌结束后，在超净台内将250ml含量为2.5%的次氯酸钠消毒剂倒入已清洗干净的自动分液器的储液漏斗内，调整分液量程为15ml，连续操作10次；再倒入100ml冷却到70℃左右时培养液，连续操作4次。最后将灭菌后已冷却到约60℃的培养液倒入自动分液器的储液漏斗内，用90mm的培养皿接住15ml培养液，平放于超净台内冷却到培养液全部凝固成固体培养基，每次分装不超过200个；冷却凝固过程中开超净台的紫外灯；凝固后在超净台内，将培养皿的盖子盖上，倒扣后将培养皿取出，放入真空包装袋抽真空，每个真空包装带内含有一块装有固体培养基的培养皿。3）用k-b纸片法的方法制作阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、复方新诺明smz、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、土霉素、盐酸沙拉沙星、卡那霉素、乳酸诺氟沙星、多粘菌素b、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、林可霉素共16种药物的药敏纸片；将药敏纸片按照1-16的编号分别黏贴于贮药圈的正面，放入真空包装袋抽真空，其中，每个真空包装装1块装有药敏纸片的药敏贮药圈。比对试验1.增菌培养液增菌效果实验，将实验菌种经活化后调至浓度为107cfu/ml数量级后，分别接种于l1（普通营养肉汤）、l2（本发明用增菌培养液）和l3（蒸馏水）培养基中。接种量1%，培养温度25℃，培养箱转速200r/min，培养时间均为18h；分光光度计法测细菌增菌前后浓度（每组3个平行）；倍增率=每组增菌培养后菌液浓度/每组增菌培养前菌液浓度。液体增菌效果的结果如表1所示：表1培养基名称增菌培养前菌液平均浓度（107cfu/ml）增菌培养后菌液平均浓度（1010cfu/ml）倍增率l12.01.14570l22.08.44200l32.12.31095从以上结果看出：培养基l2最适于菌株生长，本研究即选定该增菌培养液作为增菌液。2.固体培养基培养效果实验，将液体培养基增菌培养后的菌液103cfu/ml数量级后取100μl，分别涂布于s1（普通营养琼脂）,s2（本发明用固体培养基）和s3（tcbs培养基）固体培养基倒置的平板上，25℃培养18h；计数克隆形成数量情况；克隆形成率=克隆实际形成个数/涂布前菌体理论个数*100%。固体培养基培养效果如表2所示：表2培养基名称涂布前菌体理论个数克隆实际形成个数克隆形成率（%）s112011595.8s211010393.6s312011293.3经t检验后三者差异不显著（p>0.1），本研究即选定培养基s1作为固体培养基。3.试剂盒药敏结果的比对，采用k-b法，用以上16种药物分别对病原菌进行药物敏感性实验，采用本试剂盒说明书的方法，用以上16种药物分别对3种病原菌进行药物敏感性实验。表3药物名称k-b法本试剂盒药物名称k-b法本试剂盒林可霉素mm盐酸沙拉沙星ms氟苯尼考ss硫酸新霉素ss盐酸多西环素ss多粘菌素brr土霉素ss头孢噻肟ss盐酸恩诺沙星mm庆大霉素rr恩诺沙星mm复方新诺明smzrr卡那霉素rr阿莫西林ss乳酸诺氟沙星rm青霉素ss注：s-敏感、r-抗性、m-中度敏感；从以上结果可以看出，采用两种方法进行药敏实验，本试剂盒与k-b法进行对照，仅乳酸诺氟沙星和盐酸沙拉沙星两个结果略有不同，其它结果均相同，这就说明本试剂盒基本可达到常规k-b法进行药敏实验的准确性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。当前第1页12