本发明涉及一种基因多态性的试剂盒及方法,特别是涉及一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,属于基因检测技术领域。
背景技术:
调查研究表明,卡马西平、苯妥英等药物用于hla-b*1502等位基因阳性亚裔患者治疗出现史蒂文斯一约翰逊综合征sjs和中毒性表皮坏死松解症ten的严重皮肤反应的初步数据,hla-b*1502是一种人类白细胞抗原hla等位基因,几乎只存在于亚洲人种之中,包括中国汉族人、菲律宾人、马来西亚人、南亚印度人和泰国人。
在中国、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾和中国台湾地区估计有10%-15%甚至更多的患者携带hla-b*1502等位基因,包括印度人在内的南亚人携带该基因的比率中等,平均为2%-4%,但在一些人群中比率较高,日本人和韩国人携带此基因的比率较低,不到l%。
目前,卡马西平、苯妥英等抗癫痫的药品说明书建议,可能携带hla-b*1502等位基因的患者在接受卡马西平、苯妥英等抗癫痫卡马西平治疗之前应进行hla-b*1502等位基因筛查,筛查结果阳性的患者不宜使用卡马西平、苯妥英等抗癫痫,除非其效益明显大于风险。
hla-b*58:01等位基因位于人类第6号染色体,是人类白细胞抗原的基因型,hla-b*5801等位基因与别嘌呤醇引发的sjs或ten的强相关性首先由台湾学者在汉族人群中发现,并被泰国、新加坡、香港和中国多个研究小组在汉族人群中证实,在其他人种,日本人和韩国人也被证明呈现很强的相关性,欧洲病人中sjs与hla-b*5801呈现相对较弱的相关性。
2012年美国风湿病学会更新了痛风管理指南,其中建议使用别嘌呤醇前,对严重过敏反应的高危人群,建议进行hla-b*5801等位基因检测,该高危人群包括韩国裔、中国裔汉族和泰国裔,因此,hla-b*5801与别嘌呤醇引发的sjs或ten的强相关性有种族差异性,汉族人中hla-b*5801等位基因频率为6-15%,具有地域差异。
技术实现要素:
本发明的主要目的是为了提供一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,解决现有技术中检测hla-b*1502和hla-b*5801基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到:
一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒,相关基因多态性包括hla-b*1502和hla-b*5801基因多态性,试剂盒包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。
进一步的,基因检测试剂包括:
检测hla-b*1502引物对seqidno.1和seqidno.2;
检测hla-b*1502特异性探针seqidno.3;
检测hla-b*5801引物对seqidno.4和seqidno.5;
检测hla-b*5801特异性探针seqidno.6;
探针核酸序列5’采用fam、tet、vic、hex和rox中的一种修饰,探针核酸序列3’采用mgb-nfq基团修饰。
进一步的,检测hla-b*1502引物seqidno.1为1502上游引物:5’-gccgcgagtcgaggat-3’;
检测hla-b*1502引物seqidno.2为1502下游引物:5’-gttgtagtaccgcgcaggt-3’;
检测hla-b*1502特异性探针seqidno.3为1502荧光探针:5’-荧光基团-acacacagatctcc-mgb-nfq-3’;
检测hla-b*5801引物seqidno.4为5801上游引物:5’-gacccagttcgtgaggttcc-3’;
检测hla-b*5801引物seqidno.5为5801下游引物:5’-agttccgtgtctccccgtg-3’;
检测hla-b*5801特异性探针seqidno.6为5801荧光探针:5’-荧光基团-ctccgtcctctgactc-mgb-nfq-3’。
进一步的,基因检测试剂还包括用于内参的引物对seqidno.7、seqidno.8及内参探针seqidno.9,探针采用taqman探针;
seqidno.7为内参上游引物:
5’-ccttcctgccaccgctgat-3’;
seqidno.8为内参下游引物:
5’-tgccttcgcaaccattccctta-3’;
内参探针seqidno.9:
5’-荧光基团-cgctatgctccgcgcgcatcgtctgctc-bhq-3’。
进一步的,基因检测试剂还包括具有抗pcr酶抑制剂的pcr预混液taqpathproampmastermix,预混液包含经修饰后的hotstart-taq聚合酶、ung酶、rox荧光校准染料、dntp、mgcl2、pcrbuffer。
进一步的,样本处理试剂用于人全血样本处理,基因检测试剂采用pcr8联管单人份预混分装。
进一步的,阳性对照品为混合hla-b*15:02、hla-b*58:01基因质粒dna和内参质粒dna;阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。
一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的方法,包括如下步骤:
步骤1:样本快速处理,取edta抗凝全血样本,取2μl,加入20μl样本处理试剂,在37℃条件下孵育5min;
步骤2:将步骤1所得样本2μl,加入到18μl预混分装的基因检测试剂中,混匀后进行pcr扩增;
步骤3:设置仪器反应流程和反应参数;
步骤4:确定样本基因分型,若检测结果有s型扩增曲线升起,且ct.值小于阳性判定值,则为阳性检测结果,若无曲线升起或ct.值大于阳性判定值,判读为不含该基因型。
进一步的,步骤3中,设置的仪器反应参数为:
第1阶段:95℃,10min,1个循环;
第2阶段:95℃,10s,40个循环;
第3阶段:60℃,30s,40个循环,在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。
进一步的,阳性检测结果判定值如下:
内参ct值:≤32;
检测通道ct.值:≤32;
基因型别:含被测hla-b5801或hla-b1502基因。
本发明的有益技术效果:
1、本发明提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,为提升检测的特异性和灵敏性,采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和mgb-nfq荧光探针,进行特异扩增和实时检测分析,使检测能从hla-b多达几千种等位基因多态性中准确、特异、灵敏地检出目的基因变异。
2、本发明提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,检测等位基因包括hla-b*15:02、hla-b*58:01,本发明试剂盒组成包括用于样本快速处理的试剂、单管预混完成的基因检测试剂、混合被测靶基因质粒dna的阳性对照品,不含靶基因的阴性对照品。
3、本发明提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,基因检测试剂具有较强的抗pcr抑制物能力和多重pcr功能,检测时无需gdna提取纯化、只需将全血样本细胞快速裂解处理后即可加入单管预混的pcr反应液,不同的被测靶基因分别采用不同的引物对进行基因扩增,并采用不同的荧光染料基团标记的探针进行实时检测分析,实现一个反应体系同时对多基因变异的检出。
4、本发明提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,在保证检出特异性和灵敏的基础之上,实现便捷、快速、高效地检测,减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本,有利于临床检测分析应用。
附图说明
图1为本发明检测结果含hla-b*1502,不含hla-b*5801;
图2为本发明检测结果含hla-b*5801,不含hla-b*1502;
图3为本发明检测结果同时含hla-b*1502/*5801;
图4为本发明检测结果同时不含hla-b*1502/*5801。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案,下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
在本实施例中,根据图形结果判读基因型,根据图1标记hla-b*1502荧光探针有扩增曲线,标记hla-b*5801荧光探针无扩增曲线,标记内参荧光探针有扩增曲线,表示样本只含hla-b*1502样本的检测结果。
在本实施例中,根据图形结果判读基因型,根据图2标记hla-b*1502荧光探针无扩增曲线,标记hla-b*5801荧光探针有扩增曲线,标记内参荧光探针有扩增曲线,表示样本只含hla-b*5801样本的检测结果。
在本实施例中,根据图形结果判读基因型,根据图3标记hla-b*1502荧光探针有扩增曲线,标记hla-b*5801荧光探针有扩增曲线,标记内参荧光探针有扩增曲线,表示样本含有hla-b*5801/hla-b*1502一对等位基因。
在本实施例中,根据图形结果判读基因型,根据图4标记内参荧光探针有扩增曲线,无其他信号探针荧光曲线,表示该样本既不含hla-b*1502等位基因,也不含hla-b*5801等位基因。
本实施例提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒,相关基因多态性包括hla-b*1502和hla-b*5801基因多态性,试剂盒包括用于用于人全血样本处理的样本处理试剂、采用pcr8联管单人份预混分装的基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品,阳性对照品为混合hla-b*15:02、hla-b*58:01基因质粒dna和内参质粒dna,阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。
在本实施例中,基因检测试剂包括:
检测hla-b*1502引物对seqidno.1和seqidno.2,seqidno.1为1502上游引物:5’-gccgcgagtcgaggat-3’,seqidno.2为1502下游引物:5’-gttgtagtaccgcgcaggt-3’;
检测hla-b*1502特异性探针seqidno.3,seqidno.3为1502荧光探针:5’-荧光基团-acacacagatctcc-mgb-nfq-3’;
检测hla-b*5801引物对seqidno.4和seqidno.5,seqidno.4为5801上游引物:5’-gacccagttcgtgaggttcc-3’,seqidno.5为5801下游引物:5’-agttccgtgtctccccgtg-3’;
检测hla-b*5801特异性探针seqidno.6,seqidno.6为5801荧光探针:5’-荧光基团-ctccgtcctctgactc-mgb-nfq-3’。
探针核酸序列5’采用fam、joe、vic、ned和rox中的一种修饰,探针核酸序列3’采用mgb-nfq基团修饰。
在本实施例中,基因检测试剂还包括用于内参的引物对seqidno.7、seqidno.8及内参探针seqidno.9,探针采用taqman探针,5’修饰cy5荧光基团,3’采用bhq修饰;
seqidno.7为内参上游引物:
5’-ccttcctgccaccgctgat-3’;
seqidno.8为内参下游引物:
5’-tgccttcgcaaccattccctta-3’;
内参探针seqidno.9:
5’-荧光基团-cgctatgctccgcgcgcatcgtctgctc-bhq-3’。
在本实施例中,基因检测试剂还包括具有抗pcr酶抑制剂的pcr预混液taqpathproampmastermix,预混液包含经修饰后的hotstart-taq聚合酶、ung酶、rox荧光校准染料、dntp、mgcl2、pcrbuffer等。
本实施例还提供了快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的方法,包括如下步骤:
步骤1:样本快速处理,取edta抗凝全血样本,取2μl,加入20μl样本处理试剂,在37℃条件下孵育5min;
步骤2:将步骤1所得样本2μl,加入到18μl预混分装的基因检测试剂中,混匀后进行pcr扩增;
步骤3:设置仪器反应流程和反应参数,设置的仪器反应参数为:
第1阶段:95℃,10min,1个循环;
第2阶段:95℃,10s,40个循环;
第3阶段:60℃,30s,40个循环,在第3阶段打开荧光通道收集荧光值;
步骤4:确定样本基因分型,若检测结果有s型扩增曲线升起,且ct.值小于阳性判定值,则为阳性检测结果,若无曲线升起或ct.值大于阳性判定值,判读为不含该基因型。
在本实施例中,阳性检测结果判定值如下:
内参ct值:≤32;
检测通道ct.值:≤32;
基因型别:含被测hla-b5801或hla-b1502基因。
在本实施例中,本实施例提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,为提升检测的特异性和灵敏性,采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和mgb-nfq荧光探针,进行特异扩增和实时检测分析,使检测能从hla-b多达几千种等位基因多态性中准确、特异、灵敏地检出目的基因变异。
在本实施例中,本实施例提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,检测等位基因包括hla-b*15:02、hla-b*58:01,本发明试剂盒组成包括用于样本快速处理的试剂、单管预混完成的基因检测试剂、混合被测靶基因质粒dna的阳性对照品,不含靶基因的阴性对照品。
在本实施例中,本实施例提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,基因检测试剂具有较强的抗pcr抑制物能力和多重pcr功能,检测时无需gdna提取纯化、只需将全血样本细胞快速裂解处理后即可加入单管预混的pcr反应液,不同的被测靶基因分别采用不同的引物对进行基因扩增,并采用不同的荧光染料基团标记的探针进行实时检测分析,实现一个反应体系同时对多基因变异的检出。
在本实施例中,本实施例提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,在保证检出特异性和灵敏的基础之上,实现便捷、快速、高效地检测,减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本,有利于临床检测分析应用。
在本实施例中,本实施例针对现有技术检测hla-b*1502和hla-b*5801基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等不足,提供了一种基于rt-pcr技术平台的检测试剂盒和方法。
在本实施例中,本实施例为提升检测的特异性和灵敏性,采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和mgb-nfq荧光探针,进行特异扩增和实时检测分析,使检测能从hla-b多达几千种等位基因多态性中准确、特异、灵敏地检出目的基因变异。
引物和探针设计如下:
1502上游引物:
5’-gccgcgagtcgaggat-3’(seqidno.1)
1502下游引物:
5’-gttgtagtaccgcgcaggt-3’(seqidno.2)
1502荧光探针:
5’-荧光基团-acacacagatctcc-mgb-nfq-3’(seqidno.3)
5801上游引物:
5’-gacccagttcgtgaggttcc-3’(seqidno.4)
5801下游引物:
5’-agttccgtgtctccccgtg-3’(seqidno.5)
5801荧光探针:
5’-荧光基团-ctccgtcctctgactc-mgb-nfq-3’(seqidno.6)
内参上游引物:
5’-ccttcctgccaccgctgat-3’(seqidno.7)
内参下游引物:
5’-tgccttcgcaaccattccctta-3’(seqidno.8)
内参探针:
5’-荧光基团-cgctatgctccgcgcgcatcgtctgctc-bhq-3’(seqidno.9)
在本实施例中,本实施例针对样本需要进行gdna提取纯化等耗时、耗力、耗费的操作,配套了样本快速处理试剂,极大地降低了操作步骤和操作时间。具体地处理方法为:取2μledta抗凝全血样本,加入到20μl样本处理试剂,在37℃条件下孵育5min即完成处理。
在本实施例中,本实施例针对样本处理方式的改变和多重pcr反应体系的要求,采用含经修饰的hotstart-taq聚合酶和优化的缓冲体系的pcr预混液-taqpathproampmastermix,使检测体系对于样本的抗抑制能力大大提升,使基因检测试剂具备高效多重pcr反应能力,预混液含稳定试剂成分,有利于混合状态下的试剂长期稳定保存,增强了试剂的稳定性。
在本实施例中,本实施例针对每次检测,每个检测体系只能进行单重pcr反应,每次只能检测一个基因位点多态性的不足,基因检测试剂将多对引物和多条特异性荧光探针与pcrmix预混成一个反应体系,利用taqpathproampmastermix预混液多重反应能力,使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重pcr扩增,并利用标记不同荧光染料基团的mgb-nfq和taqman-bhq荧光探针对目标产物进行实时检测分析。所有检测引物和特异性探针配制成一个检测试剂,预混单管包装,方便检测,实现了一个反应体系的多基因变异分析。减低生产和检测成本的同时提升了检测效率。检测试剂组成成分如表1所示:
表1检测试剂组成成分
在本实施例中,本实施例针对检测质控需求,设置了阳性对照品,和阴性对照品。阳性对照品为混合hla-b*1502、hla-b*5801基因及内参基因质粒的混合核酸溶液,浓度0.01-1pg/μl,空白对照是不含基因核酸的超纯水。检测时视对照品为待测样本,加入基因检测试剂,阳性对照品各检测信号和内参信号曲线应呈s型升起,且对应ct.值小于阳性判定值。空白对照品应无曲线升起,且对应ct.值大于阳性判定值,否则检测失效,结果不可信。
在本实施例中,本实施例的检测流程:
第1步:样本快速处理,取edta抗凝全血样本,取2μl,加入20μl样本处理试剂,在37℃条件下孵育5min。
第2步:将第一步所得样本2μl,加入到18μl预混分装的基因检测试剂中,混匀后进行pcr扩增;
第3步:设置仪器反应流程和参数用于检测反应的反应参数为:
第1阶段:95℃,10min,1个循环;
第2阶段:95℃,10s,40个循环;
第3阶段:60℃,30s,40个循环;
在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。
第4步:根据扩增曲线升起情况和每个荧光通道ct.值确定样本基因分型,检测阳性结果应有典型s型扩增曲线升起,且ct.值小于阳性判定值。若无曲线升起或ct.值大于阳性判定值,判读为不含该基因型。
检测时设置仪器反应参数,打开仪器相应荧光收集通道。
在第3阶段打开荧光通道收集荧光值,仪器根据通道荧光信号值变化情况,生产扩增曲线并获得扩增ct.值。
阳性值判定:
各检测通道的ct.阳性判定值均为32,大于32为阴性,小于30提示待样本含有被测靶基因。
将金标准sanger测序法鉴定为含hla-b*1502基因样本、含hla-b*5801基因样本、同时含hla-b*1502/5801基因的样本和同时不含hla-b*1502/5801基因的样本。使用本试剂盒同步盲测,最后揭盲,与测序结果对比,结果本试剂盒及检测方法测得的结果均与测序法结果相符。
综上所述,在本实施例中,本实施例提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法,针对现有技术检测hla-b*1502和hla-b*5801基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等不足,为提升检测的特异性和灵敏性,采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和mgb-nfq荧光探针,进行特异扩增和实时检测分析,使检测能从hla-b多达几千种等位基因多态性中准确、特异、灵敏地检出目的基因变异。
以上所述,仅为本发明进一步的实施例,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内,根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变,都属于本发明的保护范围。