本发明属于生物合成
技术领域：
：，尤其涉及一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用。
背景技术：
：目前，业内常用的现有技术是这样的：1、内生真菌的分析现状内生真菌是一类生活于健康植物的组织细胞间或细胞内，且不会造成明显疾病症状的真菌。自1898年vogl等科学家成功地从黑麦草的种子中分离出第一株内生真菌，120年来，关于内生真菌的分析从未间断过，目前内生真菌的分析已经覆盖了整个植物界，不管是常见的低等植物如苔藓、地衣等，还是经济价值高的高等植物如人参、铁皮石斛等。尤其是在1993年，美国蒙大拿州立大学strobel博士等首次从短叶红豆杉的韧皮部中分离得到1株能合成新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌安德氏紫杉霉taxomycesandreanae，这项分析结果直接而有力地证明植物内生真菌能够合成与宿主植物相同或相似活性成分。此后植物内生真菌的分离纯化、菌种鉴定、活性检测逐渐成为分析热点。1.1内生真菌的多样性内生真菌广泛存在于整个植物界中，是一个庞大而特殊的真菌类群，相较于其他真菌类群，内生真菌的分析尚处于起步阶段，学界对内生真菌的种类和数量还知之甚少。最初hawksworth在估算自然界中真菌存在的数量时，并没有将内生真菌计算在内。学者从现已分析过的植物体内都能分离到数量不等的内生真菌，表明内生真菌是普遍存在于植物体内的，数量从十几种到近百种，还从未出现过没有分离得到内生真菌的现象。田小曼等从菊科植物青蒿的根、茎、叶三个不同部位中,成功地分离出12株内生真菌。伍等从两个产区的玄参中成功分离得到58株内生真菌。秦盛等以一种墨西哥仙人掌opuntiamicrodasys(lehm.)pfeiff的肉质茎为材料，从中分离获得31株内生真菌。李治滢等以药用植物乌头的侧根、茎、叶、花为材料，从这四个不同部位中分离获得164株内生真菌[8]。在对内生真菌与宿主进行专一性分析时发现平均每种宿主至少有4-5种专性内生真菌,如果按地球目前己探明存在的25万种植物计算,则整个植物界内生真菌的总数可以超过100万种。1.2内生真菌的作用内生真菌作为一类长期生活在宿主植物体内的真菌类群，在与宿主长期协同进化的过程中形成了特殊的互惠共生关系。一方面宿主植物可以为内生真菌提供生长所需的营养物质和栖息场所，另一方面内生真菌也可以合成一些对宿主植物有利的活性成分。因此内生真菌对宿主植物的生长发育和进化演变起到重要作用。1.2.1促进宿主植物的生长内生真菌具有可以增强植物生长的功能，behie等发现绿僵菌metarhiziumrobertsii通过菌丝的作用，为植物宿主提供一种有效的氮转移途径。在绿僵菌的作用下，昆虫体内15个被标记的氮，最后以两种氨基酸的形式出现在菜豆phaseolusvulgaris和柳枝稷panicumvirgatum两种植物内，证明绿僵菌能够促进植物对氮元素的吸收利用。明乾良通过实验证明我国重要药用植物丹参salviamiltiorrhizabge.产生的内生真菌d16对丹参毛状根的生长具有明显的促进作用。李会强分析发现多年生黑麦草产生的内生真菌在温室盆栽和田间条件下都能促进宿主植物生长。带内生真菌种群的分蘖数、株高生长速率、分蘖生长速率、叶宽、地上部组织含水量均显著高于不带内生真菌种群和对照种群(p<0.05)，这充分说明内生真菌对多年生黑麦草生长有明显的促进作用,内生真菌带菌率越高,这种促进作用越明显。内生真菌具有可以合成促进植物生长发育的物质的功能，如生长素、赤霉素等。张集慧等选取从兰科药用植物中分离得到的5种内生真菌进行发酵,从真菌发酵液和菌丝体中分别提取植物激素,经分析鉴定其中包含有赤霉素(ga3),吲哚乙酸(iaa)、脱落酸(aba)、玉米素(z)、玉米素核苷(zr)5种植物激素，而这些激素对兰科药用植物的生长具有良好的促进作用。1.2.2增强宿主植物的抗逆境和病虫害的能力waqas等发现拟青霉菌p.formosuslwl1产生的植物激素和有机酸具有缓解粳稻热应激方面的作用，能显著提高植物生长情况,包括株高、鲜重、干重和叶绿素含量，且具有更低的内源性胁迫信号化合物水平及提升的总蛋白量,有利于作物在高温环境下生长的耐受性。宋梅玲通过实验证明带有内生真菌种群的盐生植物野大麦hordeumbrevisubulatum在盐胁迫条件下种子的发芽率、发芽指数和根苗长、相对含水量以及叶绿素、类胡萝卜素和游离脯氨酸的含量(p<0.05)、sod、pod和cat酶活性、营养元素吸收和运输能力均显著高于对照组。yao等分析表明从山豆根sophoratonkinensis分离得到的655株内生真菌中有6株菌对三七panaxnotoginseng的三种病原真菌有显著的抑制活性。1.2.3合成丰富的代谢产物ludwig-müller指出植物次生代谢产物的部分或完整的生物合成途径可能与植物体内的内生菌有关，内生菌也可以合成相同的或类似的活性物质。strobel分析发现从内生真菌中可分离出51％的具有生物活性的新物质,而从土壤微生物仅能分离出38％的新物质。目前已从内生真菌中分离到大量生物活性物质,主要有黄酮、生物碱、醌类、环肽、脂肪酸等化合物,并发现其化学成分具有杀虫、降糖、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性[21]。同时因为内生真菌具备脱离其寄主植物可独立生长的能力,在实验室条件下就可以成功培养存活。因此相较于宿主植物，内生真菌具有个体小、容易培养保藏，发酵周期短，不污染环境等多方面优势，并且可以通过发酵内生真菌来获得大量目的产物。这些优势使得内生真菌成为一种重要的天然药物新来源，也避免植物资源被过度开采，为保护濒危植物资源起到重要作用。liu等从喜树camptothecaacuminatadecne.的根、枝、叶和果实中分离出48株内生真菌,采用hplc法与紫外扫描光谱相结合的方法,得到了类似于喜树碱的紫外光谱和10株能够产生喜树碱的菌株。并进一步对其抗肿瘤活性进行筛选,结果发现7株菌株明显抑制hl-60细胞的体外生长。刘芸等采用组织分离法，通过分离、纯化桃儿七植株根、茎部位的内生真菌,得到一株能产鬼臼毒素的内生真菌cephalosporiumsp.，采用动物体内抑瘤实验分析该株内生真菌的发酵液对小鼠s180肉瘤有抑制作用,能够促进白细胞和淋巴细胞的增殖。张玲琪等首次分析证明从长春花catharanthusroseus(l.)茎的韧皮部中分离出的尖孢镰刀菌fusariumoxysporum能够产生抗癌药长春新碱成分。1.3川贝母内生真菌的分析现状川贝母为百合科植物川贝母fritillariacirrhosad.don、暗紫贝母fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia、甘肃贝母fritillariaprzewalskiimaxim.、太白贝母fritillariataipaiensisp.y.li或瓦布贝母fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsiavar.wabuensis(s.y.tangets.c.yue)z.d.liu,s.wangets.c.chen的干燥鳞茎。具清热润肺，化痰止咳，散结消痈的作用。川贝母作为一种名贵的药食两用中药材，近年来得到了大力的分析开发。由于内生真菌是一类长期生活在植物体内的真菌类群,其群落的任何变化都会导致植物群落组成的改变,进而直接影响植物的生存、竞争和品质，因此有必要对川贝母内生真菌进行进一步分析。经过分析表明川贝母内生真菌在数量和种类上都极其丰富，严铸云等从5个不同生长期间的川贝母的干燥鳞茎中,分离获得分属于1纲6目30属的内生真菌90株。陈鹊等从暗紫贝母、甘肃贝母、川贝母、梭砂贝母的健康鳞茎中依次分离到15、13、6、4种内生真菌，其中9株内生真菌能代谢产生生物碱。同时分析表明分离得到的川贝母内生真菌也具有很强的活性。潘峰等从川贝母中分离得到一株内生真菌fusariumtricinctumcby11，利用dpph自由基清除活性测定、总抗氧化活性测定(abts法)和总还原能力测定(frap法)三种方法测定其抗氧化活性，结果证明该株菌株具有很强的抗氧化活性。陈鹊等发现从暗紫贝母、甘肃贝母中分离得到的内生真菌都具有很强的抑菌活性苏天娇等采用分离自川贝母的15株内生真菌进行酪氨酸酶活性抑制实验，结果表明分离自瓦布贝母的3株内生真菌的发酵液均有较高的抑制酪氨酸酶活性，并能够在高温处理下保持一定的稳定性。2纳米银合成的分析纳米银(silvernanoparticles)是指将粒径制备到1-100nm的金属银单质,作为一种特殊的银系材料,纳米银具有区别于普通金属银块体和银离子的物理、化学和生物学性质。而作为一种纳米材料，纳米银又具有表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应,因此它能显示出异于常规材料的热、光、电、磁、催化和敏感等独特性质。纳米银现已广泛应用于催化剂材料、防静电材料、低温超导材料、生物传感器材料和生物医学等方面，因此纳米银的合成与制备成为近来分析的热点。纳米银的合成方法多种多样，主要有物理法、化学法和生物法三大类。2.1传统法合成纳米银目前，纳米银的合成主要采用的是传统方法，包括物理法和化学法[35]。之前物理法和化学法因为具有实验条件简易、成本低、节能等优点而得到广泛地应用，实际生产中也大多采用这两种方法进行大规模量产。但其中涉及到合成纳米银的不稳定性和毒性试剂等问题，人们对此争议较大[36]。2.1.1物理法物理法合成纳米银主要是运用各种分散技术直接将大块的银单质变成纳米级的银粒子，常用的方法有物理粉碎法、蒸发冷凝法、溅射法、雾化法和机械球磨法等。尽管物理法制备的纳米银具有杂质少、纯度高的优点，但是由于此法对设备条件要求很高，而且通常制得的纳米银粒径较大且分布不均匀。因此生产成本高、条件不易控制和耗能高成为物理法推广的重要阻碍。2.1.2化学法化学法合成纳米银主要是运用化学还原的原理，使用还原剂将银离子还原为纳米银颗粒。主要有液相化学还原法、光化学还原法、电化学还原法、微乳法、微波辅助法等。化学合成法因其条件简单、成本低、产量大、制得的纳米银粒径可控、操作简便等优点，在实际生产中得到了广泛应用。董春法采用液相还原法，以月桂酸为修饰剂、水合肼为还原剂、银氨溶液为前驱体,通过调控反应条件，将月桂酸与硝酸银的质量比调整为1.2：1,在室温条件下就能合成得到平均粒径为8nm、分布均匀、单分散的纳米银颗粒。阎文锦以peg为模板和还原剂，只需通入h2，通过此法便能合成粒径小于10nm的纳米银[46]。付冉艳采用液相化学还原法,将n,n二甲基甲酰胺(dmf)作为溶剂兼还原剂,以聚乙烯吡咯烷酮(pvp)作为表面活性剂,通过调控改变相关实验条件,可控制备了不同形貌结构的纳米银。但是化学法合成纳米银在合成过程中需要使用到溶剂、还原剂、稳定剂和保护剂等，难免出现以下问题：(1)溶剂、稳定剂和保护剂等多具有毒性，易造成环境污染；(2)金属前驱体溶解度较小，易过量；(3)化学试剂价格昂贵。这些因素极大限制了化学法的推广应用。2.2生物法合成纳米银随着纳米银的应用被不断推广深入，如何低能高效、绿色友好地合成纳米银并投入工业中大量生产逐渐成为今年来分析的热点。生物法合成的纳米银一般比物理法得到的纳米银粒径更小，分布更均匀；比化学法得到的纳米银更具有生物安全性。生物法主要采用生物材料和微生物体系来天然合成纳米粒子，不需要高温高压、高能耗，也不需要大量使用有毒化学试剂。而且生物法操作简便、合成条件易控制、成本低、不污染环境。2.2.1生物材料合成纳米银生物法作为一种近年来新兴的制备纳米粒子的方法，越来越受到大家的关注。自然界中的植物种类繁多、数量庞大，是非常理想的合成纳米粒子的生物材料。植物体本身是在细胞内合成纳米粒子的，但由于细胞内存在固有并发症等原因，导致制得的纳米粒子的分离变得很困难，于是现在绝大多数都采用植物浸提液来制备纳米粒子。植物浸提液中含有多种植物代谢产物，如萜类、黄酮类、多酚类、生物酶类等化合物及其衍生物，植物浸提液既可以作为还原剂将ag+还原得到纳米银粒子，同时又可以作为一种覆盖剂，提高合成得到的纳米银粒子的稳定性，且不会对环境造成损害。目前已发现几十种植物都可以用于合成纳米银，比如长春花catharanthusroseus[52]，桂皮cassiafistula(linn.)，番荔枝annonasquamosa，菠菜spinaciaoleracea，芦荟aloevera[56]，野茶树camelliasinensis，巴戟天morindatinctoria，沙漠玫瑰adeniumobesum等植物的浸提液都已分析证实可以合成纳米银粒子。2.2.2微生物体系合成纳米银截至目前，已有分析表明自然界中包括原核生物和真核生物在内的多种微生物都可合成纳米银，如细菌、酵母和真菌等，它们都具有在细胞内或者细胞外合成纳米银的能力。2.2.2.1微生物合成纳米银的种类2.2.2.1.1细菌细菌合成纳米银最早报道出现在1999年，klaus等从银矿中分离得到一株斯氏假单胞菌p.stutzeriag259，将该菌在高浓度的银盐(50mmagno3)中培养，通过tem检测得知，该菌体细胞可以大量积累银粒子。熊文从东北林业大学林场土壤中分离得到一株解淀粉酶芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，利用该细菌培养液与硝酸银合成了球形和近球形平均粒径为15nm的纳米银颗粒,纳米银分散性好,结晶性良好,属于面心立方结构。傅谋兴等发现气单胞菌aeromonassp.sh10的干燥细胞能够迅速将[ag(nh3)2]+还原成ag0，利用紫外-可见光谱检测，在425nm处出现波峰，xrd图谱上有5个特征性衍射峰，表明在此生物还原过程中形成了稳定的银纳米粒子。通过tem和sem观察表明银纳米颗粒大小均匀，分散在细胞和溶液中。张昕等利用多粘类芽孢杆菌jaascd的无细胞滤液在胞外成功合成纳米银粒子,检测发现合成的纳米银粒子粒径均在20-50nm,且形态均一,分散性较好。2.2.2.1.2酵母近年来关于酵母合成纳米银的分析越来越多，dan分析证明利用毕赤酵母菌粉作为还原剂，硝酸银为前躯体时，当ph≤4时，溶液中没有纳米银生成；当ph＞4时，随着ph值的增大，所获得的纳米颗粒的粒径逐渐减小。且随着搅拌速度的增大和温度的升高，纳米银的紫外-可见光吸收峰的强度逐渐增大，但峰的位置没有发生变化，说明搅拌速度和温度对纳米银粒径的影响不大。ana等从葡萄牙酸性矿山引流中分离得到一株嗜极酵母菌菌株，利用清洗过后的酵母菌株与含银离子的溶液反应，得到了粒径小于20nm的agnps。apte等利用解脂耶氏酵母yarrowialipolytica(ncyc789)与硝酸银溶液反应合成了粒径为15nm的纳米银颗粒。2.2.2.1.3真菌真菌合成纳米银的分析近几年取得了巨大进展，作为一种快捷有效地合成纳米银的方法受到越来越多的关注。真菌与细菌和酵母相比，具有能分泌大量的酶，分离过程简单的优势。目前已有多种真菌种类证实能够成功合成纳米银粒子。李广泉首次利用土曲霉aspergillusterreus成功合成纳米银，反应在20-37℃的室温条件下即可发生，生成球形或者近球形的纳米银颗粒，粒径大小在1-20nm，具有典型的面心六面体结构。张杰等将钩状木霉trichodermahamatum，nyzj03与2mmol/l的agno3溶液混合在黑暗条件下反应，培养液颜色变为红褐色，uv-vis图谱在420nm处出现明显的吸收峰，表明有纳米银颗粒生成，tem检测纳米银粒子多数为球形，具有单分散性，粒径分布在1-13nm之间，平均粒径为6.69nm。lig等利用曲霉菌aspergillusterreus的上清液在常温条件下很快将ag+还原成agnps，通过对agnps形态表征，发现合成的agnps是一种多分散的球形颗粒，粒径大小在1-20nm之间，且具有很好的稳定性[69]。vala等利用从印度西海岸的坎贝湾沿岸分离出来的海洋真菌黑曲霉aspergillusniger与不同浓度的硝酸银溶液反应(0.25-1-mm)，在24h都合成了纳米银粒子，粒子的大小范围为5-26-nm。honary等从土壤中分离得到一株桔青霉菌penicilliumcitrinum，与硝酸银溶液在28℃黑暗条件下反应24h，能够得到大小均匀，平均直径为109nm的球形纳米银颗粒。rodrigues等分析证明塔宾曲霉aspergillustubingensis和淡色生赤壳菌bionectriaochroleuca都具有合成纳米银的能力，合成的agnps都为球形，粒径大小为35±10nm，且有很强的抗真菌能力。2.2.2.2微生物合成纳米银的方法微生物合成纳米银的方法主要有两种：细胞内合成和细胞外合成。细胞内合成纳米银主要是利用细胞内的一些生物酶作为还原剂将银离子还原成纳米银粒子，但目前机制尚未明确。而且获取细胞内合成的纳米银需要先运用超声波或者细胞溶解剂将细胞破碎，这对下游的纳米银回收纯化增加了难度。细胞外合成纳米银主要有3种方式：(1)采用微生物菌体，将培养好的微生物培养液离心或过滤，弃掉上清液，收集菌体，用蒸馏水反复清洗菌体去除表面干扰物质，与硝酸银溶液反应，银离子会诱导菌体产生可还原银离子的活性物质，但此合成过程速度较慢。(2)采用微生物培养上清液，将培养好的微生物培养液离心，取上清液与硝酸银溶液反应，上清液中含有的活性物质能够将银离子还原成纳米银粒子，但上清液中所含成分复杂，纳米银的分离纯化成本高。(3)微生物菌体浸泡液，将培养好的微生物培养液离心或过滤，弃掉上清液，收集菌体，用蒸馏水反复清洗菌体去除表面干扰物质，再将菌体重悬于蒸馏水中培养24h，过滤或离心得到浸泡液再与硝酸银溶液反应合成纳米银。活性物质通过自由扩散作用迁移到浸泡液中，且含有的干扰物质少，便于纳米银的分离提纯。3纳米银抑菌性分析早在16世纪时期，人类就意识到银及其复合物具有极强的抑菌作用，可以有效抑制细菌、真菌以及病毒。而与其他材料相比，银及其复合物只对微生物具有较高的毒性，对哺乳动物细胞表现的毒性则较低且稍有并发症。从那时起银制品就被人类广泛应用于抑菌杀菌方面，例如在中国古人经常用银针测试饭菜是否有毒，达官贵人则直接使用银碗银筷来达到消毒杀菌的作用；在西方古希腊人在基督诞生之前就用银器储存饮用水，防止细菌滋生。后来人们又用银片覆盖住伤口预防溃烂，婴儿出生时滴上硝酸银溶液可防止黏膜感染。20世纪30年代，随着抗生素的发现与普及，人们一度忽视银制品的抗菌能力，直至“超级细菌”的出现。由于抗生素的滥用，越来越多的微生物通过其本身的染色体突变、生化机制、酶灭活等方式对市面上的抗生素产生了耐药性，细菌感染成为亟待解决的问题。人们再一次将目光聚焦在具有抑菌广谱性、不易产生耐药性的银系抗菌材料上。由于纳米银具备纳米材料单分散性、粒径小等的特殊性质，使其具有显著的量子尺寸效应、表面效应和量子隧道效应,从而使纳米银具有超强的活性及渗透性,抑菌或杀菌效果都要比传统的银离子更好。纳米银不仅具有抑菌广谱性、持续杀菌的有效期长，而且无耐药性、安全性高。张逸等通过无菌试验、全身急性毒性试验及sd大鼠对该材料中银的吸收、代谢情况等试验，证明丹参纳米银复合材料无菌，无热原，无刺激，无明显急性毒性，且机体对纳米银的吸收比对经典创面抗感染药磺胺嘧啶银少，具有良好的生物安全性。佘文珺等采用mtt法检测添加了纳米载银无机抗菌剂的义齿基托树脂对传代培养的小鼠成纤维细胞l-929的细胞毒性，结果表明添加了低浓度纳米载银无机抗菌剂的基托树脂，无明显细胞毒性，具有较好的生物安全性。因此纳米银的抗菌性能已被广泛推广应用。目前市面上已经出现了一大批将纳米银渗透到织物中制成的抗菌纺织品，比如抗菌纱布可用于治疗烧伤、烫伤，可有效防止由烧伤、烫伤引起的细菌感染，效果比临床使用的磺胺嘧啶银更好。还有将纳米银材料与陶瓷材料相结合形成一种新的日用陶瓷——纳米抗菌(杀菌)陶瓷，在保持陶瓷制品原有使用功能和装饰效果的同时，增加其消毒、杀菌及化学降解的功能。ling等采用羧甲基壳聚糖季铵盐(qcmc)和有机蒙脱土(ommt)作为还原剂和稳定剂，合成得到纳米银。将获得的agnps作为抗菌涂料通过表面涂层和内部添加的方式制备抗菌纸。3.1纳米银抑菌机制纳米银具有高效杀菌性和抑菌广谱性，其抗菌机制是众多专家学者分析的重点，以期为今后专一、高效抗菌提供理论依据，然而目前纳米银的抗菌机制还不是十分明确。通过大量分析表明，目前比较认同的抗菌机制主要有：(1)agnps不断缓释ag+，保持长效抗菌能力。lu等分析发现不同形貌的agnps释放ag+的数量和速度不同，ag+释放量越多，抗菌能力越强。(2)破坏菌膜，改变菌体细胞的形态和结构，达到抗菌目的。liu等通过实验发现agnps可以与附着在细菌细胞膜表面的含硫、磷的化合物发生反应，破坏膜的完整性。(3)与巯基的相互作用，导致细菌关键酶失活。sotiriou等agnps可以与细菌功能蛋白上的氨基酸残基——巯基相互作用，改变酶的结构，最终导致关键酶失活。(4)抑制细菌dna复制，降低细胞分裂速度。有文献报道说agnps可能会造成dna的凝结，从而造成dna复制减少和降解，达到抑制细菌生长的作用。(5)穿透菌膜进入细胞，阻断呼吸链。li等用5μg/mlagnps处理大肠杆菌(e.coli)10分钟后，呼吸链脱氢酶的活性降到最低，而且agnps浓度越高，酶活性越低。3.2纳米银抑制生物膜生物膜(biofilm,bf)是细菌在生长过程中，为适应生存环境的变化而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞(planktoniccell)相对应的生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质(extracellularpolymericsubstances，eps)组成。此类细菌被生物膜紧紧包裹在内，与普通浮游细胞在形态结构和生化特性上具有显著差异，对机体免疫清除作用及抗生素的杀菌作用抵抗力大幅增强。细菌还可从bf处向外扩散，易造成感染，且感染部位难以彻底清除，反复发作、难以控制。预防或抑制生物膜主要采取以下方法：(1)机械法(声裂、涡流、和超声波)；(2)生化法(酶处理)；(3)电刺激。但这些处理方法都收效甚微,目前国内外尚无发现简便有效的措施。有文献报道称，纳米银粒子对浮游菌和其形成的bf都有着强大的杀灭作用。radzig等发现通过水解酪蛋白缩氨酸，粒径为8.3nm的agnps强烈抑制了大肠杆菌ab1157的生物膜的形成。park等将在玻璃片上生长两天的铜绿假单胞菌p.aeruginosapa01的生物膜与agnps反应，生物膜细胞很快便失活。4纳米银抗肿瘤分析恶性肿瘤具有很高的致病率和致死率，严重威胁人类的身体健康。据世界卫生组织统计，仅2012年全球因恶性肿瘤死亡的人数就达到820万人，占所有死亡人数的13％，恶性肿瘤已经成为人类健康的“第一杀手”。传统的肿瘤治疗方法有：手术切除、化疗和放疗等，虽然有一定的疗效，但具有局限性和副作用。手术切除只适用于体积较大，容易操作切除的肿瘤；化疗的靶向性差，伴有很强的细胞毒性和耐药性；放疗采用射线照射，对正常细胞有影响。现在亟待新型的技术和药物用于恶性肿瘤的诊断和治疗。随着专家学者对纳米银的不断发掘探索，纳米银不仅具有高效抑菌性，对肿瘤细胞的诊断和治疗也起到越来越重要的作用。由于纳米银具有局部表面等离子体共振效应(localizedsurfaceplasmonresonance，lspr)，即入射光子能与纳米银表面自由电子发生共振反应。纳米银可以作为x射线成像的造影剂，检测小鼠体内的肿瘤细胞。zhao等开发了一种新型的可重复使用的纳米银lspr生物传感器来检测宫颈癌患者血清中鳞状细胞癌抗原(scca)，线性定量检测的最佳范围为0.1-1000pm。guo等报道了聚乙烯吡咯烷酮(pvp)包覆的agnps能够引起急性髓系白血病(aml)细胞中活性氧(ros)产生，线粒体膜电位(mmp)损失，dna损伤，从而导致aml细胞凋亡。faedmaleki等分析发现agnps对肿瘤细胞(hepg2细胞)的抑制作用比对正常细胞(小鼠的原发性肝细胞)增强了44倍，证明agnps是一种细胞毒性药物和潜在的抗癌候选药物。nazir等分析证明agnps对人类皮肤恶性黑色素瘤ht144和鳞状细胞肺癌h157都具有很强的抑制作用，肿瘤细胞50％的增长抑制剂量(id50)为3.6μmol。综上所述，现有技术存在的问题是：微生物合成纳米银的方法主要有两种：细胞内合成和细胞外合成。细胞内合成纳米银主要是利用细胞内的一些生物酶作为还原剂将银离子还原成纳米银粒子，但目前机制尚未明确。而且获取细胞内合成的纳米银需要先运用超声波或者细胞溶解剂将细胞破碎，这对下游的纳米银回收纯化增加了难度。不能确定到底是哪种生物酶在具体起作用，还是多种生物酶联合作用合成纳米银。现有的合成需要价格高昂的设备仪器，合成成本高，且合成的纳米银粒径很大，分布不均匀，合成过程中产生的废液对环境会造成污染。解决上述技术问题的难度和意义：单体的纯化分离很难，很难将细胞代谢物和纳米银完全分离。本发明证明了川贝母这个内生真菌能够和硝酸银反应生成纳米银，具有合成纳米银的生物活性(已有研究证明其他植物的内生真菌具有该活性)。而且生成的纳米银具有一定的抑菌和抗肿瘤活性本发明不需要价格高昂的设备仪器，利用川贝母内生真菌便可介导生物合成纳米银，合成成本更低，且合成的纳米银粒径更小，分布更均匀，合成过程中不使用有毒有害的化学药品，合成后产生的废液不会污染环境。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用。本发明是这样实现的，一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法，包括：利用川贝母内生真菌浸泡液与硝酸银溶液反应，对分离得到的15株川贝母内生真菌进行初筛后，利用川贝母内生真菌cby4和cby13通过生物合成法制备纳米银4-agnps和13-agnps；生物合成过程中，合成条件为：ph3-11，硝酸银溶液浓度为2mmol/l，2000lux光照强，50℃。cby4和cby13两种菌种为本发明前期分离已经得到，并将基因序列提交到ncbigenbank；登录网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov。得到序列编号cby4：和cby13：mh059783；通过构建系统发育树确认cby4和cby13均为三线镰刀菌。cby4保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为：cgmccno.9719.保藏时间2014年10月11日。进一步，所述川贝母内生真菌生物合成纳米银的合成方法进一步包括：(1)内生真菌的发酵菌株活化：从保存菌种的pda斜面中挑取菌丝接入新鲜配制的pda平板培养基中，置于生化培养箱中28℃培养3-5d活化；发酵液制备：在活化好的菌株平板边缘用5mm打孔器打取菌饼，把菌饼按照一瓶一菌饼的方式接种到装有pdb的三角瓶中；置于恒温振荡培养箱中28℃，120r/min，振荡培养7d；(2)内生真菌的菌体收集和二次发酵过滤内生真菌发酵液，收集菌体，用去离子水反复洗涤3-4次直至滤过液呈无色；取一定量的菌体浸泡在与原发酵体系相同体积的去离子水中进行二次发酵，28℃，120r/min，振荡培养24h。过滤菌体浸泡液，收集滤液；(3)生物合成纳米银的初筛新鲜配制浓度为1mmol/l的硝酸银溶液，将菌体浸泡液和agno3溶液按照9:1的比例进行混合，常温常压条件下静置反应，将未添加agno3溶液的等体积浸泡液设为空白对照；反应一段时间后，结合uv-2600紫外可见分光光度计检测纳米银特征吸收峰，判断是否有纳米银合成产生的指标；(4)内生真菌的鉴定。进一步，内生真菌的鉴定包括：a)形态学鉴定：对筛选的菌株cby4和cby13进行显微形态特征分析；b)分子生物学鉴定：利用经典的ctab法提取川贝母内生真菌cby13的基因组dna：用无菌接种针挑取约5g左右的湿菌体放入研钵中，加入液氮研磨，将研磨好的细粉转移到50ml的无菌离心管中,储存在-20℃冰箱中过夜。取出样品向无菌离心管中加入15ml缓冲液，再加入3ml5mol的nacl和2mlctab裂解液，65℃孵育45min(，然后37℃孵育15min。加入20mlde氯仿：异戊醇＝24:1混合液；混合均匀，室温放置10min后，12000r/min离心20min，弃去上清液后加入11ml的异丙醇缓混匀；用离心法8000r/min离心10min收集核酸颗粒，将沉淀下来的核酸颗粒用70％的乙醇洗净，自然风干10min；将得到的核酸颗粒悬浮于5ml无菌水中；加入0.5mgdnase-freernase，37℃孵育30min；加入5mlde氯仿：异戊醇＝24:1混合液，再加5ml苯酚提取dna；加入4ml异戊醇沉淀dna，然后8000r/min离心10min。弃去上清液，沉淀下来的dna颗粒用70％的乙醇洗净，自然风干，然后溶解于0.5ml的te缓冲液中(10mmtris-hcland0.1mmoledta,ph7.5)；用通用引物its1和its4扩增目标its1-5.8srdna-its2区域：pcr引物：上游引物its15′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和下游引物its45′-tcctccgcttattgatatgc-3′；pcr体系：上下游引物各0.75μl，dna溶液2.0μl，2×taqpcrmastermix15μl，水11.5μl，整个体系共30μl；pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸3min，40个循环，然后72℃延伸15min；对扩增出来的pcr产物进行切胶纯化后进行测序，将所测序列提交到ncbigenbank数据库上进行blast比对，根据比对结果选取相似度最大且具有代表性的菌种利用mega5.10软件采用neighbor-joining(nj)法进行聚类分析.进一步，所述川贝母内生真菌生物合成纳米银的合成方法进一步包括：纳米银合成过程监测：将浸泡液与1mmol/l的agno3溶液按照9:1的比例混合反应后，在不同的时间点0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h取一定量样品，利用uv-2600紫外可见分光光度计对样品进行全波长扫描，检测纳米银合成过程的变化；纳米银合成条件的优化：分析不同光照强度、ph、agno3溶液的浓度和温度对纳米银合成速率的影响，对这4个因素进行优化；不同的ph为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0；不同的agno3溶液的浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mmol/l；不同的光照强度为0、1000lux、1500lux、2000lux和不同的温度为4℃、25℃和50℃。分别在不同条件下反应48h后，取少量样品，利用紫外可见分光光度计对样品进行全波长扫描；优化合成纳米银的表征：利用透射电镜分析纳米银的微观形态：将样本滴在碳支持膜铜网放置3-5min，然后用滤纸吸去多余液体；将2％磷钨酸滴在碳支持膜铜网放置2-3min，用滤纸吸去多余液体，室温干燥；透射电子显微镜下观察，采集图像分析。本发明另一目的在于提供一种利用所述川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法合成的川贝母内生真菌介导纳米银，所述川贝母内生真菌介导纳米银为4-agnps和13-agnps。本发明另一目的在于提供一种利用所述川贝母内生真菌介导纳米银制备的对金黄色葡萄球菌抑菌的药物。本发明另一目的在于提供一种利用所述川贝母内生真菌介导纳米银制备的对大肠杆菌抑菌的药物。本发明另一目的在于提供一种利用所述川贝母内生真菌介导纳米银制备的抗肿瘤制剂。本发明的优点及积极效果为：本发明首次发现川贝母中分离的内生真菌cby4和cby13具有合成纳米银的能力，优化得到了一个比较适合其纳米银合成的反应条件，同时发现合成的纳米银具有一定的抑菌和抗肿瘤活性。本发明发现了川贝母内生真菌新的生物功能和作用，也为生物合成纳米银的分析积累了更多的资料。本发明采用生物合成法，利用川贝母内生真菌浸泡液与硝酸银溶液反应，对课题组前期分离得到的15株川贝母内生真菌进行初筛，结果发现川贝母内生真菌cby4和cby13都能通过生物合成法制备纳米银，经过鉴定两株菌均为三线镰刀菌，将它们合成的纳米银分别命名4-agnps和13-agnps。分别探讨浸泡液ph、硝酸银溶液浓度、光照强度和温度对cby4和cby13生物合成纳米银的影响。结果发现反应不同条件下，纳米银的合成量具有显著差异。在ph3-11的范围内，4-agnps和13-agnps的合成量均在ph为6时达到最大；当硝酸银溶液浓度为2mmol/l时，制得的4-agnps和13-agnps均合成量较大、粒径最小；在2000lux光照强度范围内，随着光照强度增强，4-agnps和13-agnps的合成量均不断增加；在50℃温度范围内，随着温度增加，4-agnps和13-agnps的合成量也均增加。最终确定ph为6、硝酸银浓度为2mmol/l、光强为2000lux和50℃温度条件下相对更适合4-agnps和13-agnps的合成。4-agnps和13-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抑菌效果。采用平板孔阱扩散法的抑菌圈直径分别为19.33mm和19.97mm以及19.72mm和19.38mm。4-agnps抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的最小抑制浓度(mic)分别为76μg/ml和38μg/ml；13-agnps抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的最小抑制浓度(mic)分别为60μg/ml和30μg/ml。纳米银4-agnps和13-agnps均对人宫颈癌hela细胞的增殖生长具有明显的抑制作用，可以成功诱导癌细胞的凋亡，具有良好的抗肿瘤活性。综上，本发明首次发现川贝母中分离的内生真菌cby4和cby13具有合成纳米银的能力，优化得到了一个比较适合其纳米银合成的反应条件，同时发现合成的纳米银具有一定的抑菌和抗肿瘤活性。本发明发现了川贝母内生真菌新的生物功能和作用，也为生物合成纳米银的分析积累了更多的资料。附图说明图1是本发明实施提供的川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法流程图。图2是本发明实施提供的菌株cby4的浸泡液(蓝线)及其制备的纳米银(红线)的uv-vis吸收光谱图。图3是本发明实施提供的菌株cby13的浸泡液(蓝线)及其制备的纳米银(红线)的uv-vis吸收光谱图。图4是本发明实施提供的菌株cby13形态学观察(a、b:菌落形态；c、d：显微镜下形态)图。图5是本发明实施提供的邻接法构建的川贝母内生真菌cby13系统发育树图。图6是本发明实施提供的cby4不同时间点合成纳米银的uv-vis吸收光谱图。图7是本发明实施提供的cby13不同时间点合成纳米银的uv-vis吸收光谱图。图8是本发明实施提供的ph对4-agnps合成的影响图。图9是本发明实施提供的agno3溶液的浓度对4-agnps合成的影响图。图10是本发明实施提供的光照强度对4-agnps合成的影响图。图11是本发明实施提供的温度对4-agnps合成的影响图。图12是本发明实施提供的ph对13-agnps合成的影响图。图13是本发明实施提供的agno3溶液的浓度对13-agnps合成的影响图。图14是本发明实施提供的光照强度对13-agnps合成的影响图。图15是本发明实施提供的温度对13-agnps合成的影响图。图16是本发明实施提供的纳米银4-agnps的透射电镜图。图17是本发明实施提供的纳米银13-agnps的透射电镜图图。图18是本发明实施提供的4-agnps对耐药性金黄色葡萄球菌(左边)和大肠杆菌(右边)的抑菌效果图。图19是本发明实施提供的13-agnps对金黄色葡萄球菌(左边)和大肠杆菌(右边)的抑菌效果图。图20是本发明实施提供的4-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的抑制效果及mic图。图21是本发明实施提供的13-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的抑制效果及mic图。图22是本发明实施提供的13-agnps和4-agnps对hela细胞增殖的影响图。图23是本发明实施提供的不同浓度4-agnps作用下hela细胞的形态图。图24是本发明实施提供的不同浓度13-agnps作用下hela细胞的形态图。图25是本发明实施提供的cck8检测13-agnps和4-agnps抗肿瘤活性图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。如图1所示，本发明提供一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成包括以下步骤：s101，以川贝母内生真菌为原料，采用生物合成法与硝酸银溶液反应成功合成纳米银；s102，通过改变反应条件对合成过程进行优化；s103，以纳米银为对象，对其进行抑菌活性和抗肿瘤活性的分析。本发明提供的川贝母内生真菌生物合成纳米银的合成方法具体如下：(1)内生真菌的发酵菌株活化：从保存菌种的pda斜面中挑取一定量的菌丝接入新鲜配制的pda平板培养基中(直径90mm)，置于生化培养箱中28℃培养3-5d活化(具体活化时间视菌株的生长情况而定)。发酵液制备：在活化好的菌株平板边缘用5mm打孔器打取菌饼，把菌饼按照一瓶一菌饼的方式接种到装有pdb的三角瓶中(100ml/250ml)。置于恒温振荡培养箱中28℃，120r/min，振荡培养7d。(2)内生真菌的菌体收集和二次发酵过滤内生真菌发酵液，收集菌体，用去离子水反复洗涤3-4次直至滤过液呈无色(洗涤次数视具体情况而定)。取一定量的菌体浸泡在与原发酵体系相同体积的去离子水中进行二次发酵，28℃，120r/min，振荡培养24h。过滤菌体浸泡液，收集滤液，用于纳米银合成实验。(3)生物合成纳米银的初筛新鲜配制浓度为1mmol/l的硝酸银(agno3)溶液，将菌体浸泡液和agno3溶液按照9:1的比例进行混合，常温常压条件下静置反应，将未添加agno3溶液的等体积浸泡液设为空白对照。反应一段时间后，通过观察试管中反应液颜色的变化，结合uv-2600紫外可见分光光度计检测纳米银特征吸收峰(检测范围300-600nm，扫描间隔2nm)，作为判断是否有纳米银合成产生的指标。紫外-可见吸收光谱是一种检测纳米银粒子的重要手段，有文献报道指出，典型的纳米银粒子在400-500nm范围内有特征吸收峰。(4)内生真菌的鉴定a形态学鉴定：通过初步筛选发现菌株cby4和cby13都能生物合成纳米银。用pda培养基培养cby13菌株进行巨大菌落观察。参照文献，采用插片培养法，对菌株进行显微形态特征观察。b分子生物学鉴定：利用经典的ctab法提取川贝母内生真菌cby13的基因组dna：用无菌接种针挑取约5g左右的湿菌体放入研钵中，加入液氮研磨，将研磨好的细粉转移到50ml的无菌离心管中,储存在-20℃冰箱中过夜。取出样品向无菌离心管中加入15ml缓冲液(包含100mmtris-hclph7.5,50mmoledta,2％sds,and1％2-mercaptoethanol)，再加入3ml5mol的nacl和2mlctab裂解液(包含10％ctab和0.7mnacl)，65℃孵育45min(不时倒置)，然后37℃孵育15min。加入20ml混合液(氯仿：异戊醇＝24:1)；混合均匀，室温放置10min后，12000r/min离心20min，弃去上清液后加入11ml(0.55vol)的异丙醇缓混匀。用离心法8000r/min离心10min收集核酸颗粒，将沉淀下来的核酸颗粒用70％的乙醇洗净，自然风干10min。将得到的核酸颗粒悬浮于5ml无菌水中；加入0.5mgdnase-freernase，37℃孵育30min。加入5ml混合液(氯仿：异戊醇＝24:1)，再加5ml苯酚提取dna。加入4ml异戊醇沉淀dna，然后8000r/min离心10min。弃去上清液，沉淀下来的dna颗粒用70％的乙醇洗净，自然风干，然后溶解于0.5ml的te缓冲液中(10mmtris-hcland0.1mmoledta,ph7.5)。用通用引物its1和its4扩增目标its1-5.8srdna-its2区域：pcr引物：上游引物its1seqidno：15′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′)和下游引物its4seqidno：25′-tcctccgcttattgatatgc-3′。pcr体系：上下游引物各0.75μl，dna溶液2.0μl，2×taqpcrmastermix(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)15μl，水11.5μl，整个体系共30μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸3min，40个循环，然后72℃延伸15min。对扩增出来的pcr产物进行切胶纯化后送交成都擎科梓熙生物技术有限公司(北京，中国)进行测序，将所测序列提交到ncbigenbank数据库上进行blast比对，根据比对结果选取相似度最大且具有代表性的菌种利用mega5.10软件采用neighbor-joining(nj)法进行聚类分析。(5)纳米银合成过程监测将浸泡液与1mmol/l的agno3溶液按照9:1的比例混合反应后，在不同的时间点(0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h)取一定量样品，利用uv-2600紫外可见分光光度计对样品进行全波长扫描(检测范围300-600nm，扫描间隔2nm)，检测纳米银合成过程的变化。(6)纳米银合成条件的优化考察不同光照强度、ph、agno3溶液的浓度和温度对纳米银合成速率的影响，对这4个因素进行优化。不同的ph(使用naoh和冰醋酸调节)为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0；不同的agno3溶液的浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mmol/l；不同的光照强度为0、1000lux、1500lux、2000lux和不同的温度为4℃、25℃和50℃。分别在不同条件下反应48h后，取少量样品，利用紫外可见分光光度计对样品进行全波长扫描。(7)优化合成纳米银的表征利用透射电镜分析纳米银的微观形态：a、将样本滴在碳支持膜铜网放置3-5min，然后用滤纸吸去多余液体；b、将2％磷钨酸滴在碳支持膜铜网放置2-3min，用滤纸吸去多余液体，室温干燥；c、透射电子显微镜下观察，采集图像分析。下面结合纳米银抑菌活性分析对本发明作进一步描述。1、纳米银抑菌活性分析1.1纳米银抑制细菌采用平板孔阱扩散法分析纳米银抑制细菌的活性。挑取活化好的实验指示菌金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，120r/min振荡培养至od600值为0.1，分别取30μl金黄色葡萄球菌菌液和大肠杆菌菌液，用涂布棒均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，用直径为5mm的打孔器于平板中央打取一个孔，吸取4-agnps或13-agnps80μl注入孔中，试验重复三次，以注入cby4浸泡液或cby13浸泡液为阴性对照，以含等量ag+的硝酸银溶液为阳性对照。37℃培养24h后，用十字交叉法测量抑菌圈大小，计算平均值，实验设三次重复。1.2纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的抑制作用采用ttc法测定纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的影响以及mic。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液培养到od600＝0.1，各取100μl接种于96孔板中，分别加入100μl不同浓度的纳米银4-agnps和13-agnps，使其终浓度分别为1μg/ml、1.9μg/ml、3.8μg/ml、7.5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml和0.6μg/ml、1.2μg/ml、2.4μg/ml、4.8μg/ml、9.5μg/ml、19μg/ml、38μg/ml、76μg/ml，于生化培养箱中37℃静置培养24h，以无水乙醇作为对照。24h后在黑暗环境下配制1％的ttc溶液，每孔加入10μl，37℃，120r/min黑暗孵育4h，观察颜色变化，试验设三次重复。下面结合纳米银抗肿瘤活性分析对本发明作进一步描述。2、纳米银抗肿瘤活性分析2.1细胞的常规培养将hela(宫颈癌细胞)细胞接种于含10％胎牛血清的1640培养液中，在37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养、传代。待细胞处于对数生长期时用于实验。2.2细胞铺板纳米银处理前24h将处于对数生长期的hela细胞消化，制备成细胞悬液，并计数，调整细胞浓度为1′105/ml，将100μl细胞接种于96孔板中，使每孔细胞约1′104个，将细胞置于培养箱中培养。2.3纳米银处理(1)将纳米银4-agnps和13-agnps进行冷冻干燥，使用无菌超纯水对纳米银洗涤三次，然后，再将纳米银复溶到200μl超纯水中，并使用超声波进行分散，避免纳米银产生沉淀。(2)纳米银用完全培养基稀释至终浓度为7.8ng/μl、15.6ng/μl、31.3ng/μl、62.5ng/μl、125ng/μl、250ng/μl、500ng/μl，混匀在培养基中，24h之后进行观察。2.4cck8检测(1)向每孔中加入10μlcck8溶液(避免加样过程中产生气泡，影响读数)。(2)将培养板放置在培养箱中孵育2h。(3)利用酶标仪在450nm处读数。(4)计算纳米银对hela增殖的抑制率：抑制率＝(空白对照-试验)/空白对照*100％2.5、试验数据处理与分析试验数据处理及作图采用microsoftexcel2010进行，采用spss20.0统计分析软件对数据进行计算处理和相关分析。下面结合结果分析对本发明作进一步描述。3、结果与分析3.1川贝母内生真菌生物合成纳米银3.1.1合成纳米银的初筛通过对15株川贝母内生真菌的筛选，结果表明菌株cby4和cby13都具有生物合成纳米银的作用。分析发现，当cby4和cby13的浸泡液与agno3溶液反应4h后，浸泡液的颜色都发生了明显变化，由浅黄色变成了棕黄色，而空白对照颜色无变化。这是由于表面等离子体共振效应(spr)造成的，棕黄色是指示纳米银水溶液的特征颜色。混合液颜色的变化说明川贝母内生真菌cby4和cby13的浸泡液都与agno3溶液发生了化学反应，初步判定整个溶液体系有纳米银合成；利用uv-2600紫外可见分光光度计分别对cby4浸泡液和cby13浸泡液生物合成的纳米银进行鉴定。由图2可以看出cby4浸泡液和agno3溶液的混合液在400nm处出现最大吸收峰，图3可以看出cby13浸泡液和agno3溶液的混合液在400nm处也出现了最大吸收峰，说明cby4和cby13两株菌株的浸泡液都能合成纳米银粒子。将cby4浸泡液合成的纳米银命名为4-agnps，cby13浸泡液合成的纳米银命名为13-agnps。3.1.2内生真菌的形态学鉴定经过课题组前期鉴定，cby4与f.tricinctumisolatehg52(accessionno.kx099672.1)聚类在一起，结合形态学特征，确认cby4为三线镰刀菌(f.tricinctum)，这里仅鉴定cby13菌株。将cby13菌株接种到pda培养基上，置于生化培养箱中28℃培养。结果发现，菌株cby13生长迅速，7d长满了整个培养基，大量气菌丝呈白色绒毛状或棉絮状，能够产生红色素并分泌到培养基中，显微结构如图4。从图中可以看到大型分生孢子散生于气生菌丝上或生于分生孢子座上，分隔明显，有1-2个隔，呈镰刀状；小型分生孢子形成于气生菌丝上，以假头状方式着生，呈肾形和卵形，有1-2个隔膜。3.1.3分子生物学鉴定将菌株cby13的its1-5.8srdna-its2序列提交到ncbigenbank数据库上，得到序列编号(accessionno.):mh059783。将其在ncbigenbank数据库数据上进行blast比对，分析结果后发现其与fusariumtricinctumisolatesh10(accessionno.kp193137.1)的相似度最大，达到99％。同时选取前12株相似度高且具有代表性的序列利用mega5.1软件采用neighbor-joining(nj)法构建系统进化树(图7)。结果显示cby13与菌株fusariumtricinctumstrainnrrl25481(accessionno.hm068317.1)聚类在一起。所以结合形态学特征，确认cby13为三线镰刀菌(f.tricinctum)。如图5.3.1.4纳米银合成过程监测从图6可以看出，川贝母内生真菌cby4的浸泡液与agno3溶液混合反应4h后，也开始有纳米银合成，这说明利用cby4的浸泡液可以与agno3溶液生物合成纳米银。，同样从图6中可以看出，随着反应时间的延长，各条uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值逐渐增大，说明随着时间的增加合成的纳米银产量也逐渐增加。但从48h到72h之间，峰值增加量很少，说明48h后，合成纳米银的反应已接近完成。从图中还可以看到，从4h到72h，不同时间点uv-vis吸收光谱曲线的最大吸收峰都接近于400nm，峰的位置没有发生明显的偏移，说明合成的纳米银粒径比较均匀、未发生明显的团聚现象，稳定性良好。从图7可以看出，川贝母内生真菌cby13的浸泡液与agno3溶液混合反应4h后，开始有纳米银合成，这说明利用cby13的浸泡液可以与agno3溶液生物合成纳米银。并且从图7中可以看出，随着反应时间的延长，吸收峰的峰值逐渐增大，说明随着时间的增加合成的纳米银产量逐渐增加。但从48h到72h之间，峰值增加幅度降低，说明48h后，合成纳米银的反应已减缓。同时，从图中可以看到，从4h到72h，不同时间点uv-vis吸收光谱曲线的最大吸收峰都接近于400nm，峰的位置没有发生明显的偏移，说明合成的纳米银粒径比较均匀、未发生明显的团聚现象，稳定性良好。3.1.5纳米银合成条件的优化3.1.5.14-agnps合成条件的优化常温常压条件下，改变cby4浸泡液的ph。从图8中可以看出，cby4浸泡液的ph不同对纳米银合成的影响非常显著，随着反应体系ph的增加，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值先增大后减小，表明反应体系中纳米银的合成量先增加后减少。当ph小于6时，纳米银的吸收峰强度不断加强，合成量增加。当ph大于6时，纳米银的吸收峰位置未发生偏移，但峰值不断减小。纳米银的合成量在ph等于6时达到最大，说明相对而言ph为6时更适合纳米银的合成。固定cby4浸泡液的ph为6，改变agno3溶液的浓度。从图9中可以看出，当agno3溶液浓度低于2.5mmol/l时，随着浓度的增加，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值先增大后减小，在浓度为2mmol/l时，峰值达到最大，但峰的位置基本不变，说明合成的纳米银粒子粒径并未改变。当agno3溶液浓度高于2.5mmol/l时，吸收峰发生红移，说明合成的纳米银粒子粒径变大。粒径越大，相应的抑菌性将会减弱。因此，agno3溶液浓度为2mmol/l时相对更适合纳米银的合成。固定ph为6，agno3溶液浓度为2mmol/l,改变光照强度。从图10中可以看出，随着光照强度的增强，合成反应速率加快，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值不断增大，说明纳米银的合成量不断增加，但从1500lux增加至2000lux时，合成量的增加已经极少。从经济的角度考虑，选用光照强度为2000lux，不再继续提高光强。固定ph为6，agno3溶液浓度为2mmol/l,光照强度为2000lux，改变温度。从图11中可以看出，随着温度的增加，合成反应速率加快，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值在增大，说明纳米银的合成量有增加。但从25℃增加至50℃时，合成量的增加已较少。从经济的角度考虑，建议选用温度为50℃，不再继续提高温度。3.1.5.213-agnps合成条件的优化常温常压条件下，改变cby13浸泡液的ph。从图12中可以看出，cby13浸泡液的ph不同对纳米银合成的影响非常显著，随着反应体系ph的增加，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值先增大后减小，表明反应体系中纳米银的合成量先增加后减少。当ph小于6时，纳米银的合成很少，吸收峰不明显。当ph大于6时，纳米银的吸收峰位置未发生偏移，但峰值不断减小。纳米银的合成量在ph等于6时达到最大，说明相对而言ph为6时更适合纳米银的合成。固定cby13浸泡液的ph为6，改变agno3溶液的浓度。从图13中可以看出，当agno3溶液浓度低于2.5mmol/l时，随着浓度的增加，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值先增大后减小，在浓度为2mmol/l时，峰值达到最大，但峰的位置基本不变，说明合成的纳米银粒子粒径并未改变。当agno3溶液浓度高于2.5mmol/l时，吸收峰发生红移，说明合成的纳米银粒子粒径变大。panacek等通过试验证明纳米银的粒径大小影响其抑菌效果，通常粒径越小，抑菌性越强。因此，agno3溶液浓度为2mmol/l时相对更适合纳米银的合成。固定ph为6，agno3溶液浓度为2mmol/l,改变光照强度。从图14中可以看出，随着光照强度的增强，合成反应速率加快，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值在增大，说明纳米银的合成量有增加。因此，光照强度为2000lux时相对更适合纳米银合成。固定ph为6，agno3溶液浓度为2mmol/l,光照强度为2000lux，改变温度。从图15中可以看出，随着温度的增加，合成反应速率加快，纳米银的uv-vis吸收光谱曲线的吸收峰的峰值在增大，说明纳米银的合成量有增加。因此，温度为50℃时相对更适合纳米银合成。3.1.6优化合成纳米银的表征根据上述合成条件优化的结果，结合实验室仪器设备温度光照的条件，分别将cby4和cby13的浸泡液ph调节至6，与浓度为2mmol/l的agno3溶液在2000lux、光照强度为50℃的条件下反应48h，将获得的纳米银粒子进行透射电镜。从图16可以看出，4-agnps为球形或近球形，大小较为均匀，平均粒径为10-40nm，分散情况良好，呈单一分散状态。从图17可以看出，13-agnps为球形或近球形，粒径分布范围较大，为20-80nm，有较为明显的团聚现象。3.2纳米银抑菌活性分析3.2.1纳米银抑制细菌由表1可以看出cby4浸泡液具有微弱的抑菌活性，能够形成极小的抑菌圈，平均抑菌直径分别为10.28mm和9.53mm；而13-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌则具有明显的抑菌活性，平均抑菌直径分别为19.33mm和19.97mm；相应的agno3溶液的平均抑菌圈直径分别为19.87mm和19.41mm。4-agnps和agno3的抑菌效果非常接近，但纳米银具有更好的生物安全性，应用范围更广。如图18、19、20所示；表14-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径(n＝3)table1themeaninhibitionzoneof4-agnpsagainsts.aureusande.coli(n＝3)表213-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径(n＝3)table2themeaninhibitionzoneof13-agnpsagainsts.aureusande.coli(n＝3)3.2.2纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的抑制作用由图20可以看出无水乙醇对照组，生物膜的形成被完全抑制，未形成生物膜被ttc染色。而低浓度的4-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜未产生抑制作用，形成的生物膜被ttc染成粉色或红色。当4-agnps浓度大于38μg/ml时，大肠杆菌生物膜的形成被抑制，故38μg/ml为4-agnps对大肠杆菌的mic；4-agnps浓度大于78μg/ml时，金黄色葡萄球菌生物膜的形成被抑制，故76μg/ml为4-agnps对大肠杆菌的mic。由图21可以看出无水乙醇对照组，生物膜的形成被完全抑制，未形成生物膜被ttc染色。而低浓度的13-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜未产生抑制作用，形成的生物膜被ttc染成粉色或红色。当13-agnps浓度大于30μg/ml时，大肠杆菌生物膜的形成被抑制，故30μg/ml为13-agnps对大肠杆菌的mic；13-agnps浓度大于60μg/ml时，金黄色葡萄球菌生物膜的形成被抑制，故60μg/ml为13-agnps对大肠杆菌的mic。3.3纳米银抗肿瘤活性分析3.2.1cck8检测纳米银对hela细胞增殖的抑制作用利用cck8检测发现，纳米银4-agnps和13-agnps在对hela细胞作用24h后，均对其增殖生长产生一定的抑制作用。从图22可以看出，当纳米银终浓度为7.8ng/μl时od450的吸光值与空白对照的值基本一致，随着纳米银浓度的升高，od450的吸光值在降低，表明hela活细胞的数量在减少，证明纳米银4-agnps和13-agnps对hela细胞的增殖都具有抑制作用，且随着浓度的增加，抑制作用增强。且13-agnps在不同浓度下对吸光值的影响差异显著，4-agnps在最低浓度和最高浓度下显著性差异，这进一步表明纳米银的浓度对hela的增殖有显著影响。人宫颈癌hela细胞与纳米银作用24h后在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，从图23和24可以看到，川贝母内生真菌合成的纳米银4-agnps和13-agnps均能显著抑制hela细胞的增殖生长。与对照相比，加入7.8ng/μl的纳米银4-agnps和13-agnps后，细胞数量变化不大，随着纳米银浓度的不断增加，细胞的数量不断减少，密度变小，当加入500ng/μl的4-agnps和13-agnps后，细胞有脱落，并且出现了变圆的情况，证明细胞有死亡以及凋亡的情况发生，这说明纳米银4-agnps和13-agnps具有抑制hela细胞生长的功能。从图25可以看出，纳米银4-agnps和13-agnps对hela细胞的抑制率与其浓度呈剂量依赖性，4-agnps和13-agnps均可抑制hela细胞的增殖生长，促进其凋亡，其抑制率与其浓度正相关且差异性显著。hela细胞对纳米银4-agnps反应更敏感。下面结合效果对本发明作进一步描述。4分析4.1川贝母内生真菌生物合成纳米银纳米银作为一种新型材料，因其具有不同于常规材料的热、光、电、磁、催化和敏感等特性，被广泛应用于催化剂材料、防静电材料、低温超导材料、电子浆料和生物传感器材料和生物医学等方面，市场需求量日益增大。目前，市面上合成纳米银材料一般采用的是传统的物理法和化学法，但是物理法和化学法都存在很大的弊端，比如成本高、污染大等，尽管许多专家学者都对物理法和化学法进行了一定程度的优化，但是还存在不可避免的问题。此时生物法应运而生，生物法就是利用生物材料和微生物体系与硝酸银溶液混合反应生成纳米银的一种无污染的化学反应。生物法因其价格便宜、操作简便、绿色无污染等优点受到越来越多的关注，成为纳米银合成的分析热点。近年来，利用各种植物浸提液、真菌、细菌等材料生物合成纳米银的报道层出不穷，越来越多的植物、真菌、细菌种类都被证实可以合成纳米银。姜宇等发现山楂的水提液和醇提液都可以生物合成纳米银。张杰等证实钩状木霉具有生物合成纳米银的功能。包京姗发现从人参中分离出来的尖孢镰刀菌可以生物合成纳米银。因此筛选出更多具有合成纳米银功能的植物、真菌种类，对纳米银的制备具有重要意义，这是一个极具潜力的分析方向。本发明结合前人已有的经验，对实验室保存的15株川贝母内生真菌进行筛选，利用15株菌株的二次发酵液与硝酸银溶液以9:1的比例混合反应，将溶液颜色变化(颜色由浅黄色变为黄色、深黄色)和uv-vis吸收光谱(400-500nm处有特征性吸收峰)作为初步判定标准，发现两株内生真菌cby4和cby13都具有合成纳米银的功能。通过传统的形态学鉴定和its测序的分子生物学鉴定相结合，鉴定结果表明cby4和cby13这两株菌都为三线镰刀菌(f.tricinctum)，但因为这两株菌分离自不同的样品材料，可以推测镰刀菌是较易在实验室从川贝母中分离得到的优势菌种，同时也是较易生物合成纳米银的优势菌种。4.2纳米银合成条件的优化对于筛选得到的两株三线镰刀菌cby4和cby13，都能与硝酸银反应合成纳米银。为了更加快速高效地制备大量纳米银，我们有必要对纳米银合成条件进行优化改进。一般对生物合成纳米银的条件优化都是从温度、光照等常见条件进行设置的。刘小莉等从光照、ph和温度三个方面对合成条件进行了优化，发现这三个条件的改变都能影响合成纳米银的形态和功能[33]。杨素玲等从硝酸银浓度、ph值、光照和微波辐照四个方面探讨了合成纳米银的影响因素[106]。为了最大程度优化，本发明分别从浸泡液ph、硝酸银溶液浓度、光照强度和温度这4方面进行优化。结果发现不同条件下，纳米银的合成量具有显著差异。1)菌株浸泡液的ph可以影响浸泡液中酶的活性以及对硝酸银的利用速率，在ph3-11的范围内，4-agnps和13-agnps的合成量均呈现出现增大后减少的趋势，且在ph为6时吸收峰峰值达到最大。2)硝酸银溶液的浓度直接影响反应中可用的ag+数量，分别设置0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.5mmol/l的浓度梯度，在0.5-2.5mmol/l的范围内，纳米银的合成均是先增大后较少，但当硝酸银浓度达到3mmol/l后，合成纳米银的粒径便会增大，而纳米银的粒径通常与其抑菌性有关，表现为粒径越小，抑菌性越强。在uv-vis吸收图谱中可以看到当硝酸银溶液浓度为2mmol/l时，制得的4-agnps合成量最大、粒径,最小，13-agnps合成量较大、粒径最小。3)光照强度是一种合成纳米粒子的重要辅助手段[33]，可以提高纳米银的合成速率和产量，在2000lux光照强度范围内，随着光照强度增强，4-agnps和13-agnps的合成量都在增加；4)温度可以影响混合液中参与反应的浸泡液中酶的活性，利用光照培养箱设置4、25和50℃三个温度梯度，结果发现，随着温度增加，4-agnps和13-agnps的合成量都在增加。考虑到4-agnps在50℃和2000lux的光照强度下合成量增加不显著，从经济的角度并结合实验室设备条件的原因，最终确定选择ph为6、硝酸银浓度为2mmol/l、光强为2000lux、50℃条件相对更适合用于4-agnps和13-agnps的生物合成。4.3纳米银抑菌活性近年来随着抗生素的滥用，越来越多的耐药微生物不断产生，市场亟待新型抗菌剂的开发和利用，纳米抑菌材料具有高效、持久、广谱、无耐药性的抑菌优点，现已被广泛应用于医用材料消毒、抗菌织物、抗菌瓷砖等抗菌领域，此外纳米材料还有望作为抗生素的替代品，在抗菌药物研发方面起到重要作用。有分析表明利用禾谷镰刀菌合成的纳米银对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌具有显著的抑制作用，说明纳米银具有良好的抑菌作用。本发明利用优化合成的纳米银4-agnps和13-agnps进行了抑菌活性的初步检测。选用常规的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)作为抑菌试验指示菌。先利用平板孔阱扩散法初步检测到4-agnps和13-agnps均对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌产生了抑制作用，且与agno3溶液的抑菌效果相差无异，表现出良好的抑菌效果。采用ttc法检测4-agnps和13-agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的抑制作用。发现一定浓度的纳米银可以对两种指示菌的生物膜形成产生抑制作用。4-agnps抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的mic分别为76μg/ml和38μg/ml；13-agnps抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的mic分别为60μg/ml和30μg/ml。初步猜测纳米银对细菌的抑制作用可能是由于纳米银抑制细菌生物膜的形成产生的，具体机制还有待进一步分析。4.4纳米银抗肿瘤活性恶性肿瘤作为危害人类健康的重大隐患，细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生发展的关键，急需分析出更多能够有效抑制肿瘤细胞的“特效药”。此前已有实验证明白屈菜中分离得到的烟曲霉合成的纳米银可以显著抑制人卵巢癌细胞a2780的生长，具有良好的抗肿瘤活性[107]。本发明表明川贝母内生真菌合成的纳米银4-agnps和13-agnps均对人宫颈癌hela细胞的增殖生长具有明显的抑制作用，可以成功诱导癌细胞的凋亡，也具有良好的抗肿瘤活性。cck8检测结果发现，纳米银4-agnps和13-agnps均对人宫颈癌hela细胞的生长起到抑制作用，当纳米银浓度很低时，hela细胞的od450与空白对照一致，但随着纳米银浓度的增大，对hela细胞的抑制率明显升高，抑制率与浓度呈正相关。且hela细胞对4-agnps的反应更敏感。在倒置显微镜下观察，纳米银4-agnps和13-agnps作用hela细胞24h后，与对照相比，随着纳米银浓度的增加，细胞数量逐渐减少，密度变小。在加入500ng/μl的4-agnps和13-agnps后，细胞有脱落，出现凋亡，说明川贝母内生真菌合成的纳米银4-agnps和13-agnps能够有效抑制hela细胞的生长。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。<110>四川农业大学<120>发明名称：一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用<160>2<210>1；<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tccgtaggtgaacctgcgg<210>2；<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tcctccgcttattgatatgc当前第1页12当前第1页12