木聚糖酶xyn11A及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及木聚糖酶xyn11a及其编码基因与应用。

背景技术：

木聚糖酶是一大类降解木聚糖的酶系，可用来降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。在木聚糖酶系中，β-1,4-内切木聚糖酶是最关键的水解酶，水解木聚糖产生低聚木糖，即木二糖至木六糖。木聚糖酶可从动物、植物和微生物中等有机体中获得。目前，报道较多的是微生物来源的木聚糖酶，主要来源于大肠杆菌和芽孢杆菌等细菌与黑曲霉、木霉菌以及酵母菌等真菌微生物。目前已经发现的木聚糖酶分属于不同的糖苷水解酶家族(gh),如gh5、gh6、gh10、gh11、gh43等家族。由于不同家族的木聚糖酶生物学性质差异大，因此木聚糖酶应用广泛，应用领域相对较多，主要领域有：

(1)在食品行业中的应用。低聚木糖是一种最有前途的功能性低聚糖，可以调节肠道菌群结构，选择性地促进肠道双歧杆菌等益生菌的增殖，木聚糖酶能从玉米秸秆、玉米芯等天然食物半纤维中分解得到低聚木糖。另外，木聚糖酶也可应用于面包制造业和酿酒工业中。有研究表明，在面包制作过程中，加入木聚糖酶，不仅可以改变面团的流变学特征，还可以增强面包的柔软度和拉力、减缓面包衰老等，增强面包口感，延长面包保质期。木聚糖酶也可应用于酿酒工业中，可以提高发酵的效率，降低发酵液的粘度，改善啤酒的品质。

(2)在饲料工业中的应用。组成植物细胞壁的主要成分之一是木聚糖，小麦、大麦等麦类饲料中含有大量的木聚糖，直接饲喂动物会影响动物吸收营养成分，利用木聚糖酶降解麦类饲料中含有的木聚糖的生物活性，破坏植物的细胞壁结构利于动物对植物内营养物质的吸收。woyengo等人的研究表明，在以小麦豆粕为基础日粮的基础上，添加木聚糖酶能提高仔猪的生产性能，改善仔猪肠道健康。widodo等人的研究表明，在肉鸡小麦基础饲料中添加木聚糖酶，与对照组相比，会提高营养物质的消化率，改善肉鸡的生长性能，另外，在牛等反刍动物中添加木聚糖酶也有相同的效果。

(3)在造纸领域中的应用。造纸生产分为制浆和造纸两个基本过程。在制浆过程中，一般使用物理化学方法，而生物技术微生物酶的使用可以减少化学品用量，目前使用最多的是木聚糖酶。木聚糖经木聚糖酶的水解，从而提高植物原料的脱木素程度，显著改善制浆性能。在纸浆漂白过程中，木聚糖酶水解木质纤维中的木聚糖使纤维结构变得更加松散有利于漂白剂的进入和木素的溶出，一方面能加快漂白的进程，另外一方面可以减少化学类漂白剂的使用量，从而减少环境污染。另外，也有研究表明，木聚糖酶可以应用于废纸脱墨和造纸废水处理等方面，减少环境污染。

此外，木聚糖酶在生物能源领域也有所应用，如利用木聚糖酶将木聚糖转化为生物燃料等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的木聚糖酶xyn11a及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供木聚糖酶xyn11a，其为如下a)或b)：

a)由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)seqidno:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由a)衍生的蛋白质。

木聚糖酶xyn11a属于糖苷水解酶第11家族(gh11)，gh11家族木聚糖酶具有相似的催化域，生物活性相似，底物特异性都比较高、相对分子质量一般小于30kda等特点。本发明的木聚糖酶xyn11a基因(seqidno:1)可以从保藏编号cgmccno.0608的硫色曲霉(aspergillussulphureus)中克隆得到。该菌株可参见cn01141789.7。

第二方面，本发明提供木聚糖酶xyn11a截短体，所述截短体是去除信号肽后的蛋白截短体，其为如下a)或b)：

a)由seqidno:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)seqidno:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由a)衍生的蛋白质。

第三方面，本发明提供所述截短体的编码基因，其为全长优化后的基因序列，核苷酸序列如seqidno:4所示。

第四方面，本发明提供含有所述木聚糖酶xyn11a的编码基因或所述截短体的编码基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

优选地，用于构建表达木聚糖酶xyn11a的基因工程菌的出发菌株为毕赤酵母，如毕赤酵母x-33。

第五方面，本发明提供所述木聚糖酶xyn11a或所述截短体的以下任一应用：

i)在降解木聚糖中的应用；

ii)在制备用于降解木聚糖的酶制剂中的应用。

其中，所述木聚糖酶xyn11a或所述截短体的最适催化温度为40℃，最适ph为5。

木聚糖酶xyn11a及其截短体在ph3-8之间可保持较高的相对酶活性；xyn11a酶对金属离子以及edta常温作用1h的耐受性不一致，na⁺、mg²⁺、zn²⁺等金属离子会抑制酶活性，但相对酶活性在80％以上，而edta和fe³⁺、co²⁺、cu²⁺等金属离子降低酶活性分别为63.7％、73.2％、44.7％和71.3％。用木聚糖作为底物测定木聚糖酶的动力学参数，结果显示木聚糖酶针对底物木聚糖的km和vmax分别是12.00mg/ml和1111.11u/ml。

第六方面，本发明提供所述木聚糖酶xyn11a的编码基因或所述截短体的编码基因的以下任一应用：

i)在构建降解木聚糖的基因工程菌中的应用；

ii)在构建降解木聚糖的转基因细胞系中的应用。

第七方面，本发明提供含有所述木聚糖酶xyn11a的编码基因或所述截短体的编码基因的生物材料在构建降解木聚糖的基因工程菌或转基因细胞系中的应用，其中，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体或病毒载体。

第八方面，本发明提供携带所述木聚糖酶xyn11a的编码基因或所述截短体的编码基因的工程菌的以下任一应用：

①在降解木聚糖中的应用；

②在制备用于降解木聚糖的菌剂中的应用；

③在制备降解木聚糖的酶制剂中的应用。

第九方面，本发明提供用于降解木聚糖的制剂或组合物，其活性成分选自所述木聚糖酶xyn11a、所述截短体、携带所述木聚糖酶xyn11a的编码基因或所述截短体的编码基因的工程菌或转基因细胞系中的至少一种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过分析保藏编号cgmccno.0608的硫色曲霉(aspergillussulphureus)全基因组测序结果，首次发现一条新的木聚糖酶基因序列，其编码木聚糖酶xyn11a，木聚糖酶xyn11a或携带木聚糖酶xyn11a基因的工程菌能高效降解木聚糖。木聚糖酶xyn11a基因可用于构建降解木聚糖的基因工程菌，亦可用于生产降解木聚糖的酶制剂，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明实施例4中木聚糖酶xyn11a在不同ph条件下的相对催化活性。

图2为本发明实施例4中木聚糖酶xyn11a在不同温度条件下的相对催化活性。

图3为本发明实施例4中木聚糖酶xyn11a的酶动力学参数。其中，1/v代表酶活的倒数，1/s代表底物浓度的倒数。

图4为本发明实施例5中木聚糖酶xyn11a降解木聚糖液相色谱图。其中，a,木聚糖酶xyn11a降解木聚糖10min反应产物液相色谱图；b,木寡糖标准品液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。

实施例1硫色曲霉的培养及其dna的提取

将保藏编号cgmccno.0608的硫色曲霉(aspergillussulphureus)接种到灭菌的培养基(3.5g马铃薯葡萄糖琼脂培养基，5gd-麦芽糖，1g酵母提取物，2g蛋白胨，溶于100ml蒸馏水中，分装后再高压灭菌20min)中，30℃培养72h。过滤菌体，置于液氮中研磨，利用真菌基因组dna提取试剂盒(omega公司，美国)提取硫色曲霉全基因，并将硫色曲霉全基因进行基因组测序。

实施例2木聚糖酶xyn11a基因克隆

分析硫色曲霉全基因组测序的结果，发现一条新的木聚糖酶基因序列xyn11a，基因序列全长651bp，编码216个氨基酸(seqidno:2)。对此进行优化设计，利用ncbiproteinblast网站比对出在蛋白质数据库(non-redundantproteinsequences)中与硫色曲霉木聚糖酶xyn11a基因序列的相似性最高为83％，因此xyn11a是一条新的木聚糖酶蛋白序列。

在北京擎科生物科技有限公司直接合成优化xyn11a基因序列(seqidno:4)，连接到ppiczαa载体上，转化入大肠杆菌(escherichiacoil)top10感受态细胞中(北京天根生化科技有限公司)，构建重组克隆质粒，通过含zeocin(25μg/ml)(invitrogen公司，美国)的lb固体培养基筛选，并测序验证重组克隆质粒。

实施例3高效分泌表达木聚糖酶毕赤酵母工程菌株的构建

将转化的大肠杆菌挑取单菌落接种于含有10ml的lb液体培养基的50ml摇瓶中，37℃培养过夜，用质粒提取试剂盒(omega公司，美国)提取高纯度重组克隆质粒，重组质粒用saci(takara公司，日本)线性化后，电击转化重新制备的毕赤酵母x-33感受态细胞中，涂布含有zeocin(100ug/ml)的ypds固体平板培养基上，于28℃培养，直至长出清晰的菌落。挑取单菌落划线至含有zeocin(100ug/ml)的ypd固定平板培养基上，28℃培养，所得菌株即为木聚糖酶xyn11a毕赤酵母表达工程菌株。

挑取重组毕赤酵母菌株，接种于含20mlbmgy(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb(北京莱索宝科技有限公司)，4×10^-5％生物素(biotin)，1％甘油，100mmph6.0磷酸盐缓冲液)培养基的250ml摇瓶中，于28℃、250rpm摇床培养至od600值为2-6，然后离心收集菌体，用bmmy(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.1mol/l磷酸缓冲液ph6.0，1.34％ynb，4×10^-5％生物素)重悬菌体，使od600约为1.0，再用终浓度为0.5％(v/v)的甲醇进行摇瓶诱导培养72h，每12h添加一次甲醇。

将浓度为0.8％木聚糖底物(sigma公司，美国)溶液于40℃水浴预热5min，然后再分别吸取用ph5的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液稀释100的酶液和水浴后木聚糖底物溶液各80μl充分混合，于40℃恒温水浴20min，加入200μldns终止反应，振荡混匀，沸水中煮5min，在流动的自然水下冷却至室温，用蒸馏水定容至1ml，利用酶标仪测定吸光度od540，根据dns标准曲线得到的od540与底物还原性糖浓度的关系，计算得出木聚糖酶降解后还原性糖的浓度，从而计算得出木聚糖酶的酶活。

酶活定义：在ph5.0、40℃条件下，每分钟内底物降解释放1μmol还原性糖所需的酶量为一个酶活单位(u)。酶活分析结果表明，优化型菌株表达的木聚糖酶的酶活为170u/ml。

实施例4木聚糖酶毕赤酵母工程菌株的酶学性质

将木聚糖酶毕赤酵母工程菌株摇瓶发酵后，离心过滤收集酶液。将收集的酶液经过sds-page分析，表达产物的大小约为18kda。

将酶液适当稀释后，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃温度下测定并计算酶活，确定最适温度。使用ph分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释酶液，底物也用相应ph的缓冲液配制成0.8％的底物溶液，在40℃条件下测定酶活。将酶液分别置于上述ph的缓冲液中，室温处理30min后，最适条件下测定酶活。实验结果表明，xyn11a的最适催化温度是40℃(图2)，最适ph为5；ph的稳定性较好，在ph3-8之间保持较高的相对活性(图1)。

用ph5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制成浓度为20mm的含有不同金属离子的化合物溶液，将酶液与金属离子等体积混合，使金属离子终浓度为10mm，室温处理1h后，最适条件下测定酶活，以不添加金属离子的酶液作为空白对照。结果表明，xyn11a酶对终浓度为10mm的金属离子及edta常温作用1h的耐受性不一致，na⁺、mg²⁺、zn²⁺等金属离子会抑制酶活性，但相对酶活性在80％以上，而edta和fe³⁺、co²⁺、cu²⁺等金属离子降低酶活性分别为63.7％、73.2％、44.7％和71.3％(表1)。

用ph5的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制成不同浓度的木聚糖底物溶液(1、10/9、1.25、10/7、5/3、2.0、2.5、10/3、5.0、10和20mg/ml)，最适条件下反应10min后测定酶活，利用双倒数作图法确定酶的动力学参数km和vmax值。用木聚糖作为底物测定木聚糖酶的动力学参数，图3结果显示木聚糖酶针对底物木聚糖的km和vmax分别是12.00mg/ml和1111.11u/ml。

表1木聚糖酶xyn11a的金属离子及edta耐受性

实施例5木聚糖酶xyn11a降解木聚糖的研究

用ph5.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制0.8％的木聚糖底物溶液，与适当比例稀释的酶液反应10min后，吸取一部分反应液，加入dns终止反应，沸水中煮5min，在流动的自然水下冷却至室温，用蒸馏水定容，利用酶标仪测定od540计算酶活。另外一部分反应液直接在沸水中煮沸，使酶蛋白失活，反应终止，与10mm的硫酸溶液等体积混合，震荡摇匀，离心吸取上清作为待测液。待测液用0.1μm滤膜过滤后上机(lc-20a，日本)进行液相色谱分析，以5mm的硫酸溶液作为流动相将标准品木二糖、木三糖、木四糖以及木五糖(上海甄淮生物科技有限公司，中国)稀释不同的浓度梯度，作为标准品计算产物寡糖的含量，计算木聚糖的降解率。

由液相色谱图(图4)可以看出，xyn11a降解木聚糖的产物有木三糖、木四糖以及木五糖，根据标准品的液相色谱图，可以计算出木聚糖的降解率为93.5％。

液相色谱参数：色谱柱：00h-0138-k0column300×7.8mm；pda型号：spd-m20a；自动进样器型号：sil-20ac；流动相：5mm硫酸溶液；液体流速：0.6ml/min；泵型号：lc-20at；泵内压力：10.0mpa；进样体积：10μl。

本发明的木聚糖酶最适温度为40℃，在ph2.5-8.0有较高的酶活性；符合动物的生理消化温度和体内消化道ph的变化范围。目前已知的绝大部分木聚糖酶的最适温度为50-60℃，极端耐热的木聚糖酶的最适温度达到75-80℃，均高于体内生理消化温度。另外，本发明的木聚糖酶xyn11a对木聚糖的降解率高，达到90％以上，目前研究报道从烟曲霉菌株中生产的木聚糖酶降解甘蔗渣木聚糖降解率不到50％，因此本发明木聚糖酶xyn11a降解木聚糖的降解率优于已知的木聚糖酶。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>木聚糖酶xyn11a及其编码基因与应用

<130>khp181116823.1

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>651

<212>dna

<213>硫色曲霉(aspergillussulphureus)

<400>1

atgctcgctttctcttctctcctgcttgccgcctccgccgtctccggcgcattcgccgca60

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gactacaatccgtcgaccggggcggagcagatcggcagcgtcaccagcgacggcagcacg420

tacaagatctacaagacgacccgcgagaacgcgccctcgatcgaaggcacttccaccttc480

acgcagttctggtccatccgcgacaacctgcgcaccggcggcaccgtcaccgtgcagaac540

cacttcgacgcctgggccaagtccggtctgcagctgggcgagcacaactaccagatcgtg600

gccaccgagggatatcagagcagcgggtctgcttccatcaccgtccagtaa651

<210>2

<211>216

<212>prt

<213>硫色曲霉(aspergillussulphureus)

<400>2

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151015

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202530

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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<213>硫色曲霉(aspergillussulphureus)

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