一种体外模拟胃肠淀粉消化的方法与流程

本发明属于体外模拟消化技术领域，主要涉及一种体外模拟胃肠淀粉消化的方法

背景技术：

淀粉是人体能量的主要来源，在人体消化系统中被淀粉水解酶如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶水解，从而释放葡萄糖。淀粉的种类，加工方式等都会影响人体血糖与胰岛素的含量，而人体血糖与胰岛素的水平与糖尿病及其他心血管疾病都有着密不可分的关系。淀粉的消化主要分为三步，第一步由口腔中的唾液淀粉酶进行分解，产生少量的糊精、麦芽糖及葡萄糖；第二步在胃肠中进行，淀粉在胃中水解程度不同，而十二指肠中的胰腺淀粉酶是消化淀粉最主要的酶，将淀粉分解成糊精和麦芽糖。第三步在小肠粘膜上皮细胞进行，将糊精及麦芽糖分解成葡萄糖。

体外模拟消化过程的方法被广泛用于食物或药物在人体胃肠的行为研究。尽管人类营养研究仍是公认的解决与饮食相关问题的一个“黄金标准”，但体外方法具有更快速，便宜，劳动强度低且没有道德限制的优点。这使得可运用于测量相对大量的样品或者达到筛选的目的。体外模拟消化方法通常包括口腔，胃和小肠阶段，偶尔还有大肠发酵。该方法通过考虑淀粉水解酶的生存温度，ph值，盐浓度和消化时间以及其他因素来模拟生理条件。

面条作为世界性的主食，是一种公认的高gi(血糖生成指数)的食物，因此选择小麦面条作为本技术的材料，具有一定代表性。同时，结合高通量测定技术，具有节约试剂、简单快速、稳定灵敏、误差较小、方便快捷的优点。因此，一种体外模拟胃肠淀粉消化的方法可以为探究食物在人体胃肠中的行动提供一种高效、快捷、省时省力、成本较低的技术手段。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种体外模拟胃肠淀粉消化的方法，达到快速高效测定的目的。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

1、一种体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1))配置1l磷酸缓冲液(1m)，用cacl2进行10倍稀释，加入hcl/naoh，将ph调节至6.9；

(2)使用迷你搅拌器将生小麦面条搅拌成小面块，称重一定量的面条块并加入一定体积的磷酸缓冲液；

(3)将小面块煮沸并冷却至室温，用1.0mhcl将浆液的ph调节至1.5，并加入一定量的胃蛋白酶引发消化；

(4)将消化液在37℃水浴振荡器中振荡一定时间，消化结束后，向浆液中加入碳酸钾(1.0m)，将ph调节至6.9使胃蛋白酶失活，然后将浆液转移至snakeskintm透析袋，截留分子量为7kda；

(5)向浆液中加入胰腺α-淀粉酶来模拟小肠消化，将透析袋的两端密封并置于100ml磷酸缓冲液中，在37℃水浴振荡器振荡一定时间；

(6)以不同的时间间隔取出等分试样的透析液，并立即用相同量的新鲜缓冲液进行替换；

(7)在96孔板中加入一定比例的无酚dnsa试剂和取出的透析液并密封，在100℃下加热一定时间以产生红棕色，然后再冰水浴中冷却至室温；

(8)将100μl混合物溶液转移到新的96孔板中，在540nm下测量吸光度以衡量透析液中还原糖的含量。

2、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(1)所述的加入缓冲液的cacl2含量为35-40ppm。

3、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(2)所述的面条块的重量为0.4-0.6g，磷酸缓冲液的体积为4-6ml。

4、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(3)所述的加入胃蛋白的含量为3-4mg，3200u/mg。

5、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(4)所述的振荡的条件：转速为100-200rpm，振荡时间为1-2h。

6、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(5)所述的胰腺α-淀粉酶的含量为65-70mg，16u/mg，振荡的转速为100-200rpm，振荡时间为2-4h。

7、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(6)所述的时间间隔为0-200min，等分试样的透析液体积为250-400μl。

8、根据权利要求1所述的体外模拟胃肠淀粉消化的方法，其特征在于，步骤(7)所述的无酚dnsa试剂与透析液的比例为1：1-2，加热时间为4-8min。

本方法先将磷酸缓冲液稀释，随后加入处理好的面条块，调节ph值，加入胃蛋白酶引发消化，加入碳酸钾终止消化，将浆液转移至透析袋中，加入胰腺α-淀粉酶模拟小肠消化，用96孔板测定反应后的吸光度来衡量还原糖的含量。结合高通量测定技术，相比较临床试验更快速、高效且成本较低，适用于大量样品的测定或达到筛选的目的。

附图说明

附图为本工艺技术路线图。

具体实施方式

实施例1：

配置1l磷酸缓冲液(1m)，用cacl2(35-40ppm)进行10倍稀释，加入hcl/naoh，将ph调节至6.9；(2)使用迷你搅拌器将生小麦面条搅拌成小面块，称0.4-0.6g重面条块并加入4-6ml的磷酸缓冲液；(3)将小面块煮沸并冷却至室温，用1.0mhcl将浆液的ph调节至1.5，并加胃蛋白酶(3-4mg，3200u/mg)引发消化；(4)将消化液在37℃水浴振荡器中振荡，转速为100-200rpm，振荡时间为1-2h，消化结束后，向浆液中加入碳酸钾(1.0m)，将ph调节至6.9使胃蛋白酶失活，然后将浆液转移至snakeskintm透析袋，截留分子量为7kda；(5)向浆液中加入胰腺α-淀粉酶(65-70mg，16u/mg)来开始模拟小肠消化，将透析袋的两端密封并置于100ml磷酸缓冲液中，在37℃水浴振荡器中100-200rpm，振荡2-4h；(6)以不同的时间间隔(0-200min)取出等分试样的透析液(250-400μl)，并立即用相同量的新鲜缓冲液进行替换；(7)在96孔板中加入1：1的无酚dnsa试剂和取出的透析液并密封，在100℃下加热4-8min以产生红棕色，然后再冰水浴中冷却至室温；(8)将100μl混合物溶液转移到新的96孔，在540nm下测量吸光度以衡量透析液中还原糖的含量。

实施例2：

配置1l磷酸缓冲液(1m)，用cacl2(35-40ppm)进行10倍稀释，加入hcl/naoh，将ph调节至6.9；(2)使用迷你搅拌器将生小麦面条搅拌成小面块，称0.4-0.6g重面条块并加入4-6ml的磷酸缓冲液；(3)将小面块煮沸并冷却至室温，用1.0mhcl将浆液的ph调节至1.5，并加胃蛋白酶(3-4mg，3200u/mg)引发消化；(4)将消化液在37℃水浴振荡器中振荡，转速为100-200rpm，振荡时间为1-2h，消化结束后，向浆液中加入碳酸钾(1.0m)，将ph调节至6.9使胃蛋白酶失活，然后将浆液转移至snakeskintm透析袋，截留分子量为7kda；(5)向浆液中加入胰腺α-淀粉酶(65-70mg，16u/mg)来开始模拟小肠消化，将透析袋的两端密封并置于100ml磷酸缓冲液中，在37℃水浴振荡器中100-200rpm，振荡2-4h；(6)以不同的时间间隔(0-200min)取出等分试样的透析液(250-400μl)，并立即用相同量的新鲜缓冲液进行替换；(7)在96孔板中加入1：1.5的无酚dnsa试剂和取出的透析液并密封，在100℃下加热4-8min以产生红棕色，然后再冰水浴中冷却至室温；(8)将100μl混合物溶液转移到新的96孔，在540nm下测量吸光度以衡量透析液中还原糖的含量。

实施例3：

配置1l磷酸缓冲液(1m)，用cacl2(35-40ppm)进行10倍稀释，加入hcl/naoh，将ph调节至6.9；(2)使用迷你搅拌器将生小麦面条搅拌成小面块，称0.4-0.6g重面条块并加入4-6ml的磷酸缓冲液；(3)将小面块煮沸并冷却至室温，用1.0mhcl将浆液的ph调节至1.5，并加胃蛋白酶(3-4mg，3200u/mg)引发消化；(4)将消化液在37℃水浴振荡器中振荡，转速为100-200rpm，振荡时间为1-2h，消化结束后，向浆液中加入碳酸钾(1.0m)，将ph调节至6.9使胃蛋白酶失活，然后将浆液转移至snakeskintm透析袋，截留分子量为7kda；(5)向浆液中加入胰腺α-淀粉酶(65-70mg，16u/mg)来开始模拟小肠消化，将透析袋的两端密封并置于100ml磷酸缓冲液中，在37℃水浴振荡器中100-200rpm，振荡2-4h；(6)以不同的时间间隔(0-200min)取出等分试样的透析液(250-400μl)，并立即用相同量的新鲜缓冲液进行替换；(7)在96孔板中加入1：2的无酚dnsa试剂和取出的透析液并密封，在100℃下加热4-8min以产生红棕色，然后再冰水浴中冷却至室温；(8)将100μl混合物溶液转移到新的96孔，在540nm下测量吸光度以衡量透析液中还原糖的含量。