特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用的制作方法

本发明涉及一种ssdna核酸适配体及其筛选方法、检测方法和应用，特别是涉及一种特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用。

背景技术：

我国作为水产养殖大国，水产养殖量占世界水产品养殖总量的70％。广西是我国的水产养殖大省，主要养殖品种包括卵形鲳鲹、草鱼、斑点叉尾鮰、石斑鱼、对虾、牡蛎、马氏珠母贝和各种食用植物。然而，随着城市化、工业化、养殖规模化进程的加快，广西水产养殖环境日益恶化，各种病害频繁暴发，造成了巨大经济损失。2017年广西北海近海网箱养殖的卵形鲳鲹暴发病毒性神经坏死鱼病，通过对患病卵形鲳鲹中病原微生物进行鉴定，分离获得卵形鲳鲹源神经坏死病毒，并将其命名为guangxitrachinotusovatusnervousnecrosisvirus(gtonnv)。据报道。神经坏死症病毒会导致鱼类的脑组织和眼睛视网膜组织细胞空泡化，特别是对苗种生产期的仔鱼和幼鱼危害很大，爆发速度快，致死率高达95％-100％。根据“预防为主，防治结合”的病害防控原则，在神经坏死病毒感染早期阶段，通过快速检测、精确诊断，迅速有的放矢地施行高效防控措施，对于控制病毒的大规模爆发流行至关重要。但是目前针对鱼类神经坏死病毒的诊断方法主要是聚合酶链式反应检测技术(polymerasechainreation,pcr)等。pcr检测结果精确可靠，但却存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵等不足，无法满足现场快速准确检测诊断的要求。因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高、可用于养殖现场的卵形鲳鲹源神经坏死病毒快速检测技术，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。

指数富集的配基系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmenttechnology,selex)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达1014-1015的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒的ssdna核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对卵形鲳鲹源神经坏死病毒进行准确检测和诊断的问题。

本发明的目地在于提供一种可特异性识别神经坏死病毒的ssdna核酸适配体，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列为5’-gtctgaagtagacgcaggagaactgtattagcctctgggtgccgcaccgtagtgccctatctaacatcacagtcacacctgagtaagcgt-3’(seqidno:1)或5’-aactgtattagcctctgggtgccgcaccgtagtgccctatctaacatcac-3’(seqidno:2)。

进一步地，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。

更进一步地，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。

更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。

更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、羟基荧光素中的一种或多种。

本发明的另一目地在于提供一种上述ssdna核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1：合成以下序列所示的单链dna文库和引物：

随机文库library50：

5’-gtctgaagtagacgcaggag(50n)agtcacacctgagtaagcgt

5’引物：5’-fam-gtctgaagtagacgcaggag-3’；

3’引物：5’-biotin-acgcttactcaggtgtgact-3’；

步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于500μlpbs中，在92℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的随机文库与gtonnv感染细胞在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10ml的pbs洗涤gtonnv感染细胞，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别gtonnv感染细胞的ssdna核酸适配体库；

步骤3：取100ul筛选得到的识别gtonnv感染细胞的ssdna核酸适配体库进行pcr扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；

步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中pcr扩增所得的双链dna在常温下孵育20min，利用双链dna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链dna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200ulnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清；

步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入500μlpbs，得到含有dna单链文库的溶液；

步骤6：取步骤5中得到的dna单链文库代替步骤2中的随机文库，并将步骤2-5重复8次；

步骤7：取步骤6的筛选得到的dna文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与卵形鲳鲹正常细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清溶液与卵形鲳鲹正常细胞进行冰浴结合；孵育结合完成后，收集上清，收集到的上清即为经过阴性筛选的核酸文库库；

步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssdna核酸适配体。

本发明的另一目地在于提供一种应用上述ssdna核酸适配体的卵形鲳鲹源神经坏死病毒的快速检测方法(afmp)，包括以下步骤：

步骤1：对ssdna核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清；待孵育结合后，清洗待测样品，混匀在200μlpbs溶液中，使用流式细胞仪进行检测，根据荧光值的变化检测待测样品中是否有卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞。

本发明还有一目地在于提供一种应用上述ssdna核酸适配体在检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒中的用途。

本发明通过selex技术筛选得到的核酸适配体，与现有的蛋白抗体相比具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白抗体所不具备的特点，包括无免疫原性；制备周期短，重现性好；分子量小，便于体外化学合成；便于标记；易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代；序列稳定易于运输和保存等。采用本发明的基于核酸适配体的卵形鲳鲹源神经坏死病毒的快速检测方法(afmp)对鱼类神经坏死病毒进行检测时，操作简单迅速，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等开发相关的快速检测试剂盒。这对于鱼类神经坏死病毒的快速诊断具有重要意义，在鱼类神经坏死病毒的检测领域有良好的应用前景。

此外，本发明提供的基于核酸适配体的卵形鲳鲹源神经坏死病毒的快速检测方法(aptamer-basedfluorescentmolecularprobedetectiveaasay,afmp)，将卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染的卵形鲳鲹细胞与羟基荧光素(6-carboxy-fluorescein,fam)标记的上述seqidno:1或seqidno:2所示的ssdna核酸适配体孵育结合并清洗后，用激光共聚焦显微镜进行检测，根据细胞表面的荧光信号检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒。afmp技术可应用于开发基于核酸适配体的鱼类神经坏死病毒的快速检测试剂盒，适用于诊断鱼类是否被鱼类神经坏死病毒侵染的大批量快速检测，具有耗时短、操作简便、稳定性强、灵敏度高等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1、对照例1中ssdna核酸适配体的流式细胞仪检测荧光强度对比图；

图2为本发明实施例1、对照例1中ssdna核酸适配体的激光共聚焦显微镜拍摄图；

图3为本发明实施例3seqidno:1核酸适配体的二级结构预测图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

实施例1ssdna核酸适配体的制备方法如下：

步骤1：合成以下序列所示的单链dna文库和引物：

随机文库library50：

5’-gtctgaagtagacgcaggag(50n)agtcacacctgagtaagcgt

5’引物：5’-fam-gtctgaagtagacgcaggag-3’；

3’引物：5’-biotin-acgcttactcaggtgtgact-3’；

步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于500μlpbs中，在92℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的随机文库与gtonnv感染细胞在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10ml的pbs洗涤gtonnv感染细胞，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别gtonnv感染细胞的ssdna核酸适配体库；

步骤3：取100ul筛选得到的识别gtonnv感染细胞的ssdna核酸适配体库进行pcr扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；

步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中pcr扩增所得的双链dna在常温下孵育20min，利用双链dna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链dna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200ulnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清；

步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入500μlpbs，得到含有dna单链文库的溶液；

步骤6：取步骤5中得到的dna单链文库代替步骤2中的随机文库，并将步骤2-5重复8次；

步骤7：取步骤6的筛选得到的dna文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与卵形鲳鲹正常细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清溶液与卵形鲳鲹正常细胞进行冰浴结合；孵育结合完成后，收集上清，收集到的上清即为经过阴性筛选的核酸文库库；

步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssdna核酸适配体。

步骤7：将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的pcr扩增和步骤4的单链dna文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞仪检测所得文库对gtonnv感染细胞识别能力的增强情况，直至8轮筛选后，核酸文库对gtonnv感染细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测神经坏死病毒的ssdna核酸适配体，序列为5’-gtctgaagtagacgcaggagaactgtattagcctctgggtgccgcaccgtagtgccctatctaacatcacagtcacacctgagtaagcgt-3’(seqidno:1)。

实施例1ssdna核酸适配体的afmp检测方法如下：

步骤1：对实施例1ssdna核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：将200nm羟基荧光素(fam)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库溶于500μlpbs中，然后与神经坏死病毒活菌在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清，用10mlpbs离心洗涤三次，最终将神经坏死病毒混匀在200μlpbs中，用于流式细胞仪检测50000个细胞。根据荧光值的变化检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒。如图1所示，1st、3rd、5th、6th、7th、8th、9th分别为实施例1中流式细胞仪检测羟基荧光素(fam)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库与卵形鲳鲹源神经坏死病毒的结合情况。

实施例2

实施例2ssdna核酸适配体的制备方法如下：

步骤1：合成以下序列所示的单链dna文库和引物：

随机文库library50：

5’-gtctgaagtagacgcaggag(50n)agtcacacctgagtaagcgt

5’引物：5’-fam-gtctgaagtagacgcaggag-3’；

3’引物：5’-biotin-acgcttactcaggtgtgact-3’；

步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于500μlpbs中，在92℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的随机文库与gtonnv感染细胞在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10ml的pbs洗涤gtonnv感染细胞，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别gtonnv感染细胞的ssdna核酸适配体库；

步骤3：取100ul筛选得到的识别gtonnv感染细胞的ssdna核酸适配体库进行pcr扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；

步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中pcr扩增所得的双链dna在常温下孵育20min，利用双链dna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链dna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200ulnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清；

步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入500μlpbs，得到含有dna单链文库的溶液；

步骤6：取步骤5中得到的dna单链文库代替步骤2中的随机文库，并将步骤2-5重复8次；

步骤7：取步骤6的筛选得到的dna文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与卵形鲳鲹正常细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清溶液与卵形鲳鲹正常细胞进行冰浴结合；孵育结合完成后，收集上清，收集到的上清即为经过阴性筛选的核酸文库库；

步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssdna核酸适配体。

步骤7：将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的pcr扩增和步骤4的单链dna文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞仪检测所得文库对gtonnv感染细胞识别能力的增强情况，直至8轮筛选后，核酸文库对gtonnv感染细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测神经坏死病毒的ssdna核酸适配体，序列为5’-aactgtattagcctctgggtgccgcaccgtagtgccctatctaacatcac-3’(seqidno:2)。

实施例2ssdna核酸适配体的afmp检测方法如下：

步骤1：对实施例1ssdna核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：将200nm羟基荧光素(fam)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库溶于500μlpbs中，然后与神经坏死病毒活菌在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清，用10mlpbs离心洗涤三次，最终将神经坏死病毒混匀在200μlpbs中，用于流式细胞仪检测50000个细胞。根据荧光值的变化检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒。如图1所示，1st、3rd、5th、6th、7th、8th、9th分别为实施例1中流式细胞仪检测羟基荧光素(fam)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库与卵形鲳鲹源神经坏死病毒的结合情况。

对照例1

对照例1ssdna核酸适配体的制备方法如下：

合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物

随机文库library50：

5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc

5’引物：5’-fam-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；

3’引物：5’-biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’；

上述随机单链dna文库为对照例ssdna核酸适配体。

对照例1ssdna核酸适配体的afmp检测方法如下：

步骤1：对对照例1ssdna核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：将200nm羟基荧光素(fam)标记的随机单链dna文库溶于500μlpbs中，然后与神经坏死病毒活菌在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清，用10mlpbs离心洗涤三次，最终将神经坏死病毒混匀在200μlpbs中，用于流式细胞仪检测50000个细胞。根据荧光值的变化检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒。如图1所示，library为对照例中流式细胞仪检测羟基荧光素(fam)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库与卵形鲳鲹源神经坏死病毒的结合情况。

经过9轮的筛选，证实第8轮筛选文库对神经坏死病毒的特异性识别能力达到最高。

实施例3

利用mfold软件在线预测核酸适配体的二级结构。

seqidno:1核酸适配体的二级结构预测结果如图3所示，核酸适配体形成特殊的茎环结构和发卡结构。

实施例4

取用实施例1或实施例2所得ssdna核酸适配体，进行afmp试剂盒组装，形成一种用于诊断鱼类是否被神经坏死病毒侵染的afmp检测试剂盒。

如图1所示，流式细胞仪检测本发明实施例1的ssdna核酸适配体与神经坏死病毒可以进行特导性结合的情况，检测结果具有较高的荧光值，而对照例相比实施例1，荧光值较低，不具有与神经坏死病毒进行特异性结合的能力，无法对神经坏死病毒进行特异性识别。

如图2所示，通过激光共聚焦显微镜检测本发明实施例1的ssdna核酸适配体与神经坏死病毒感染细胞可以进行特导性结合的情况，由图中可看出，对照例的卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞在荧光检测过程中不显示荧光，说明对照例ssdna核酸适配体无法与卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞进行特异性结合，不能对卵形鲳鲹源神经坏死病毒进行有效检测，而实施例1的荧光检测过程中卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞所在位置均有荧光显示，说明实施例1的ssdna核酸适配体可与卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞进行有效结合。

基于图1、2的结果，可以证明本发明实施例1所示的ssdna核酸适配体经过羟基荧光素等荧光物质或发光材料标记修饰后，仍可与卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞进行特异性结合，都可用于卵形鲳鲹源神经坏死病毒的检测。

本发明实施例1通过selex技术筛选得到的ssdna核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本发明实施例的ssdna核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于afmp检测试剂盒中，且本发明实施例1的ssdna核酸适配体相比于蛋白抗体具有制备周期短、重现性好、分子量小的特点，便于体外合成，在卵形鲳鲹源神经坏死病毒的检测领域有良好的应用前景。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

sequencelisting

<110>广西科学院

<120>特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用

<130>2018

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gtctgaagtagacgcaggagaactgtattagcctctgggtgccgcaccgtagtgccctat60

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