一种耐受高浓度葡萄糖的L-丙氨酸生产菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种耐受高浓度葡萄糖的l-丙氨酸生产菌株及其应用，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：l-丙氨酸是最小的手性分子之一，在医药、食品、日化等领域用途广泛。在医药领域，l-丙氨酸常被添加到输液中，也是合成维生素b6和氨基丙醇的主要原料；在食品领域，l-丙氨酸可以作为天然甜味剂对改善调味剂的味感和有机酸的酸。l-丙氨酸的生产工艺主要包括酶催化法和发酵法。酶催化法是通过培养富有l-天冬氨酸-β-脱羧酶asd(ec4.1.1.12)活力的微生物细胞，催化l-天冬氨酸得到l-丙氨酸。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备要求简易，提取工艺简单，但主要原材料l-天冬氨酸的价格高，其生产原料为富马酸，富马酸是经石油炼制生产的，石油资源属于不可再生资源。发酵法通常是通过代谢工程和合成生物学手段改造遗传背景清晰的大肠杆菌，实现l-丙氨酸的高产。本课题组通过对大肠杆菌k12进行代谢工程改造，同时通过两阶段控制进行补料发酵，实现发酵42h，l-丙氨酸产量达到153.9g/l(专利号：201810033877.9)，达到了工业化水平。发酵法生产l-丙氨酸是以葡萄糖为碳源，葡萄糖为可持续再生生物质资源，生产成本降低。发酵法生产通常采用两阶段发酵，前期好氧发酵可以有利于菌体积累，后期厌氧发酵游离与产物l-丙氨酸积累，同时需要发酵过程中需多次补加葡萄糖，发酵工艺相对复杂，而培养基中添加高浓度葡萄糖会影响菌体生长与产品积累。技术实现要素：本发明以高产l-丙氨酸的大肠杆菌e.coliδ5d2(专利号：201810033877.9)为出发菌株，通过连续培养不断提高葡萄糖浓度进行适应性进化，获得耐受高浓度葡萄糖的大肠杆菌，在发酵培养基中一次性添加高浓度葡萄糖，无需补料，简化了发酵工艺。本发明的第一个目的在于提供一株在高浓度葡萄糖条件下高产l-丙氨酸的大肠杆菌fmme-a232，所述大肠杆菌fmme-a232已于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018628，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本发明的第二个目的是提供所述大肠杆菌fmme-a232在食品和/或药品中的应用可选的，所述应用是使用大肠杆菌fmme-a232生产l-丙氨酸。本发明的第三个目的在于提供一种发酵生产l-丙氨酸的方法，所述方法是利用所述大肠杆菌fmme-a232发酵生产l-丙氨酸。可选的，所述利用所述大肠杆菌fmme-a232发酵生产l-丙氨酸，包括：将fmme-a232菌株接种于种子培养基，33～37℃震荡培养12～16h，按照5～15％接种量接种于发酵培养基，前期好氧发酵，温度28～32℃，空气量1.0～1.5vvm，搅拌300～400rpm培养18～30h，后期限氧阶段将通气量降低至0.01～0.1vvm，温度上升至40～45℃，继续搅拌50～100rpm，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵。可选的，所述种子培养基成分包括：葡萄糖15～25g/l，酵母粉3～6g/l，大豆蛋白胨2～6h/l，nacl5～10g/l。可选的，所述发酵培养基成分包括：葡萄糖180～220g/l，酵母粉4～6g/l，(nh4)2so42～6g/l，k2hpo4·12h2o4～8g/l，kh2po43～5g/l，mgso4·7h2o0.4～0.6g/l。本发明的第四个目的是提供一种包含所述大肠杆菌fmme-a232的微生物制剂。本发明的第五个目的在于提供所述包含大肠杆菌fmme-a232的微生物制剂在食品和/或药品中的应用。可选的，所述应用是使用包含大肠杆菌fmme-a232的微生物制剂生产l-丙氨酸。本发明的有益之处：大肠杆菌是最常用的细胞工厂，遗传背景清晰，对能够高产l-丙氨酸的菌种进行适应性进化，筛选获得在高浓度葡萄糖下生长产酸的突变株fmme-a232，在30l发酵罐中发酵55h，l-丙氨酸产量达到171.0g/l，简化了生产工艺同时保证了l-丙氨酸的高效生产。生物材料保藏信息：大肠杆菌escherichiacolifmme-a232，于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018628，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。附图说明图1：突变株fmme-a232生产l-丙氨酸发酵过程成分变化曲线图。具体实施方式下述实施例中，都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。下述实施例中，高产l-丙氨酸的大肠杆菌e.coliδ5d2是在专利号：201810033877.9中构建获得，进行适应性进化后的突变株大肠杆菌fmme-a232已于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018628，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。氨基酸检测方法：采用常规的高效液相色谱检测。葡萄糖测定方法：使用sba-40生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行分析。生产强度的计算：生产强度(g/l/h)＝l-丙氨酸产量(g/l)/发酵时间(h)。葡萄糖得率的计算：葡萄糖得率(％)＝l-丙氨酸最高产量(g/l)/总葡萄糖添加(g/l)x100实施例1：耐受高浓度葡萄糖大肠杆菌的适应性进化以菌株e.coliδ5d2为出发菌株，在120g/l葡萄糖培养基中培养12h后，按照葡萄糖浓度140g/l、160g/l、180g/l、200g/l、220g/l培养基逐级转接，并在相应的140g/l、160g/l、180g/l、200g/l、220g/l葡萄糖浓度的筛选平板上涂布分离单菌落，放入培养箱中37℃培养18～30h，选出菌落大且饱满的单菌落，进行摇瓶发酵，多轮筛选获得能够稳定生长且产酸高的菌株，筛选菌株进行多次传代培养，保证l-丙氨酸生产的稳定性，通过在高浓度葡萄糖中适应性进化，共筛选大肠杆菌240株，能够在高葡萄糖浓度条件下高产l-丙氨酸的大肠杆菌且该菌株传代5代后，生产性能仍然稳定，该菌株命名为fmme-a232。筛选液体培养基：140～220g/l不同浓度葡萄糖，酵母粉10g/l，胰蛋白胨5g/l，nacl5g/l，筛选固体培养基添加2～3％琼脂粉。发酵种子培养基为常规lb培养，摇瓶发酵培养基：葡萄糖120～180g/l，酵母粉1～2g/l，(nh4)2so41～3g/l，k2hpo4·12h2o4～8g/l，kh2po43～5g/l，mgso4·7h2o0.4～0.6g/l。筛选菌株摇瓶发酵条件：按照5～10％接种量接种，分为好氧-限氧两阶段发酵培养。好氧菌体生长阶段以35℃、200rpm培养至细胞od600达到20，限氧发酵阶段40℃，25rpm震荡培养，发酵周期为60～80h。实施例2：不同葡萄糖浓度对fmme-a232发酵生产l-丙氨酸的影响种子培养基成分：葡萄糖15g/l，酵母粉5g/l，大豆蛋白胨5h/l，nacl10g/l。发酵培养基成分：葡萄糖180～220g/l，酵母粉4g/l，(nh4)2so46g/l，k2hpo4·12h2o4g/l，kh2po44g/l，mgso4·7h2o0.5g/l。在摇瓶培养基中设置葡萄糖浓度为180g/l、200g/l和220g/l，每个浓度设置三组平行，考察在不同葡萄糖浓度对fmme-a232发酵生产l-丙氨酸的影响，培养方式同实施例1。实验结果如表1，当发酵培养基中葡萄糖浓度为200g/l时，发酵65h时l-丙氨酸浓度达到159.6g/l，此时葡萄糖得率和l-丙氨酸生产强度达到79.8％和2.45g/l/h；当再提高葡萄糖浓度至220g/l时，发酵周期延长了10h，葡萄糖得率和l-丙氨酸的生产强度均出现显著下降。表1：不同葡萄糖浓度对fmme-a232生产l-丙氨酸的影响实施例3：原始菌株与突变菌株l-丙氨酸生产性能比较种子培养基成分同实施例2。发酵培养基成分：葡萄糖浓度为200g/l，其余成分同实施例2。在5l发酵罐中考察在200g/l葡萄糖浓度下，出发菌株e.coliδ5d2和fmme-a232的发酵特性。将菌株接种于种子培养基，37℃震荡培养16h，按照8％接种量接种于发酵培养基，前期好氧发酵，温度32℃，空气量1.0vvm，搅拌转速400rpm培养15～25h，后期限氧阶段将通气量降低至0.05vvm，温度上升至43℃，搅拌转速调整为50rpm，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵，发酵过程取样检测l-丙氨酸和葡萄糖浓度。两株菌株发酵结果如表2：fmme-a232经过定向进化，其耐受葡萄糖能力提高，延迟期为10h，发酵周期55h，出发菌株e.coliδ5d2延迟期长达20h，发酵周期为65h；突变后fmme-a232菌株l-丙氨酸产量和葡萄糖得率分别为150.8g/l和78.0％，相比原始菌株分别提高了17.3％和8.63％。表2不同大肠杆菌发酵特性发酵参数出发菌株e.coliδ5d2突变株fmme-a232发酵周期(h)6555延迟期(h)2010葡萄糖(g/l)20.96.66l-丙氨酸(g/l)128.6150.8葡萄糖得率(％)71.878.0生产强度(g/l/h)1.982.74实施例4：突变株fmme-a232的小试发酵种子培养基和发酵培养基成分同实施例3。在30l发酵罐中装液量为21l，考察fmme-a232的小试发酵特性：将菌株接种于种子培养基，37℃震荡培养16h，按照15％接种量接种于发酵培养基，前期好氧发酵，温度37℃，空气量1.5vvm，搅拌转速400rpm培养10h，后期限氧阶段将通气量降低至0.05vvm，温度上升至45℃，搅拌转速调整为75rpm，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵，发酵过程取样检测l-丙氨酸和葡萄糖浓度。发酵过程如图1所示，发酵时间55h，l-丙氨酸产量达到171.0g/l。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12