三维单细胞来源细胞球生产芯片、其制备方法及应用与流程

本发明涉及一种生产间充质干细胞球的方法，特别涉及一种三维单细胞来源细胞球生产芯片、其制备方法及应用，例如在三维培养条件下生产间充质干细胞球的方法和其在体内促血管生成方面的应用。

背景技术：

间充质干细胞(msc,mesenchymalstemcells)来源于发育早期的中胚层，是一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能的间质细胞，属于多能干细胞。msc最初在骨髓中被发现，后经研究证实，msc广泛存在于多种组织器官中：包括骨髓、脂肪、脐带血、羊膜、胸腺、牙髓、外周血、脐带等。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因为其具有来源广泛、具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我更新等特点而日益受到人们的关注。截止到目前，msc已被广泛应用于移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,gvhd)、再生障碍性贫血、急性心梗、肝损伤、脑卒中、骨发育不全、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化、关节炎、支气管肺发育不全、脊髓损伤等多种疾病的治疗，并获得明显的治疗效果。脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，ucmsc)作为应用较广泛的干细胞类型，由于其具有分化潜力大、便于鉴定、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，使其成为理想的临床用间充质干细胞。

生物体内的细胞是在三维的立体微环境中生长的，虽然二维培养可以快速增殖ucmsc，但并不是细胞生长的天然状态，培养微环境与机体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，也导致细胞在分化能力和活力等方面的异质性。三维(3dimensional,3d)培养技术的应用，为细胞在体外培养过程中提供了一个更加接近体内生存条件的微环境，更有利于细胞的增殖和存活以及本身特性的保持。与传统的2d贴壁培养相比，三维球状细胞聚集成球状体，被认为是模拟了更真实的机体内生存环境，3d细胞培养已经被广泛应用于干细胞临床医学和再生医学研究。传统的3d培养是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。

常见的用于形成3d细胞球的方法主要有旋转培养法、液体覆盖法、低吸附96孔板培养法、悬滴法和壳聚糖膜培养法等。基本原理是提供一个细胞悬浮培养的空间，并依靠细胞之间相互粘连形成多细胞球体(multiplecellsderivedspheroid,mcds)并连续培养。很多研究通过比较2d和3d培养，认为多细胞球体较2d细胞在存活、因子分泌、干性保持、迁移、抗衰老等方面表现出更出色的特征，在动物试验中，多细胞球体也更能增强抗炎、血管生成、组织修复和再生的能力。3d培养出的mcs可能更好的发挥治疗作用，目前这一观点被广泛地接受。

然而，现有的制作间充质干细胞球的方法，均为生产多细胞来源的细胞球，即利用细胞之间的相互粘附作用生产细胞球。虽然试验证实多细胞来源的细胞球在各种性状表现和治疗上的优势明显高于传统的2d培养，但其明显存在以下问题和缺点：

1)多细胞球体是由多个活力上有差异的细胞混合形成的球体，细胞的质量没有被均一化。

2)多细胞球体的内外存在营养物质、氧气和废弃物代谢等差异的问题，球体中心的细胞很难获得足够的营养物质和氧气条件，而其产生的废弃物也很难及时的代谢到环境中，这种压力影响了球体细胞的基因表达水平，甚至可能导致基因突变，从而影响细胞的质量。

3)mcs球体中心的细胞由于缺少细胞外基质的支撑，从而容易导致失巢凋亡的发生。

4)现有的3d培养方式形成的多细胞球体一般直径较大，介于几百微米至几毫米，由于血管堵塞的风险，较大尺寸的mcs不宜直接通过血管输入机体，大强度的酶解处理能够从多细胞球体中获得单个细胞，但这一过程会严重损伤细胞，使获得的单细胞在质量上具有较大的异质性。

5)现有的形成细胞球的技术基本为悬浮培养，没有细胞外基质的参与，很难模拟真实体内的msc的生长环境。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的主要目的在于提供一种三维单细胞来源细胞球生产芯片、其制备方法及应用，用以实现高质量、均一化来源的间充质干细胞的生产，从而满足基础研究和临床应用的需求。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种三维单细胞来源细胞球生产芯片，其包括基底和形成于基底表面的图案微阵列，所述图案微阵列包括彼此间隔设置的两个以上图案，所述基底表面是电中性的，所述图案由带正电荷的材料形成。

在一些实施方案中，所述基底表面覆设有电中性材料层。

进一步地，所述电中性材料层的材质包括聚乙二醇，且不限于此。

在一些实施方案中，所述带正电荷的材料包括聚醚酰亚胺，但不限于此。

在一些实施方案中，所述图案为圆点。

在一些实施方案中，所述图案的直径优选为8μm-12μm左右。

在一些实施方案中，在所述图案微阵列中，相邻图案之间的距离为50μm-100μm。

在一些实施方案中，所述基底包括玻璃片，且不限于此。

本发明实施例还提供了前述的任一种三维单细胞来源细胞球生产芯片的制备方法，其包括：

提供具有电中性表面的基底；

提供印章，所述印章的印面上分布有与所述图案微阵列相应的图纹结构；

在所述印章的印面上设置带正电荷的材料或含带正电荷的材料的溶液，之后使所述印章的印面与所述基底的表面接触，从而在所述基底的表面上形成图案微阵列。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体包括：至少将所述印章的印面于含带正电荷的材料的溶液中充分浸泡，之后去除，并以蒸馏水润洗，再以氮气吹干，从而在所述印章的印面上修饰带正电荷的材料，所述含带正电荷的材料的溶液包括浓度为0.8v/v％-1v/v％的聚醚酰亚胺溶液。

述基底的表面接触，从而在所述基底的表面上形成图案微阵列。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体包括：使清洁的基底表面与含电中性材料的溶液在55-65℃接触120-150min，之后以无水乙醇、蒸馏水润洗，再以氮气吹干，从而在所述基底表面形成电中性层，所述含电中性材料的溶液包括含1v/v％-2v/v％聚乙二醇的无水甲苯溶液。

述基底的表面接触，从而在所述基底的表面上形成图案微阵列。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体包括：将所述印章的修饰有带正电荷材料的印面一次性放置在所述基底表面的电中性层上，再施加压力使所述印章的印面与所述基底表面接触并保持30-40s，之后将所述印章移离，从而在所述基底的表面上形成图案微阵列。

述基底的表面接触，从而在所述基底的表面上形成图案微阵列。

在一些实施方案中，所述的制备方法还可包括：

制作掩模版，所述掩模版上具有与所述图案微阵列对应的镂空图形结构；

在衬底上形成光刻胶层；

利用所述的掩模版对所述光刻胶层进行光刻处理，形成倒模用的模具；

将由质量比为10:1-8:1的第一pdms溶液(可定义为a组分)与第二pdms溶液(可定义为b组分)混合形成的pdms溶液均匀覆盖在所述模具表面，再置于真空干燥器中除气1h-2h，之后在55℃-65℃过夜，固化完成后，制得所述印章。其中a组分可以含siliconeelastomerbase(有机硅弹性体材料)，b组分可以为siliconeelastomercuringagent(有机硅弹性体固化剂)。这些材料均可以从市售等途径获取。

本发明实施例还提供了前述的任一种三维单细胞来源细胞球生产芯片于生产间充质干细胞球中的应用。

本发明实施例还提供了一种单细胞来源间充质干细胞球的生产方法，其包括：将细胞悬浮液施加在所述的三维单细胞来源细胞球生产芯片上，并置于细胞培养箱内20min-30min，之后将所述芯片从细胞培养箱内取出，并除去所述芯片上的培养基，再以新鲜培养基或磷酸盐缓冲液润洗去除多余的细胞，其后以水凝胶覆盖所述芯片的图案微阵列，在细胞培养箱内保持10min-15min，待所述胶原水凝胶轻微固化后，置于完全培养基中培养5-7天，之后以磷酸盐缓冲液冲洗分离细胞球，继而以水凝胶覆盖所述芯片，并移入细胞培养箱连续培养5-7天，收集水凝胶，并以磷酸盐缓冲液将水凝胶稀释10倍以上，从而释放出细胞球。

在一些实施方案中，所述的水凝胶为胶原水凝胶，并含有0.1v/v％-0.2v/v％甲基纤维素。

在一些实施方案中，所述细胞悬浮液含有的细胞总数为所述图案微阵列中图案数量的2-3倍。

在一些实施方案中，利用所述的芯片进行3-5天的三维培养后，形成的细胞球可通过磷酸盐缓冲液等稀释后，直接离心收集。

本发明实施例还提供了由前述的任一种方法生产的单细胞来源细胞球在体内促血管生成中的应用。

本发明实施例还提供了一种产品的制备方法，所述产品用于在体内促血管生成，所述的制备方法包括：利用前述的任一种方法生产单细胞来源间充质干细胞球。

较之现有技术，本发明至少具有如下优势：

1)本发明的三维单细胞来源细胞球生产芯片结构简单，成本低廉，易于制作，例如，其中只需一次光刻反应，就能够产生足够量的印章，适于规模化生产。

2)本发明提供的单细胞来源的间充质干细胞球生产方法结合了前述芯片和细胞3d培养技术，可大量筛选并生产单细胞来源细胞球(scds)，具有可靠性、稳定性、高通量性等优点；

3)本发明生产的单细胞来源细胞球(scds)具有高质量、均一化来源的特点，较传统的mcds具有更好的促血管生成效果，可以很好地满足基础研究和临床应用的需求。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案中一种细胞芯片的制作工艺流程图及scds、mcds的生产工艺原理图。

图2a-图2b是本发明实施例中利用预双染色的msc方法对scds和mcds的来源进行表征的图谱。

图3a-图3e是本发明实施例中对scds和mcds的生产过程中物理性状的部分表征图谱。

图4a-图4d是本发明实施例中对scds和mcds在体内促血管生成方面的比较图谱。

图5是本发明实施例中对scds和mcds在体内促血管生成方面的比较图谱。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和实践，得以提出本发明的技术方案，其主要涉及一种三维单细胞来源细胞球生产芯片、其制备方法及利用所述芯片在三维培养条件下生产单细胞来源间充质干细胞球的方法和单细胞来源间充质干细胞球在体内促血管生成方面的应用。

如下将对本发明的技术方案作更为详细的解释说明。若非特别说明，则在本说明书中述及的术语均指代了本领域技术人员习知的释义。例如，如下的一些术语可被解释为：

光刻(photolithograph)：是通过一系列生产步骤，将晶圆表面薄膜的特定部分除去的工艺。在此之后，晶圆表面会留下带有微图形结构的薄膜。通过光刻工艺过程，最终在晶圆上保留的是特征图形部分。

化学修饰(chemicalmodification)：用吸附、涂敷、聚合、化学反应等方法把活性基团或催化物质等附着在电极(材料)表面，保护电极(材料)或改进电极(材料)特征功能的工艺过程。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)：是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。

三维细胞培养(three-dimensionalcellculture，3d)：是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。

异种移植物(xenograft)：异种移植物指的是用于进行不同种属间移植的活细胞，组织或者器官等外来物的总称。

血管生成(angiogenesis)：是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。

pbs：磷酸盐缓冲液。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种基于微加工和表面化学修饰技术的三维单细胞来源细胞球生产芯片的制备方法，请参阅图1所示，该制备方法可以包括：

制作印章的步骤；

在印章的印面上修饰带正电荷材料的步骤；

将印章印面上的图案转移到基底的电中性表面，从而在基底表面形成图案微阵列的步骤。

进一步的，请继续参阅图1所示，还可利用所获三维单细胞来源细胞球生产芯片培养scds、mcds。

在一个较为具体的实施例中，一种三维单细胞来源细胞球生产芯片的制备方法可以包括如下步骤：

1.polydimethylsiloxane(pdms)印章的制作，包括：

a)掩膜板的制作。利用中科院苏州纳米技术与纳米仿生研究所的纳米加工平台，设计和制作掩膜板，规格大小为4寸左右，表面详细结构为透光的圆点的阵列。其中圆点的直径为10μm左右和100μm左右，相邻圆点圆心之间的间距为100μm。这些参数决定了单细胞球(scds)和多细胞球(mcds)在细胞芯片上的密度，以及单个mcds中包含的细胞数。

b)光刻技术形成倒模用模具(master)，包括：

1)清洗硅片：氮气吹去硅片表面的杂质颗粒，浸泡于酸液中(h2so4:h2o2＝3:1，80℃)1小时，用蒸馏水润洗去除表面酸性物质及油脂，置于溶液(h2o:nh4oh:h2o2＝5:1:1)中，室温浸泡1小时，蒸馏水润洗去除表面化学物质并用氮气吹干。

2)涂胶：利用匀胶仪(spincoater)在硅片上涂一薄层粘附性好、厚度适当、均匀的光刻胶。

3)前烘：将硅片放置于加热台上烘烤，促使胶膜内溶剂充分地挥发掉，使胶膜干燥，增加胶膜与硅片之间的粘附性和提高胶膜的耐磨性，不沾污掩模板，以便光刻胶充分进行光化学反应。

4)曝光：在专用的光刻机上或者uv光源下曝光，包括“定位”和“曝光”两部分，曝光时间的选择根据光源强弱、光刻胶性能及光刻图形尺寸大小相关。

5)后烘：将曝光后的硅片放置于加热台上烘烤直至曝光影像出现(对于小尺度的图形，可能会很难看到)。

6)显影：将未感光部分的光刻胶溶除，以获得曝光所需图形。

c)pdms印章的制备。两种pdms原始溶液(可从市售途径获取)按照10:1(质量比，w/w)的比例混合均匀；将均匀混合的pdms溶液倾倒在前述模具表面直至均匀的覆盖(高度一般1cm左右)；置于真空干燥器中除气1小时；将覆盖pdms溶液的模具放到烘箱中固化(60℃过夜)；固化完成后，取出并切割成所需大小的pdms印章，显微镜观察质量，待用。

2.pdms印章和细胞芯片的修饰。

a)将清理过的pdms印章浸泡在1％(v/v)polyetherimide(pei)溶液10分钟，取出，用蒸馏水润洗3次，氮气吹干并待用。

显然，本发明实施例的方法操作简单，只需一次光刻反应，就能够产生足够量的pdms印章。

将清理过的玻璃片浸泡在1％(v/v)polyethyleneglycol(peg)的无水甲苯溶液(包含1％triethylamine)中在60℃下保持120分钟，取出后分别用无水乙醇和蒸馏水润洗3次，氮气吹干并待用。pei为正电，保证细胞的贴附，而peg没有电性，靠空间位阻等方式排斥细胞的贴附。

b)pei微阵列的形成：将修饰好的pdms印章轻轻的放在peg修饰好的玻璃片上(不要移动，一次性放置)，稍稍加力使两表面接触并保持30s-40s，然后揭掉pdms印章，这样在玻璃片上形成直径固定(10或100μm)的圆点(相邻圆点的圆心之间的距离为100μm)组成的阵列，此修饰好的芯片应在3小时内进行后续试验。当圆点的直径设计为10μm时，这个面积小到只能允许一个细胞的粘附，而直径设计为100μm时，可以允许20-30个ucmsc细胞同时粘附在一个圆点上，我们可通过控制圆点的直径的大小来保证不同数量细胞被粘附。

在本发明实施例中，peg的修饰不是通过电性排斥细胞，可降低对于细胞的毒性作用。修饰稳定性高，室温保存一周内可用。

在本发明实施例中，可以根据需求，设计不同尺寸的图案，包括吸附细胞面积和相邻细胞之间的间距等。

进一步地，在一些实施例中，还可利用前述实施例所制备的芯片进行细胞在三维培养环境中的培养和scds的生产，具体包括如下步骤：

1ml的细胞悬浮液(细胞数量根据图案不同决定，大体来说，细胞总数为图案数量的2-3倍)被置于修饰好(盖好印章图案后)的玻璃片上，将载有细胞的玻璃片放置于细胞培养箱内20-30分钟。之后，取出玻璃片，小心的将培养基除去，并用新鲜培养基或者pbs轻轻的润洗玻璃片，从而去除多余的细胞。用0.1w/v％胶原水凝胶(pbs，含0.1v/v％甲基纤维素)约500μl，覆盖整个微阵列的表面，培养箱中保持10分钟，待水凝胶材料轻微固化后放入完全培养基的培养皿中培养5-7天后，用pbs冲洗分离细胞球。用包含0.1％甲基化纤维素的水凝胶覆盖芯片，并轻轻的移至培养箱进行连续培养。5-7天后，收集水凝胶和细胞球，用pbs将水凝胶稀释10倍从而释放细胞球，离心，收集用于下一步实验。

在本发明实施例中，可以在面积为1cm²的细胞芯片上，一次性至少可以收获1×10⁴个平均直径为50μm的单细胞来源的细胞球。

请参阅图2a-图2b，其中对利用预双染色的msc方法对本发明实施例中scds和mcds的来源进行了表征。又请参阅图3a-图3e所示，其中对本发明实施例中scds和mcds的生产过程中物理性状进行了标准。

在本发明实施例中，还可以根据需求，设计不同尺寸的图案，包括吸附细胞面积和相邻细胞之间的间距等，用于比较不同数量来源和不同尺寸大小细胞球的性状和治疗效果。

本发明实施例的单细胞来源间充质干细胞球生产方法具有可靠性、稳定性、高通量性等优点。

更进一步地，在一些实施例中，还对利用前述方法生产的scds、mcds于体内促血管生成方面的作用进行了考察，具体如下：

a)皮下接种实验：皮下接种的xenograft中为ucmsc提供了缺氧和营养匮乏的胁迫(stress)，部分模拟临床治疗中ucmsc在机体不同部位分布后所面临的胁迫。在免疫缺陷和非缺陷小鼠的皮下接种不同培养形式的干细胞，将4×10⁶的ucmsc(2d，scds和mcds)混合等量的matrigel共计200μl，注射入小鼠的左或右腋皮下形成xenograft。

b)分别在接种后的第2和7天后取xenograft，照相。4wt％多聚甲醛固定和石蜡包埋后，组织切片进行h&e染色和ihc免疫组化检测。通过判断血管空腔(h&e)的形成数量和血管内皮细胞的标志物cd31的峰度(ihc)，从而判断不同来源msc对于促血管新生的影响。

相应的测试结果可以分别参阅图4a-图5。显然可以看到，scds更有利于体内促血管新生。这将为临床上的缺血性相关疾病带来新的治疗思路和方法。

综述之，本发明技术方案的优点包括：

(1)以干细胞自我更新为基准筛选和驯化msc，干细胞的自我更新能力表现为单个细胞的增殖能力，单细胞芯片结合3d细胞培养技术获得的scds既是对细胞自我更新能力的筛选，也是对细胞自我更新能力的恢复。

(2)通过筛选和驯化，scds在细胞活力和生物学特性方面较为均一。

(3)scds的尺寸较小，通常在50微米以内，可以不通过酶解，直接用于机体注射。

(4)与2d培养的细胞相比，scds球体表面有基质保护，使细胞更易于抵抗不利生存环境，如酸、碱和酶解等。

(5)scds更易进入g0期，利于细胞保持干性和抵抗不利生存环境。

(6)与2d培养细胞相比，scds的离散度更高，利于细胞在机体内运输和分布。

(7)由一个细胞来源的几个细胞有机地结合在一起，有利于形成功能单位并较快发挥作用。

(8)scds在不良生存环境中的耐受性可能有助于其应用于3d生物打印和类器官构建研究。

(9)利用本发明的技术方案，有望为临床间充质干细胞治疗提供连续的、稳定的、高质量的、均一的细胞，从而有效提高疾病治疗的缓解率和治愈率。

(2)利用本发明的技术方案，可以为成体干细胞的亚群分析和分离提供了可靠的前提基础，由此可以根据细胞质量高低的区分进行分类，进行后续的生物学标志物的筛选和鉴定，有望为未来的干细胞在对不同疾病治疗方面的质量标准化的制定提供思路和参考依据。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。