一株猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用的制作方法

本发明属于病毒疫苗技术领域，尤其涉及一株猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的急性、高度接触性的猪肠道传染病。pedv可以感染各年龄段的猪，但哺乳仔猪更易感染，其死亡率和发病率接近100％。1971年该病首次在英国被发现，随后蔓延至欧洲及亚洲部分国家。2013年美国首次报道了pedv感染，而后该病迅速蔓延至全美，造成了严重经济损失，从而使得pedv受到世界各国的关注。我国2010年就曾爆发过严重的ped疫情。近年来，ped的流行更是越来越广泛，新的变异株不断出现，商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，免疫效果不佳，从而严重影响着我国养猪业的健康发展。目前市售猪流行性腹泻疫苗几乎全部使用的是经典毒株，与流行毒株存在基因型差异，进而导致疫苗免疫效果较差。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一株新的、有效候选疫苗猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017，所述病毒毒株pedvch/hnpj/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.16216。

本发明还提供了一种包括上述病毒毒株基因组的重组载体。

本发明提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：

1)从上述的病毒毒株中提取获得rna；

2)反转录所述rna获得cdna，

3)扩增所述cdna获得pedv全基因组dna；

4)将所述pedv全基因组dna与载体连接获得重组载体。

优选的，步骤2)中所述反转录的温度为40～44℃，所述反转录的时间为55～65min。

优选的，步骤2)中所述反转录的体系包括以下组分：

所述反转录引物的浓度为10μm，所述反转录引物为pedv-21438r，具体的核苷酸序列为taccatgcaccaaagtggaatcat。

优选的，步骤3)中扩增所述cdna的体系包括以下组分：

所述正向引物和反向引物的浓度为为10μm。

优选的，步骤3)中扩增所述cdna的程序包括：

优选的，所述正向引物为pedv-20320f，具体序列为aacacgtcatcgtcagaggc；所述反向引物为pedv-21438r，具体核苷酸序列为taccatgcaccaaagtggaatcat。

本发明还提供了所述猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

本发明还提供了所述重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017在转染细胞的第一代，细胞就表现出显著的细胞病变，说明本发明提供的病毒毒株毒力较强；经遗传进化分析，所述病毒毒株位于g2b亚群，与中国疫苗经典毒株cv777分属于不同的群，与aj1102和chgd-01毒株亲缘关系较近，亲缘关系更接近2010年后爆发的猪流行性腹泻疫情中分离获得的猪流行性腹泻病毒毒株，与现有流行毒株存在的基因型差异较小，可应用于制备猪流行性腹泻疫苗，免疫效果好。

附图说明

图1为pedvch/hnpj/2017毒株p70代细胞病变图；

图2为pedvch/hnpj/2017毒株全基因组序列扩增电泳图；

图3为pedvch/hnpj/2017毒株系统进化树图谱；

图4为pedvch/hnpj/2017毒株s基因序列比对；

图5为pedvch/hnpj/2017毒株的生长曲线；

图6为pedvch/hnpj/2017毒株各代次tcid50值；

图7为pedvch/hnpj/2017毒株ifa鉴定；

图8为电子显微镜观察pedvch/hnpj/2017病毒粒子形态；

图9为pedvch/hnpj/2017毒株致病性分析；

图10为感染pedvch/hnpj/2017病毒仔猪肠道病理变化。

生物保藏说明

本发明提供的猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017于2018年08月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.16216。

具体实施方式

本发明提供了一株猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017，所述病毒毒株pedvch/hnpj/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.16216。

本发明中所述病毒毒株pedvch/hnpj/2017来源于中国湖南省平江pedv阳性毒株的样品，本发明中分离和培养所述病毒毒株pedvch/hnpj/2017的细胞优选为vero细胞。本发明中，传代培养所述vero细胞的培养基优选为dmem培养基，所述dmem培养基中优选的还包括体积百分含量为10％的fbs和体积百分含量为1％双抗的。

本发明中所述病毒毒株的培养方法包括以下步骤：将所述pedv阳性毒株的样品和胰酶加入含1％双抗，不含fbs的dmem培养基中震荡混匀获得混合液；然后将生长状态良好的单层vero细胞加入混合液后置于含有5％co2的37℃温箱孵育；孵育结束后加入新鲜的含1％双抗，不含fbs的dmem培养基培养，当细胞病变大于90％，收集病毒液。在本发明中，所述pedv阳性毒株的样品与dmem培养基的体积比优选为1：(4～6)，更优选为1:5。在本发明中，所述混合液中胰酶的浓度优选为15～25μg/ml，更优选为20μg/ml。本发明中所述孵育的时间优选为50～70min，更优选为60min，所述孵育过程中，优选的每20min摇匀一次。本发明中所述孵育结束后加入新鲜dmem培养基的体积优选为初始dmem培养基体积的1.8～2.2倍，更优选为2倍。

本发明还提供了一种包括上述病毒毒株基因组的重组载体。所述重组载体包括上述病毒毒株基因组，转染到细胞中，具有上述病毒毒株的毒力。

本发明提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：1)从上述的病毒毒株中提取获得rna；2)反转录所述rna获得cdna，3)扩增所述cdna获得pedv全基因组dna；4)将所述pedv全基因组dna与载体连接获得重组载体。

本发明首先从上述的病毒毒株中提取获得rna；本发明对所述rna提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的病毒rna提取方法即可。在本发明具体实施过程中，所述rna提取优选的采用viralrnaminikit(qiagen,germany)rna提取试剂盒。

本发明在获得所述rna后，反转录所述rna获得cdna。在本发明中，所述反转录的温度优选为40～44℃，更优选为42℃，所述反转录的时间优选为55～65min，更优选为60min。在本发明中，所述反转录的体系优选的包括以下组分：5×amvrtbuffer5μl；10mmdntp3μl；pedv-21438r(10μm)

2μl；amv反转录酶0.5μl；rna酶抑制剂0.5μl；depc水7μl；rna模板7μl。

本发明在所述反转录结束后，扩增所述cdna获得pedv全基因组dna。在本发明中扩增所述cdna的体系优选的包括以下组分：10×gxlbuffer10μl；2.5mmdntp4μl；pedv-20320f(10μm)2μl；pedv-21438r(10μm)2μl；gxl高保真酶2μl；depc水27μl；cdna模板3μl。本发明中，扩增所述cdna的程序优选的包括：

68℃2min。在本发明中，所述延伸时间可根据扩增片段的大小调整，一般10s可扩增1kb。

本发明在获得所述pedv全基因组dna后，将所述pedv全基因组dna与载体连接获得重组载体。在本发明中，所述载体优选为平末端连接载体，更优选为pcr-xl-2topo载体。本发明中所述连接的温度优选为15～17℃，更优选为16℃；所述连接的时间优选为28～32min，更优选为30min。

本发明在获得所述重组载体后，优选的还包括将所述重组载体转入大肠杆菌dh-5α感受态细胞中进行扩增，本发明在所述扩增后，利用酶切鉴定正确的重组载体，将所述正确的重组载体送至生物测序公司进行测序获得病毒毒株pedvch/hnpj/2017的全基因组序列。

本发明还提供了所述猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。在本发明中，所述疫苗优选为减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。在本发明中所述猪流行性腹泻病毒毒株pedvch/hnpj/2017通过减毒、灭活或者克隆其基因组中部分具有免疫原性的基因制备获得减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。

本发明还提供了所述重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。本发明中包括所述病毒毒株pedvch/hnpj/2017的全基因组序列，可应用于大量扩增繁殖所述病毒毒株pedvch/hnpj/2017的全基因组序列，从而在短时间内获得大量需要的病毒毒株pedvch/hnpj/2017。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1病毒毒株pedvch/hnpj/2017的分离和培养

1病料与细胞

病料采集自中国湖南省平江，11份含有pedv阳性毒株的样品用于pedv的分离鉴定。

vero细胞由本实验室冷冻保存。该细胞由含体积比为10％的fbs和1％双抗的dmem培养基进行传代培养。

具体培养过程如下：1、取0.5ml冻存含有pedv阳性毒株的样品，加入2.5ml不含fbs的dmem培养基(含1％双抗)及终浓度则为20μg/ml的胰酶，震荡混匀之后室温放置备用；2、取出生长状态良好且几乎铺满细胞瓶的单层细胞，用接近室温的dpbs洗涤3遍后，加入步骤1中准备的病毒液，然后置于含有5％co2的37℃温箱孵育1h，每隔20min摇匀一次；3、孵育结束后补加5ml新鲜的不含fbs的dmem培养基(含1％双抗)后置于温箱孵育培养；4、观察细胞是否出现cpe，当cpe达到90％即可收集病毒液。11份含有pedv阳性毒株的样品仅有一份显示出cpe，收集该样品培养获得的病毒液，并将所述病毒保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.16216。所述pedvch/hnpj/2017病毒毒株在第一代就出现了典型cpe，选择该毒株继续进行传代培养，目前已经传至75代，正致力于毒株的致弱。该毒株在细胞中从hpi12开始出现cpe，细胞皱缩且变圆，聚集成团，形成合胞体；随着感染时间增加，细胞病变面积增大，hpi48细胞已经完全病变，并且出现脱落现象，形成细胞空泡(见图1)。

pedvch/hnpj/2017毒株的纯化

待生长状态良好的vero细胞于6孔板单层铺满80％时，用dpbs清洗3次，每孔依次加入500μl10倍梯度稀释的病毒液(胰酶浓度：20ug/ml)，置于含有5％co2的37℃培养箱孵育1小时。孵育后弃掉培养液，dpbs清洗1次，每孔加入2ml含有dmem(胰酶浓度：20ug/ml)的1.5％低熔点胶。在室温下放置15分钟，待胶凝固后将其倒置放入温箱继续培养观察。待六孔板中出现cpe时，用无菌枪头挑取最低稀释度噬斑于1.5mlep管中。

实施例2pedvch/hnpj/2017毒株全基因组序列测定及拼接

根据多条pedv序列比对结果选取保守区域，设计相应扩增引物进行pedv全基因组序列扩增，具体扩增程序如下：

1、将提取的病毒rna样品进行反转录，反应条件为42℃、60min，反应体系如下

2、将反转录得到的cdna模板进行pcr，反应体系及反应条件如下。

pcr扩增条件：

延伸时间可根据扩增片段的大小调整，一般10s可扩增1kb

引物情况如表1所示。将ch/hnpj/2017毒株田间粪便样品以及细胞培养病毒液rna提取后，利用全基因组特异性引物进行rt-pcr反应。选用平末端连接载体pcr-xl-2topo载体进行pcr片段的亚克隆，将酶切鉴定正确的质粒送至公司测序。

具体的亚克隆的方法步骤和参数如下：

(1)目的基因的纯化

a.切胶回收pcr阳性产物，称重；

b.以体积比3:1加入bufferl3，于50℃水浴10min，每隔3min翻转；待胶溶解后，再加热5min或加入1体积的异丙醇，以确保胶彻底溶解；

c.将溶解后的液体加入mini柱中，12000rpm/min离心1min，弃掉收集管中的液体；

d.加入500μl洗脱液(w1)，12000rpm/min离心1min，弃掉收集管中的液体；

e.12000rpm/min空离2-3min后，将mini离心柱放入1.5ml微量离心管中；

f.加入50μl洗脱液(e1)，室温下静置1min后，12000rpm/min离心1min，收集滤液置于-20℃备用。

(2)连接反应

取1μl上述加pcr产物到新的microtube中，加入1μlpcr-xl-2topo载体和3μl灭菌蒸馏水，混匀(可适当调整添加量，只要pcr产物和灭菌蒸馏水总体积是4μl即可)。加入5μlligationmigthymix，轻轻混匀，于16℃反应30分钟。

(3)转化

第一步：将dh-5α感受态细胞置于冰上融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟；

第二步：42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰上，冰浴2-3分钟；

第三步：加入450μl无菌soc培养基，混匀后置于37℃摇床，200rpm/min振荡培养45分钟，使菌体复苏；

第四步：取100ul菌液涂布于含有氨苄抗生素的lb培养平板，于37℃温箱倒置培养12-16小时。

(4)质粒提取

从上述步骤的平板中挑取单个菌落置于2ml含氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃以200rpm/min振荡培养12-16h。按质粒提取试剂盒说明进行操作。具体步骤如下：

a.取1.5ml在lb培养基中培养过夜的菌液，12,000rpm/min离心1min，弃上清；

b.向mini柱中加入250μlbuffers1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；

c.加入250μlbuffers2，温和并充分的上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮溶液。此步骤不宜超过5min；

d.加350μlbuffers3，温和并充分的上下翻转混合6-8次，12,000rpm/min离心10min；

e.吸取离心后上清并转移到制备管中，12,000rpm/min离心1min，弃掉收集管中的液体并将离心柱放回收集管中；

f.加入500μlbufferw1至离心柱中，12,000rpm/min离心1min，弃掉收集管中的液体并将离心柱放回收集管中；

g.加700μlbufferw2，12,000rpm/min离心1min，弃滤液，在重复一遍该步骤；

h.将收集管置于离心机中，12,000rpm/min空载离心1min；

i.将离心柱置于新的1.5ml离心管中，加60μl洗脱液，静置1min，12,000rpm/min离心1min获得质粒。

(5)酶切鉴定及测序

将上述步骤中提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下表。酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳后，阳性质粒送往上海生工生物科技有限公司测序。酶切体系如下：

表1pedv病毒毒株全基因组扩增引物

从genebank获取24株国内外具有代表性的pedv毒株全基因组序列(见表2与本实验ch/hnpj/2017毒株的全基因组序列利用mega6.0软件进行序列比对及邻接法(bootstrapreplication：1000)构建系统进化树。

表224株国内外具有代表性的pedv毒株全基因组序列信息

试验结果：利用设计的特异性引物扩增ch/hnpj/2017毒株的全基因组序列，每隔10代测定一次，扩增片段如图2所示。将测定序列拼接成完整的全基因组序列，利用mega6.0软件与已知的pedv毒株全基因组序列比对且构建系统进化树。结果显示，该ch/hnpj/2017毒株位于g2b亚群，与aj1102和chgd-01毒株亲缘关系较近(图3)。自从2010年后，分离到的pedv流行毒株多数处于g2群，而与中国疫苗毒株cv777分属于不同的群，所以现有的pedv疫苗未能提供有效的保护力，导致ped疫情的爆发。另外，ch/hnpj/2017毒株在适应细胞过程中于p6代时s基因中插入了12个核苷酸(图4)。在以往的报道中，pedv毒株在适应细胞过程中s基因出现缺失现象，这是首次发现pedv毒株在适应细胞过程中出现插入突变。

实施例3pedvch/hnpj/2017毒株的性能测定

生长曲线：

将铺满单层细胞的60dish用pbs清洗3次，加入500μl病毒液(胰酶浓度20ug/ml)，37℃孵育1小时后，补加1.5mlmm，置于含有5％co237℃培养。在感染后12h、24h、36h、48h和60h，收集毒液，置于-80℃冰箱内保存备用。运用qpcr测定病毒含量，绘制不同代次pedvch/hnpj/2017毒株的生长曲线，每隔10代测定一次。

结果：每隔10代接种单层细胞，测定ch/hnpj/2017毒株生长曲线。自接毒孵育开始计算，每隔12h(12h、24h、36h、48h、60h、72h)间隔收毒，反复冻融3次，测定ct绘制生长曲线(如图5所示)。由图可知，在0-48h时，正常细胞开始出现cpe，随着感染时间增加病毒含量逐渐增多，病变细胞也同步增加。在接毒后48h培养基中pedv病毒含量最高，相对应的正常细胞几乎90％病变；峰值过后，随着时间的延长细胞开始脱落从而毒粒子含量开始下降。

tcid50的测定：

1、将经冻融收集的病毒液室温融化，3500rpm离心2分钟，取上清

2、用dmem培养基(胰酶浓度20ug/ml)将病毒作连续10倍稀释，即10^-1，10^-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。

3、弃掉细胞培养液，pbs清洗2次；再用维持培养基(mm)洗一次，弃掉(保证孔内无液体残留)。

4、每个稀释度取100μl加入96孔板，每个稀释度作8个重复。在补加100μlmm，终体积为200μl。并设置空白对照，即200μlmm。

5、置于含有5％co237℃培养。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。一般需观察5-7天。结果的计算用reed-muench两氏法。

结果由图6所示，随着培养代数的增加，病毒滴度逐渐增加，并趋于稳定，可以达到10⁷tcid50/ml。

7免疫荧光检查(ifa)

1、在6孔板中接种毒液，待细胞出现cpe后，弃掉维持培养基；

2、每孔加入1ml固定剂即4％多聚甲醛，放置于4℃冰箱，固定30min；

3、弃掉固定液，每孔加入1ml通透剂即0.25％tripon-100，室温通透10min，pbs洗板3次，每次5min；

4、5％bsa封闭60min，或10％bsa封闭30min，每孔1ml，封闭后，pbs洗板3次，每次5min；

5、每孔加入1ml以1:2000或1:5000稀释的抗pedvn蛋白单克隆抗体，37℃孵育60min(或4℃过夜)。pbs洗板3次，每次5min；

6、在避光条件下，每孔加入1ml以1:2000稀释的488标记的抗鼠二抗，37℃孵育60min，

pbs洗板3次，每次5min；

7、每孔加入两滴dapi(用少许pbs稀释)，室温5min,pbs洗板3次，每次5min，后荧光显微镜观察。

结果由图7结果显示，pedv感染细胞后均检测到了特异性绿色荧光。同时，随着感染时间的增加，视野中绿色荧光越多，表明pedv含量越高。

8电镜检测病毒粒子

1、收集400毫升病毒液，反复冻融三次，10000rpm于4℃离心1小时，收集细胞上清液。收集的细胞上清液过0.22um滤膜。将50％peg-8000加入病毒上清液中，使其终浓度为10％，过夜沉淀病毒，4℃温和搅拌过夜。

2、将上述病毒液-peg8000混合液放入250ml离心管，12000rpm于4℃离心2h沉淀病毒。

3、tbs悬浮病毒沉淀，制备病毒-tbs混合液，4℃搅拌30min。

4、第一次蔗糖密度离心：将0.5m蔗糖溶液加到病毒上清液的底部，超速离心30000rpm3小时，4度。弃掉上清，用ph7.5tbs充分重悬沉淀，然后4℃3000rpm离心10min。

5、第二次蔗糖密度离心：将上述tbs重悬液加入到离心管中(提前加入40％和50％的蔗糖溶液)，30000rpm,4度，离心3小时。离心后吸取病毒带。

6、用尖头镊子夹取铜网置于封口膜上(铜网正面向上)，吸取约10ul毒液滴于铜网上，吸附约15min(操作过程要时刻注意不能混淆正反面)。

7、吸附时间到后用滤纸把铜网上面毒液吸干，然后风干约10min；

8、风干后吸取10μl2％磷钨酸钠水溶液滴于铜网上负染约20min；

9、负染时间到用滤纸吸干铜网上的溶液，风干约10min，夹取铜网置于铜网盒里面送去电镜。

结果显示ch/hnpj/2017病毒粒子形状大致呈椭圆形，直径约100nm左右，四周有明显的似皇冠状的纤突，为冠状病毒的典型特征(图8-a)。

将pedvch/hnpj/2017毒株接种于单层vero细胞，待细胞病变后10％多聚甲醛固定，利用电镜检测细胞中pedv病毒粒子。结果显示在细胞浆及细胞膜处可观察到病毒粒子，呈圆形或椭圆形(图8-b)。

实施例4pedvch/hnpj/2017毒株对仔猪致病性分析

1实验动物的筛选

在规模化猪场采集血清及粪便样品，利用elisa试剂盒检测仔猪血清是否存在pedv抗体，且利用qpcr检测仔猪是否存在pedv的感染。选取检测合格的7日龄仔猪提前在动物房饲养3天，确保实验动物适应周边环境，减少应激反应。

2实验动物的分组

将选取的7日龄仔猪随机分为2组，即g1、g2。每组4头仔猪，每组仔猪进行编号以便区分。g1为实验组，g2为对照组。

3攻毒方式及剂量

将pedvch/hnpj/2017毒株p30代毒液用pbs10倍稀释，每头份2ml毒液，口服攻毒。对照组口服pbs。

4动物实验数据收集

自攻毒日起，观察仔猪精神状态、饮食是否发现变化，是否出现腹泻症状。每天分三个时间段(9:00、15:00以及21:00)棉签拭子采集粪便样品，采集的粪便样品用2ml含双抗的dmem处理，3500rpm/min离心30min，吸取上清液置于-80℃保存备用。提取rna，实时荧光定量pcr检测仔猪是否存在pedv感染。在仔猪频临死亡时，心脏处死，立刻剖检，观察肠道宏观变化。将肠道按十二指肠、空肠、回肠、盲肠以及结肠分别取2-3cm，置于10％甲醛溶液固定保存，进行组织病理观察。

实验结果：

仔猪攻毒前毛色、采食、体重均正常，且好动。攻毒后24h仔猪开始发病，粪便样品变稀，个别仔猪精神萎靡，食欲减退，肛门处发红。攻毒后48h，实验组所有仔猪均发病，出现严重的黄色水样腹泻，呈喷射状，且气味恶臭；肛门部位出现肿胀发红，后肢粪便污染严重；部分仔猪食欲废绝，进食后出现不同程度的呕吐现象；所有仔猪出现严重的消瘦，被毛脏乱无规则，喜卧，后肢无力，站立不稳，严重者后肢瘫倒在地，只能靠前肢滑行(见图9)。对照组实验仔猪精神状态良好，饮食正常。

将频临死亡的仔猪心脏处死，进行剖检。如图9所示，肠粘膜充血肿胀，肠壁变薄变透亮，内含大量黄色水样内容物；肠系膜淋巴结出现不同程度的肿大。

将频临死亡的仔猪剖检后，取肠道2-3cm，置于10％甲醛溶液固定保存，进行组织病理观察。结果显示(图10)，肠粘膜上皮细胞变性，炎性细胞浸润且以淋巴细胞为主，甚至可见坏死或脱落；粘膜内毛细血管扩张、充血，上皮细胞空泡变性，肠绒毛结构较模糊、固有层肠腺体内分泌细胞减少，粘膜内杯状细胞排列紊乱、数量减少。对照组粘膜表面被覆柱状上皮、固有层及粘膜肌层结构完整，肠上皮细胞和杯状细胞数量正常、未见坏死脱落。利用pedv抗n蛋白单克隆抗体和抗pedv多克隆抗体进行免疫组化实验，ihc结果表明pedv病毒粒子主要存在肠粘膜上皮细胞中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一株猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taccatgcaccaaagtggaatcat24

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aacacgtcatcgtcagaggc20

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taccatgcaccaaagtggaatcat24

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcaagtgctgtgctgtcctcta22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gaggtgtgatggtgccactaca22

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gcatgacggctgttgttgtagtaa24

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cgaaccagttgccagtcacacta23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gaagtctacaactatttggcaga23

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

cagacattgctgtcaacactaa22

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

aggttgtgcaatgaattggctca23

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cagtaccatctctaacgagcactt24

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gacacctataatctgtggcaga22

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<211>21

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<213>人工序列(artificialsequence)

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ctcacgtagagtcaaggcaat21

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gtggtgatggcgagcacatt20

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<211>22

<212>dna

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<400>15

ataggctcgtcaagcggatctt22