一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法与流程

本发明涉及一种用于鉴别中国人参的dna杂交方法。

背景技术：

中药材人参在分类学上,属于plantae(植物界)，apiales(伞形目)，araliaceae(五加科)，aralioideae(人参亚科)，panax(人参属)。人参属下有三个主要的种分类：panaxginseng(亚洲参/中国人参)，panaxnotoginseng(三七)和panaxquinquefolius(西洋参)。

虽然中国人参、三七和西洋参起源于同一属，但三种中药材的用途和性质有不同。如中国人参并不会影响华法林(warfarin)药物的效果，但是西洋参可以显著影响华法林的抗凝血活性性质。另外非人工养殖的、自然生长的中国人参价格也比三七和西洋参要高得多。

由于中国人参、三七和西洋参功效各异、价值相差大，对中国人参快速鉴别的技术和手段对于保护消费者权益显得十分重要。然而中国人参、三七和西洋参三种中药材在外观形态学和化学指纹图谱上都极度相似，鉴别中国人参至今仍然是一个十分大的挑战。

基于人参属基因组达玛烯二醇合酶(dammarenediolsynthase)基因的单核苷酸多态性建立的dna条形码技术，为准确鉴别中国人参提供了一种新方法。但是现在用于鉴别中国人参的dna条形码技术，步骤都会包括形成pcr产物和序列鉴别2步，并且都涉及凝胶电泳分离(gelelectrophoreticseparation)，过程涉及电场作用及特殊染色，需要花费大量时间和操作技术上的成本，快速鉴别中国人参的需求任然无法满足，因此需要提供一种快速鉴别中国人参的技术。

微流控芯片，是一种操控流体在微小通道中流动的系统，能够大幅减少样品消耗，减少样品处理时间，提高检测分辨率/灵敏度，在疾病诊断、药物筛选、环境检测、食品安全等领域中有广阔的使用前景。

技术实现要素：

本发明提供一种用于鉴别中国人参的dna杂交方法。

一种用于鉴别中国人参的dna杂交方法，所述方法的探针序列为seqidno：2。

所述用于鉴别中国人参的dna杂交方法中使用的洗涤液为金纳米颗粒溶液。

所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的粒径为5nm，金纳米颗粒的浓度为5-20nm。

所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的浓度为5nm。

所述金纳米颗粒溶液中起稳定作用的dna浓度为8nm。

所述用于鉴别中国人参的dna杂交方法，为基于微流控芯片的方法，所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹交叉处为反应区。

所述通道板的数量为不少于1块。

所述用于鉴别中国人参的dna杂交方法，其操作步骤包括：

(1)探针加入到微流控芯片中，沿探针固定轨迹被固定到所述测试板表面；

(2)洗涤微流控芯片后，移除流道板，分别洗涤和吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；

(3)将生物素标记的单链待测样本dna加入到微流控芯片中，待测样本dna沿待测样本dna流动轨迹流动，在反应区与固定的探针杂交；

(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，在微流道芯片中加入cy-5标记的链霉亲和素溶液；

(5)洗涤和干燥微流道芯片，取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。

一种鉴别中国人参的dna杂交方法试剂盒，所述试剂盒包括微流控芯片、cy-5标记的链霉亲和素溶液、洗涤溶液、溶解液、探针；所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹交叉处为反应区；所述探针序列为seqidno：2，所述的溶解液用于溶解和稀释所述探针和待测样本dna。

所述的溶解液成分为含0.15mnacl、0.015mph7.0的柠檬酸钠缓冲液、0.15％十二烷基苯磺酸钠的溶液。

所述洗涤溶液为nacl-nahco3水溶液、nabh4溶液、1倍pbs缓冲液，金纳米颗粒溶液、含0.15％吐温的1倍pbs缓冲液。

本发明提供的鉴别中国人参的dna杂交方法中使用的探针是基于人参属基因组中达玛烯二醇合酶(dammarenediolsynthase)基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)位点设计。本发明人实验中发现中国人参、西洋参和三七的达玛烯二醇合酶基因相似性高，为了更加准确的鉴别中国人参，发明人设计了多种探针序列，最后筛选出了可以准确鉴别中国人参的探针序列。

本发明提供的鉴别中国人参的dna杂交方法将微流控芯片和基因多态性检测相结合，一方面保留了微流控芯片无需电泳、可以使用体积小(0.5μl)和低浓度(为0.1nm)样品、可同时检测多个样品、以及反应速度快的优点，另一方面也保留了基因多态性检测准确度高的优点，因此本发明的鉴别中国人参的na杂交方法检测性能优越。

附图说明

图1微流控芯片示意图

其中1为测试板，2为通道板。

图2微流控芯片使用原理示意图

其中3为探针固定轨迹；4为待测样品dna轨迹；5为反应区；

图2-a为探针加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；

图2-b为探针固定轨迹3示意图；

图2-c为待测样品dna加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；

图2-d为探针固定轨迹3和待测样品dna轨迹4交叉状态示意图；

图2-e为测试板用激光扫描仪扫描荧光信号下的示意图。

图3探针筛选结果

pgin为中国人参的待测样本dna反应区，pquin为西洋参的待测样本dna反应区；

a为n1g探针的反应区，b为n2g探针的反应区。

图4探针鉴定人参验证

具体实施方式

为了更好理解本发明的技术方案和优点，以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明做进一步说明。

实施例1

1、各种溶液配置

探针溶液的配置

取溶解液与探针，配置探针溶液，其中配置成的探针溶液成分如下：

(1)25μm胺标记的寡核苷酸单链

(2)1.5mnacl

(3)0.15m碳酸氢钠

(4)0.15％十二烷基苯磺酸钠(sds)

待测样本dna溶液的配置

取溶解液与待测样本dna，配置待测样本dna溶液，其中配置成的待测样本dna溶液成分如下：

(1)25ng/ul生物素标记的寡核苷酸单链

(2)0.015mnacl

(3)0.015m柠檬酸钠(ph7.0)

(4)0.15％十二烷基苯磺酸钠(sds)

金纳米颗粒(aunp)溶液的配置

实验前将aunp储存液加至ad6(注：ad6是一条单链dna，序列为：cgccgattggacaaaacttaaa)及pbs等混合溶液中，进行如下操作：

(1)以8000rpm离心5秒(离心分离至管底)，然後振荡数秒；

(2)将离心管置于95℃上加热10min，取出在室温下冷却90min；

(3)加入1倍pbs溶液，随后进行离心和振荡，该溶液需在1h内使用。

2、实验操作步骤

(1)1μl探针溶液加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让探针沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；

(2)移除探针溶液，用nacl-nahco3水溶液(含1.5mnacl，0.15mnahco3)洗涤微流控芯片，移除流道板，放测试板在2.5mg/ml的nabh4溶液，室温反应15min,再以1倍pbs溶液清洗测试板,分别吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；

(3)将1μl已变性且生物素标记的待测样本dna溶液加入到微流控芯片中，待测样本dna沿待测样本dna流动轨迹流动，等待待测样本dna在反应区与固定探针杂交1小时；

(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，移除微流道芯片中的液体，然后在微流道芯片中加入0.6μl50μg/ml的cy-5标记的链霉亲和素溶液，室温反应15min；

(5)除去cy-5标记的链霉亲和素溶液，用含0.15％吐温的1倍pbs缓冲液洗涤干燥微流道芯片，移开通道板，再以1倍pbs溶液清洗测试板，干燥测试板；

(6)取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。

实施例2探针序列的筛选

探针设计了两种，分别记为n1g和n2g，两种探针的序列分别为：

n1g：ctaaaaaaaaagtatttttcatctaaattttgaa(seqidno：1)

n2g：gaatttgaaagtgtcttaaattgattttcaa(seqidno：2)

待测样本dna制备2份，分别来源于中国人参和西洋参，中国人参的待测dna样本记为pgin，西洋参的待测dna样本记为pquin。

按照实施例1的操作进行实验，其中实施例1中步骤(4)洗涤微流道芯片中洗涤液使用1倍pbs缓冲液，实验结果如图3所示。

从图3上可以看到，探针n1g固定的反应区，中国人参和西洋参的荧光反应无显著性差异，探针n1g无法很好的区分出中国人参和西洋参；而在探针n2g固定的反应区，中国人参的反应信号高于西洋参的反应信号，探针n2g可以很好的区分出中国人参和西洋参。所以探针n1g被排除，选择探针n2g作为鉴别中国人参的探针。

实施例3

(1)1μl序列为seqidno：1和seqidno：2的2种探针溶液沿通道板上不同的微流道加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让2种探针分别沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；

(2)移除探针溶液，用nacl-nahco3水溶液(含1.5mnacl，0.15mnahco3)洗涤微流控芯片，移除流道板，用2mg/ml的nabh4溶液分别洗涤流道板和测试板，分别吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；

(3)将1μl已变性且生物素标记的中国人参、西洋参、代号为gin3和代号为amg的四种待测样本dna沿通道板上不同的微流道加入到微流控芯片中，待测样本dna沿待测样本dna流动轨迹流动，等待待测样本dna在反应区与固定探针杂交1小时；

(4)除去微流道芯片中的溶液，用0.6μl金纳米颗粒浓度为10nm的溶液(dna含量为8nm)洗涤微流道芯片，移除微流道芯片中的液体，然后在微流道芯片中加入0.6μl50μg/ml的cy-5标记的链霉亲和素溶液，室温反应15min；

(5)除去cy-5标记的链霉亲和素溶液，用含0.15％吐温的1倍pbs缓冲液洗涤干燥微流道芯片，移开通道板，再以1倍pbs溶液清洗测试板，干燥测试板；

(6)取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号，实验结果如图4所示。

从图4上可以看到，在探针序列为seqidno：1的实验区域，中国人参、西洋参、代号为gin3和代号为amg的四种待测样本dna各自反应区的荧光强度相差不显著，该探针无法很好的区分中国人参和西洋参，也无法鉴别出代号为gin3和代号为amg的2种未知样本的植物种类。在探针序列为seqidno：2的实验区域，中国人参、西洋参待测样本dna各自反应区的荧光强度相差显著；并且代号为gin3未知待测样本dna的反应区荧光强度与中国人参待测样本dna反应区的荧光强度相当，与西洋参待测样本dna反应区的荧光强度差异显著；代号为amg未知待测样本dna的反应区荧光强度与中国人参待测样本dna反应区的荧光强度差异显著，而与西洋参待测样本dna反应区的荧光强度相当。

因此根据图4的实验结果，可以判断代号为gin3未知待测样本dna来自中国人参，代号为amg未知待测样本dna不是来自于中国人参。

经sangardna测序证实，代号为gin3的待测样本dna来自于人参品种，而代号为amg的待测样本dna不来自于中国人参，与本发明的鉴别中国人参的dna杂交方法结果匹配。