一种医用臭氧化油的制备方法与流程

本发明属于药物合成、有机合成领域，涉及一种医用臭氧化油的制备方法。

背景技术：

臭氧是氧气的同素异形体，具有极强的氧化性，作为一种无污染且不会产生耐药性的杀菌物质其作用已被广泛认可。研究发现，将富含不饱和脂肪酸的植物油脂经臭氧化处理后，可以产生过氧化氢、羟基-氢过氧化物、醛类、二聚过氧化物以及多聚过氧化物等氧化性物质，这些物质对微生物具有显著的广谱抗菌作用，很早就用于农作物的病虫害防治。现代药理学研究表明，医用臭氧化油具有强氧化性和广谱抗菌活性，且对纤维和上皮细胞具有高度的生物相容性。医用臭氧化油的应用从最初的皮肤消毒、治疗腰椎间盘突出，发展到治疗如骨关节病、病毒性肝炎、疼痛、溃疡病、妇科炎症、脑梗塞等多种疾病，最新的研究表明，医用臭氧化油还具有杀精、避孕的功能。医用臭氧化油在临床领域的广泛应用，促进了其合成方法和工艺的研究。

臭氧化油的合成方法研究较早，常用的方法是：在醇类和烷烃类有机溶剂中(或二者的混合溶剂)，以固定料溶比加入植物油，在控温条件下，通入臭氧鼓泡进行臭氧化反应，碘化钾溶液监测反应尾气，当碘化钾溶液变色时，反应终止，此时植物油被认定无法再吸收臭氧，确定反应过程臭氧耗量，即可作为所得臭氧化油的规格。该方法中用到了有毒的有机溶剂，在臭氧化油中有较大残留，虽然在农药领域中使用时影响不大，但是作为医用臭氧化油在使用中存在潜在风险。鼓泡反应中，通入大流量气体，不仅提供臭氧原料，同时也在一定程度上起到了搅拌作用，然而，随着反应的进行，体系粘度逐渐升高，单纯通过鼓泡来达到搅拌均匀的目的是非常困难的。碘化钾溶液监测反应是通过氧化反应来进行的，并不能准确检测臭氧化油中的活性成分。臭氧化油中溶解的o2、o3等气体组分非常容易逸出；而部分过氧化物的稳定性又比较差，因此以反应过程臭氧耗量作为臭氧化油的规格在臭氧化油的质量控制上存在明显的局限性。因此，研究和开发无溶剂残留、更符合医用要求的臭氧化油合成方法，不仅是医用臭氧化油临床应用的要求，同时也是有机化学产品制备工艺发展的需要。

核磁共振定量分析(qnmr)方法起步较晚，但是发展很快。qnmr的优点在于整个分析过程中无需引入校正因子，定量结果不受样品中其它杂质含量的影响。随着核磁共振技术的快速发展和日益成熟，核磁定量分析方法的准确度、灵敏度、专属性及分析速度等方面已达到或接近hplc的水平，中日欧美等药典中均收载此法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种医用臭氧化油的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)将植物油(含有不饱和脂肪酸或甘油酯成分)加入反应容器中；

2)控制反应容器中植物油的温度稳定后，将臭氧通入反应容器的油面(即反应容器中的植物油液面)以下，在所述温度以及一定的臭氧通入流量条件下进行臭氧化反应；

3)在臭氧化反应过程中对反应容器中的植物油进行搅拌(磁力或机械)，并采用nmr定量分析(qnmr)对反应体系进行检测，根据检测得到的反应体系中臭氧化油活性组分(例如，环氧化合物)的特征信号峰(例如，δ104ppm、δ43ppm)，同时参考反应副产物(例如，醛类)的特征信号峰(例如，δ202ppm)，确定反应终止时刻。

优选的，所述步骤1)中，反应容器中加入的植物油的体积为5ml～200l。

优选的，所述步骤2)中，温度控制在0℃～100℃，搅拌的转速为100rpm～3000rpm；臭氧以50ml/h～200l/h的流量通入植物油中。

优选的，所述臭氧的来源为空气源臭氧发生器(功率为50w～5000w)。

优选的，所述nmr定量分析中，首先将取自反应体系的样品溶解于氘代试剂后转移至核磁管(核磁管例如选自外径为1.7mm、2.1mm或5mm的石英或高硼硅核磁管)，然后采用nmr并利用碳共振频率对样品进行检测。

优选的，所述nmr定量分析的时间间隔为15min～90min；若h202/(h202+h104+h43)＞0.5％，则终止臭氧化反应，h202、h104和h43分别表示采用nmr检测的特征信号峰δ202ppm、δ104ppm和δ43ppm的峰高。

优选的，所述样品溶解中，样品的用量为1mg～200mg，氘代试剂的用量为0.2ml～1ml；所述氘代试剂选自cdcl3、dmso-d6、cd3od、acetone-d6、thf-d8、dmso-d6、benzene-d6、toluene-d8、pyridine-d5或acetonitrile-d3。

优选的，所述nmr的检测条件为：采用13c的共振频率，脉冲序列的角度为30～90度，弛豫时间≥5s，扫描次数为32次～8192次，探头温度为20℃～40℃，谱峰宽度≤219ppm。

优选的，所述臭氧化反应的时间为12小时～180小时。

本发明的有益效果体现在：

本发明采用无溶剂的反应条件，相对于现有制备方法来说，产品中无溶剂残留；同时本发明采用一步直接氧化法，具有合成路线短、操作简单、环境友好，适用于规模化合成的技术优势。本发明所制备的臭氧化油经抗菌实验验证，符合医用抗菌要求，活性高。

进一步的，本发明采用空气源的臭氧发生器来制备臭氧，虽然气流中臭氧含量相对较低，但是可以满足臭氧化反应的要求，且制造成本低，适用于工业化的合成。

进一步的，本发明为解决单纯鼓泡反应中搅拌不均匀的缺点，采用搅拌的方式，在高粘度条件下使反应体系混合更充分、更均匀，避免局部臭氧浓度过高而导致的副产物过多等问题。

进一步的，本发明在反应终点判定中采用¹³cnmr检测产物中的特征信号，而不是所有的氧化性物质(例如，残留的臭氧等)，可以更加准确的测定医用臭氧化油中的活性成分，可以获得抗菌活性高的医用臭氧化油产品，具有较高的产率和选择性。

进一步的，本发明通过优化脉冲序列中的角度、弛豫时间、扫描次数、探头温度等参数，消除了信号峰飘移对定量结果的影响，使活性组分定量更为准确，从而确保对反应终点的更为正确的判断。

附图说明

图1是以橄榄油为原料制备的臭氧化油的¹³cnmr图谱。

图2是反应时间与相对抑菌率的关系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

(一)臭氧化油制备

本发明提出一种以植物油为原料，利用臭氧与植物油进行臭氧化反应，结合nmr定量分析判定反应终点的臭氧化油制备方法，以下实施例选用的植物油原料均为食品级、非转基因植物油。其单不饱和脂肪酸或甘油酯的含量作为植物油原料选择的一个重要的参考。

实施例1

向配有搅拌(磁力)和温控装置的100ml的三口烧瓶中加入50ml橄榄油，设定反应温度为5℃，反应体系达到设定温度并稳定后，打开空气源型臭氧发生器，并设定功率为100w、臭氧产量为10g/h及臭氧含量为150ppm(其他通入的成分是空气中的氮气、氧气和少量二氧化碳等)，将空气源型臭氧发生器的气泡石置于三口烧瓶中油面以下，搅拌磁子以上。在向橄榄油中通入臭氧过程中搅拌转速设定为1500rpm，每30min检测一次反应产物。

制备检测样以及设定检测参数：取臭氧化反应产物100mg溶于0.4ml氘代氯仿(cdcl3)，转移至5mm标准核磁管，bruker400mhz测定样品的碳共振信号(¹³cnmr)，探头温控24℃，调用脉冲序列zgpg30(90度脉冲角度)，重新定义弛豫时间d1＝5s，扫描次数ns＝1024；其他参数为序列中的标准参数(例如，谱峰宽度为219ppm)，topspin3.5采集数据。¹³cnmr(cdcl3100mhz，图1)检测特征信号δppm：202、129、104、43。

随着反应进行，可以得到反应中不同时间点的检测结果，当h202/(h202+h104+h43)＝1％时(h为信号峰的峰高)，即反应副产物(例如，醛类)开始出现时，则判定反应达到终点。反应时间最终为22h。

反应结束后，停止搅拌，关闭臭氧发生器，自然升温至室温，拆除温控装置，转移反应得到的产物(即臭氧化油)。

实施例2

反应过程与实施例1相似，不同之处在于：采用配置机械搅拌装置的10l反应釜，反应釜内加入5l大豆油，控制反应温度为15℃，空气源型臭氧发生器的功率为1000w，臭氧产量为150g/h，搅拌转速设定为2500rpm，经¹³cnmr检测反应时间为72h。

实施例3

反应过程与实施例1相似，不同之处在于：采用配置机械搅拌装置的100l反应釜，反应釜内加入60l葵花籽油，控制反应温度为35℃，空气源型臭氧发生器(配有进气干燥系统)的功率为3000w，臭氧产量为400g/h，搅拌转速设定为1000rpm，经¹³cnmr检测反应时间为70h。

(二)抗菌实验

将实施例2中制备的臭氧化油进行体外抗菌实验。参考文献方法，采用液体培养基试管连续稀释法测定臭氧化油的最小抑菌浓度，平行3次。

以氨苄西林为阳性参考药物，阳性药物用吐温-80助溶，无菌培养管中加入100μl菌液和10μg药物，利用培养基逐级稀释至9号瓶；37℃温箱中培养24h。无细菌生长的培养基清亮，以未见细菌生长判定阳性药物(或臭氧化油)的最低抑菌浓度(mic)，结果见表1。

表1.臭氧化油的最低抑菌浓度

由表1可以看出，实施例2中的臭氧化油对多种细菌和真菌的抑制作用优于阳性药物，表明本发明制备的臭氧化油可用于有效杀灭病原微生物，有重要的临床应用(例如，体表消毒或灭菌)潜力。

(三)臭氧化油活性与反应时间的分析

以实施例2为例，取不同反应时间点的样品，利用抗菌实验测定相对杀菌率，并在达到反应终点后，继续通入臭氧直至臭氧无法被吸收。结果发现，超过反应时间后，抑菌活性普遍下降，与臭氧吸收量无关，但与活性组分(例如，δppm：104及43)的减少正相关(图2)。