本发明涉及生化
技术领域：
，具体涉及一种皮肤密集修复用弹性蛋白及其制备方法。
背景技术：
弹性蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白，主要组成部分为弹性纤维。其大量存在于哺乳动物的肺、大动脉及皮肤等经常受力而变形的组织和器官中，主要功能是为所在组织和器官提供抵抗反复压缩和变形的能力。弹性蛋白在组织中的含量因组织所需的弹性功能程度不同而不同，皮肤中含量最低，约为2-3％；肺和主动脉中含量居中，分别为10-25％和30-50％；韧带中含量最高，约为80％。同时弹性蛋白主要由纤维细胞、大动脉平滑肌细胞和软骨细胞所产生，产生的细胞由于所处器官不同而有所差别。弹性蛋白含有特有的氨基酸结构，是由两个α链和一个β链交联形成的三螺旋结构，由于其致密的结构和疏水性，具有良好的弹性和延展性，而且能抵抗大部分水解酶的酶解。然而由于弹性蛋白原料的结构，会阻碍酶解进程，可能产生杂肽，并且影响产品的风味。弹性蛋白组织中常富含脂类物质，影响弹性蛋白的使用效果。申请号为2013102946564的发明专利中，采用牛颈韧作为原料制备弹性蛋白，其在丙酮中浸泡初步脱脂，再用草酸溶液煮沸脱除脂肪，但丙酮为低毒物质，易挥发，在实际生产中不利于环保，草酸煮沸虽可以去除部分脂肪，也造成部分弹性蛋白的流失。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种皮肤密集修复用弹性蛋白及其制备方法，方法简单容易实施，环保无污染，通过对牛颈韧带表面进行脱脂处理，提高弹性蛋白的酶解效率和纯度，得到的弹性蛋白具有抗氧化、保湿的功效，可显著提升皮肤中的透明质酸和含水量。本发明目的是通过如下技术方案实现的：一种皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理；(2)酶解；(3)透析；(4)真空冷冻干燥。一种皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成(1-4)mm×(1-4)mm×(1-4)mm的块状物，将10-20份块状物和40-80份3-6wt％碳酸钠水溶液混合，在40-60℃以100-300转/分搅拌20-40分钟，过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)酶解：将预处理原料和40-80份水混合，以100-300转/分搅拌5-10分钟，加入0.01-0.1份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为7.0-8.5，在45-55℃以100-300转/分搅拌2-4小时，再加入0.02-0.2份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.0-7.0，50-60℃以100-300转/分搅拌4-6小时，再升温至90-100℃保温2-5分钟，自然降温至15-30℃，以4000-6000转/分离心20-30分钟，收集上清液；(3)透析：将上清液在透析袋中透析36-72小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的8-12倍，每10-15个小时更换一次透析介质，得到透析液；(4)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白。一种皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成(1-4)mm×(1-4)mm×(1-4)mm的块状物，将10-20份块状物和40-80份3-6wt％碳酸钠水溶液混合，在40-60℃以100-300转/分搅拌20-40分钟，过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和40-80份水混合，加入0.01-0.05份脂肪酶、0.1-0.3份分散剂、0.1-0.3份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8-10，在40-60℃以100-300转/分搅拌90-180分钟，反应过程维持反应ph为8-10，反应完毕，过滤，滤饼用25-35份3-6％wt碳酸钠水溶液洗涤1-3次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和40-80份水混合，以100-300转/分搅拌5-10分钟，加入0.01-0.1份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为7.0-8.5，在45-55℃以100-300转/分搅拌2-4小时，再加入0.02-0.2份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.0-7.0，50-60℃以100-300转/分搅拌4-6小时，再升温至90-100℃保温2-5分钟，自然降温至15-30℃，以4000-6000转/分离心20-30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析36-72小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的8-12倍，每10-15个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白。所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度3-6mm，设定预冻温度为-20～-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1-2小时，设定升华温度为5-15℃，解析温度为30-35℃，真空度10-30pa，干燥时间10-20小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比(1-3)：(1-3)的混合物。所述分散剂为羟丙基-β-环糊精和/或磺丁基-β-环糊精。优选地，所述分散剂为羟丙基-β-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物，所述羟丙基-β-环糊精和磺丁基-β-环糊精的质量比为(1-5)：1。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠和/或氢氧化钠。一种皮肤密集修复用弹性蛋白，采用上述方法制备得到。本发明皮肤密集修复用弹性蛋白及其制备方法，方法简单容易实施，环保无污染，通过对牛颈韧带表面进行脱脂处理，提高弹性蛋白的酶解效率和纯度，得到的弹性蛋白具有抗氧化、保湿的功效，可显著提升皮肤中的透明质酸和含水量，可对老化皮肤进行密集修复，可用于护肤品和保健品，具有良好的应用前景。具体实施方式在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。透析袋，美国联合碳化透析袋，截留分子量1000d。脂肪酶，南宁庞博生物工程有限公司，5万u/g，型号：pb26。胰蛋白酶，西安普瑞斯生物工程有限公司，5万u/g，型号：普瑞斯-1121。木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司，酶活5万u/g，型号：pb01。风味蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司，酶活5万u/g，型号：pb03。羟丙基-β-环糊精，cas号：128446-35-5，武汉东康源科技有限公司提供。磺丁基-β-环糊精，cas号：25167-62-8，武汉东康源科技有限公司提供。清除dpph自由基能力测定：将实施例中得到的皮肤密集修复用弹性蛋白，根据贾俊强、马海乐等的《超生预处理大米蛋白制备抗氧化肽》对清除dpph自由基进行测定，测定皮肤密集修复用弹性蛋白浓度为1.0g/l时的dpph自由基清除率。皮肤密集修复用弹性蛋白对小鼠衰老模型的影响实验：km小鼠，spf级，雄性，体重18-22g，正常喂养检疫观察7天，随机分为9组，每组10只，分别为正常组、模型组、实验组1-7。将实施例1-7中得到的弹性蛋白分别用蒸馏水稀释至5.0mg/ml，得到实验组1-7的受试样品。模型组和实验组每日颈背皮下注射5％d-半乳糖1.0g/kg，正常组每日颈背皮下注射等体积的生理盐水。实验组和模型组小鼠同时进行uv照射，uv照射波长为350-400nm，照射时间40min/天，光源距小鼠距离为40厘米垂直高处，持续造模40天，空白组小鼠正常光照饲养，造模第11天开始，实验组分别每日灌胃给予受试样品，药剂量均为50ml/kg，正常组和模型组则每日灌胃等体积的蒸馏水，连续喂食30天。皮肤含水量：将小鼠处死，取2cm×2cm背部皮肤组织，刮去浅黄色皮下脂肪组织，称重，得m1，在80℃干燥12小时，称重，得m2，则皮肤含水率为：(m1-m2)/m1×100％。测定皮肤含水率后，用量筒取相当于该组织块重量9倍的预冷的生理盐水，倒入装有组织块的烧杯中，而后用眼科剪尽快剪碎组织块倒入匀浆管中，利用匀浆机研磨5min，使组织匀浆化。将制备好的10％匀浆液以5000r/min离心30min，取上清液4℃保存待测。测定皮肤中透明质酸含量：采用透明质酸elisa试剂盒(齐一生物科技(上海)有限公司提供)，严格按照试剂盒说明测定小鼠皮肤中透明质酸含量。实施例1皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)酶解：将预处理原料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，加入0.03份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8.0，在50℃以200转/分搅拌3小时，再加入0.06份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.5，在55℃以200转/分搅拌5小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(3)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(4)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比2：1的混合物。实施例2皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和60份水混合，加入0.03份脂肪酶、0.2份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为9，在50℃以200转/分搅拌120分钟，反应过程维持反应ph为9，反应完毕，采用100目滤布过滤，滤饼用30份5％wt碳酸钠水溶液洗涤2次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，加入0.03份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8.0，在50℃以200转/分搅拌3小时，再加入0.06份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.5，在55℃以200转/分搅拌5小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比2：1的混合物。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠。实施例3皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和60份水混合，加入0.03份脂肪酶、0.2份分散剂、0.2份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为9，在50℃以200转/分搅拌120分钟，反应过程维持反应ph为9，反应完毕，采用100目滤布过滤，滤饼用30份5％wt碳酸钠水溶液洗涤2次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，加入0.03份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8.0，在50℃以200转/分搅拌3小时，再加入0.06份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.5，在55℃以200转/分搅拌5小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比2：1的混合物。所述分散剂为羟丙基-β-环糊精。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠。实施例4皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和60份水混合，加入0.03份脂肪酶、0.2份分散剂、0.2份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为9，在50℃以200转/分搅拌120分钟，反应过程维持反应ph为9，反应完毕，采用100目滤布过滤，滤饼用30份5％wt碳酸钠水溶液洗涤2次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，加入0.09份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8.0，在40℃以200转/分搅拌8小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述分散剂为羟丙基-β-环糊精。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠。实施例5皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和60份水混合，加入0.03份脂肪酶、0.2份分散剂、0.2份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为9，在50℃以200转/分搅拌120分钟，反应过程维持反应ph为9，反应完毕，采用100目滤布过滤，滤饼用30份5％wt碳酸钠水溶液洗涤2次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，再加入0.09份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.5，在55℃以200转/分搅拌8小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比2：1的混合物。所述分散剂为羟丙基-β-环糊精。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠。实施例6皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和60份水混合，加入0.03份脂肪酶、0.2份分散剂、0.2份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为9，在50℃以200转/分搅拌120分钟，反应过程维持反应ph为9，反应完毕，采用100目滤布过滤，滤饼用30份5％wt碳酸钠水溶液洗涤2次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，加入0.03份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8.0，在50℃以200转/分搅拌3小时，再加入0.06份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.5，在55℃以200转/分搅拌5小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比2：1的混合物。所述分散剂为磺丁基-β-环糊精。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠。实施例7皮肤密集修复用弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤，所述份均为重量份：(1)预处理：新鲜牛颈韧带除去脂肪及结缔组织，切成2mm×2mm×2mm的块状物，将15份块状物和60份5wt％碳酸钠水溶液混合，在50℃以200转/分搅拌30分钟，采用100目滤布过滤，用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到预处理原料；(2)脱脂：将预处理原料和60份水混合，加入0.03份脂肪酶、0.2份分散剂、0.2份脂肪酸中和剂，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为9，在50℃以200转/分搅拌120分钟，反应过程维持反应ph为9，反应完毕，采用100目滤布过滤，滤饼用30份5％wt碳酸钠水溶液洗涤2次，再用水洗涤至洗液ph为中性，沥干表面水分，得到纯弹性蛋白材料；(3)酶解：将步骤(2)得到的纯弹性蛋白材料和60份水混合，以200转/分搅拌6分钟，加入0.03份胰蛋白酶，用质量分数为5wt％的碳酸钠水溶液调节ph为8.0，在50℃以200转/分搅拌3小时，再加入0.06份混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸调节ph为6.5，在55℃以200转/分搅拌5小时，再升温至98℃保温3分钟，自然降温至25℃，以5000转/分离心30分钟，收集上清液；(4)透析：将上清液在透析袋中透析48小时，透析介质为蒸馏水，透析介质的体积为上清液体积的10倍，每12个小时更换一次透析介质，得到透析液；(5)干燥：将透析液进行真空冷冻干燥，得到皮肤密集修复用弹性蛋白，所述真空冷冻干燥的条件为：物料厚度5mm，设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持1.5小时，设定升华温度为10℃，解析温度为35℃，真空度20pa，干燥时间15小时。所述混合酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比2：1的混合物。所述分散剂为羟丙基-β-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物，所述羟丙基-β-环糊精和磺丁基-β-环糊精的质量比为3：1。所述脂肪酸中和剂为碳酸钠。测试例1对实施例制备得到的皮肤密集修复用弹性蛋白的清除dpph·能力进行测试，具体测试结果见表1。表1皮肤密集修复用弹性蛋白清除dpph·能力测试结果表清除dpph·能力，％实施例147.6实施例258.3实施例367.1实施例454.4实施例559.2实施例665.3实施例773.8测试例2皮肤密集修复用弹性蛋白对小鼠衰老模型的影响实验中，小鼠皮肤含水率、透明质酸含量测试结果表见表2-3。各组间数据差异比较采用t检验方法，p<0.05为差异具有统计学意义。与模型组相比，实验组数据p<0.05，与空白组相比，模型组数据p<0.05。表2皮肤含水率测试结果表表3透明质酸含量测试结果表测试例3对实施例制备得到的皮肤密集修复用弹性蛋白的改善皮肤效果进行测试，具体测试结果见表4。测试方法：由210名30-40岁的健康女性，皮肤均为干性，随机分为7组，每组30人，分别服用实施例1-7的皮肤密集修复用弹性蛋白，每天服用一次，每次3g，用80℃的温水溶解以后服用，服用时间90天。测试标准：显效：皮肤明显改善，细纹明显减少，皮肤保持湿润。有效：皮肤有所改善，细纹有所减少，皮肤保持较湿润。无效：皮肤状况没有任何改善。表4改善皮肤效果测试结果表当前第1页12