一种双孢菇呈味肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于食品学领域，涉及一种调味品，具体来说是一种双孢菇呈味肽及其制备方法和应用。

背景技术：

酸、苦、咸、甜、鲜是现代人们认知的五种基本味觉。而随着人们生活水平的提高，人们对这种单一的味觉感受不再满足。人们渴望体验更为复杂的、圆润平衡的，具有满口感、持久感、浓厚感等一系列令人愉悦的味道，日本科学家ueda将可以引起此类味觉感受的物质称为kokumi，中文常用“浓厚感”来表示。浓厚感呈味物质可以分为肽类和非肽类，而目前以肽类的研究居多，kokumi肽(又称浓厚感肽)属于呈味肽的一种。

呈味肽(又称风味增强肽)是指从食品中提取或者由氨基酸合成的，能够改善或掩盖食品感官特性的短肽。食品中的肽主要来自于蛋白质合成和分解的中间产物，存在于肉类、蔬菜、腌制食品及乳制品等各类食品中，对食品风味起到非常重要的作用。在食品中的肽可以产生特征性滋味，赋予食品特殊的风味。肽还可与食品中其他风味物质相互作用，明显改变原有风味。因此开发风味增强肽的市场前景是十分广阔的。从我国特有的食品体系中筛选出新的呈味肽，进而加快我国风味物质新素材的研发是一个值得进一步深入研究的课题。

双孢菇(agaricusbisporus)中文别称蘑菇、白蘑菇、洋蘑菇，欧洲各国又将其称为纽扣蘑菇或栽培型蘑菇。双孢菇的人工栽培发源于法国市郊至今已有300多年历史，因其营养丰富、味道鲜美很快在欧洲各国推广开来。双孢蘑菇是目前世界上消费量最大、产量最高、人工栽培最为广泛的食用菌之一，因此享有“世界菇”的称号。双孢菇不仅肉质丰厚，脆嫩而且营养均衡丰富，其鲜蘑菇中蛋白质含量高达4％，并含有丰富的维生素和矿物质，脂肪含量低，含有人体必须的8种氨基酸，尤其是赖氨酸含量极为丰富，被认为是牛肉的最佳替代品，因此又有“素中之王”的美称。近年的研究表明，由于双孢菇中含有的肽类、游离氨基酸、5’-核苷酸以及其他化合物的作用，使其具有抗氧化、抑菌、降低胆固醇、抑制血管紧张素转化酶的生物学特性。

目前世界上对双孢菇的生物学特性的研究较为广泛，对双孢菇在不同的生长期、采摘、成熟以及烹饪过程中其挥发性及非挥发性化合物的变化的研究也颇多。但在双孢菇呈味特性的研究方面较少，所以开发双孢菇中浓厚感呈味肽对高品质双孢菇调味品的开发以及双孢菇的精深加工都有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双孢菇呈味肽及其制备方法和应用，以解决现有技术中的调味品功能单一、香味不足的技术问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种双孢菇呈味肽，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

优选地，所述的双孢菇呈味肽来源于双孢菇水溶性提取物。

优选地，所述的双孢菇呈味肽为人工合成。

本发明还提供了上述的双孢菇呈味肽的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：首先通过高压蒸煮法从双孢菇中提取水溶性成分；

步骤2：采用超滤膜和纳滤膜分离法截留分子量在200da和3000da之间的组分；

步骤3：对所得的膜分离组分进行分离纯化后获得氨基酸序列为seqidno.1所示的双孢菇呈味肽。

优选地，所述的步骤1中的高压蒸煮法的步骤包括：将双孢菇洗净切碎，加水，在35-45kpa的压力下蒸煮1-3h，过滤，将滤液离心，收集上清液。

优选地，所述的步骤3中的分离纯化采用凝胶色谱和rp-hplc。

本发明还提供了上述的双孢菇呈味肽在食品中的应用。

本发明还提供了一种食品调味料，其特征在于：含有上述的双孢菇呈味肽。

本发明还提供了一种双孢菇美拉德肽，其特征在于，由上述的双孢菇呈味肽和糖进行美拉德反应得到。

本发明首先通过高压蒸煮从双孢菇中提取水溶性成分，再对该水溶性成分进行膜分离，然后对得到的组分进行进一步分离纯化。本发明的双孢菇呈味肽作为呈味物质的一种，应用于食品领域，例如用作食品调味料的基料或辅料，这些都是呈味物质的常规应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的双孢菇呈味肽的咸、鲜味和浓厚感强，调味效果好。

2、肽不仅本身具有特殊的风味，也是美拉德反应的重要前体物。本发明研究发现，利用本实施例制备的双孢菇呈味肽进行美拉德反应，能获得具有良好的风味增强效果的双孢菇美拉德反应肽。

附图说明

图1为分子量在200-3000da的膜分离组分经过sephadexg-15凝胶色谱分离后的层析图谱。

图2为膜分离组分u2和层析组分f1-f5的滋味稀释分析结果。

图3为五个层析组分在鸡汤中的鲜味、咸味以及浓厚感的味觉强度

图4为层析组分f5的rp-hplc分离谱图。

图5为四个rp-hplc组分的感官评价结果。

图6为组分f5a的飞行时间质谱(tofms)一级质谱图。

图7为组分f5a的飞行时间质谱(tofms)二级质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

在本发明的具体实施方式中，对膜分离组分进行层析后，选择鲜味和浓厚感最强的组分(感官评价)，优选地，采用sephadexg-15凝胶色谱方法进行层析。再优选地，对层析后的鲜味和浓厚感最强的组分进行进一步层析分离，再选择其中鲜味和浓厚感最强的组分(感官评价)进行成分鉴定，优选地，采用rp-hplc方法进行层析。

感官评价采用滋味稀释分析(tda)的方法评定出每个样品的稀释因子即td值，td值越大表明样品的滋味特性越强。td值的测定如下：将待测组分溶解于等比例的饮用水中，按1：1(体积比)将其稀释，采用三角测试法对每个稀释水平进行鉴评，直到某个稀释倍数时尝不到该滋味为止。该稀释倍数即为该溶液的滋味稀释因子(td)，td值越大即该组分滋味越强。

实施例1

提取、分离、纯化和鉴定氨基酸序列为gly-leu-pro-asp的双孢菇呈味肽

步骤(1)：首先通过高压蒸煮法从双孢菇中提取水溶性成分：

原材料：双孢菇采自上海农业科学院庄行双孢菇种植基地。将双孢菇洗净切碎，然后加入1.25倍的去离子水，在40kpa的压力下蒸煮2h。用双层纱布过滤，滤液在8000r的转速下4℃离心15min，收集上清液，即为双孢菇呈味肽水溶性提取液。

步骤(2)：双孢菇呈味肽提取液的分离、纯化

将之前获得的上清液用0.45μm的滤膜预过滤，滤液再依次利用分子量截留范围为3000da的超滤膜和200da的纳滤膜对其进行膜分离，收集分子量在200-3000da的截留组分(本文中用u2表示)，对其进行冷冻干燥，冻干的样品粉末于-20℃条件下储存备用。

将膜分离组分u2(冷冻干燥后的样品粉末)配制成浓度为25mg/ml的溶液，用sephadexg-15凝胶色谱进行进一步的分离(洗脱液为超纯水，流速为0.75ml/min)。层析图谱结果参见图1，横坐标表示洗脱时间，单位分钟，纵坐标表示在检测波长为220nm下的丰度。从图1可以看到5个吸收峰，即层析得到5个分离组分，收集洗脱过程先后获得的5个层析组分(依次用f1、f2、f3、f4和f5表示)。对其进行冷冻干燥，冻干后样品粉末于-20℃条件下储存备用。

步骤(3)：利用感官评价分析膜分离组分u2和层析组分f1-f5的呈味特性。

感官评价的方法采用滋味稀释分析法(tda)确定凝胶分离得到的各个组分和膜分离组分u2的稀释因子，具体做法如下：将各待评价样品配置成25mg/ml的溶液，并采用去离子水以1:1的比例进行逐步稀释，配置成一系列浓度梯度的溶液，从各个梯度溶液中取5ml并以浓度依次降低的顺序呈送给8名经过培训的感官评价员(4男4女，年龄25至30岁)，每个稀释度的溶液采用三角测试进行感官评定。将某个稀释水平溶液和两个去离子水之间的滋味差异刚好被识别出来时的稀释倍数记为滋味强度稀释因子，即td。td为整个感官评价小组成员的平均值，且各小组成员之间的td值不能大于两个稀释水平。每份样品在不同时间内重复三次，均为常温下评定。每位感官评价人员还需对各个样品在水中和鸡汤中的滋味特性进行描述性感官评价。

膜分离组分u2和层析组分f1-f5的滋味稀释分析结果参见图2。图中横坐标表示膜分离组分u2和层析组分f1-f5，纵坐标表示每个组分的滋味强度稀释因子。

从图2结果可以看出，膜分离组分u2和层析组分f5的td值最高，在相同范围内最具有味感。

膜分离组分u2和层析组分f1-f5的人工感官滋味特性评价结果参见下表。

表1感官评价结果

从表1结果可以看出，层析组分f5和膜分离组分u2的滋味描述最为相似，都具有浓厚感和鲜味。

在此基础上，我们采用5分标度法对层析组分f1-f5在鸡汤中的浓厚感、咸味和鲜味的强度进行评价(即0分表示没有某种滋味特性，5分表示某种滋味特性最强)。感官评价时，分别采用1.0g/l、1.5g/l和2.0g/l的谷胱甘肽的鸡汤溶液作为浓厚感的1分、3分和5分强度的参考样品；分别采用0.8g/l、1.6g/l和2.5g/l的氯化钠的鸡汤溶液作为咸味的1分、3分和5分强度的参考样品；分别采用0.40g/l、0.80g/l和1.20g/l的谷氨酸钠的鸡汤溶液作为鲜味的1分、3分和5分强度的参考样品。根据参考样品的强度对层析组分f1-f5在鸡汤中的鲜味、咸味和浓厚感进行打分。

将0.5％的层析组分f1-f5分别加入到空白鸡汤中，进一步探究层析分离组分在鸡汤中的鲜味、咸味和浓厚感的味觉强度，评价结果如图3所示。由图3可知，组分f5在鲜味、咸味和浓厚感方面的强度均最高且和其他四个组分均有显著性差异。

综合图1-图3以及表1的结果，可以认为：f5组分的鲜味和浓厚感最强，因此选择f5层析组分进行下一步的rp-hplc分离纯化。

步骤(4)：采用rp-hplc进一步分离纯化f5层析组分

采用rp-hplc方法对f5层析组分进行进一步的分离纯化。所用色谱柱为spursilc18(5μm，250*4.6mm；dikmatechnologiesinc.)。rp-hplc的分离条件为：等度洗脱，30％甲醇和70％超纯水，流速：0.8ml/min,柱温：25℃，上样量为10μl，检测波长220nm。

层析组分f5的rp-hplc分离谱图参见图4。图4中横坐标表示洗脱时间(min)，纵坐标表示在检测波长220nm下的吸光度。

由图4可以看到有4个吸收峰，收集洗脱过程中先后获得的4个分离组分(依次用f5a、f5b、f5c、f5d表示)。将其分别冷冻干燥后于-20℃条件下储存。

步骤(5)：利用感官评价来测定rp-hplc分离组分的呈味特性。

感官评价由8名经过培训的感官评价员(4男4女，年龄25至30岁)进行。按照前述5分标度法，将rp-hplc组分f5a-f5d分别加入到空白鸡汤中，对rp-hplc组分在鸡汤中的浓厚感、咸味和鲜味的强度进行评价。将rp-hplc分离的4个组分重新溶解于去离子水，分别配成0.5％的溶液，转移到感官评价杯中，品尝温度为23±2℃，评价员被要求啜饮样品，用舌头旋转鉴评后吐出。为了避免疲劳和残留效应，要求小组成员在测试两种不同样品之间用50-60ml可饮用的水漱口。感官评价结果如图5所示。

由图5可以看出，组分f5a的咸、鲜味和浓厚感最强，且与其他三个组分均有显著性差异，因此选择f5a进行多肽序列结构鉴定。

步骤(6)：f5a中多肽序列的结构鉴定

制样：将f5a样品溶于色谱用纯水中，在旋涡混合仪上混合使其充分溶解，然后离心后取上清液装入液相瓶中备用。

uplc-q-tof-ms测定条件如下：

液相条件：采用behc18色谱柱(5cm×2.1mm，1.7μm)；进样量：10μl；流速：0.3ml/min；采用两种洗脱液作为流动相进行梯度洗脱，洗脱液a为0.1％乙腈水溶液，洗脱液b为0.1％甲酸水溶液；柱温45℃；梯度洗脱条件如下：0-2min:100％b；2-3min:90％b；3-10min:0％b。

质谱条件如下：电离模式：esi+，毛细管电压3.2kvolts，锥孔电压20kvolts，离子源温度100℃，脱溶剂气化温度400℃，锥孔流速50l/h，离子能量1volt，碰撞能量6volts和20volts，扫描时间1s，检测电压1700volts质量范围20-3000m/z。

利用uplc-q-tof-ms对组分f5a进行分离鉴定后，通过masslynx软件中的biolynx鉴定f5a的相对分子量。图6为组分f5a飞行时间质谱(tofms)一级质谱图，其中横坐标为分子量(m/z)，纵坐标表示丰度。图6的结果显示f5a的主要离子碎片([m+h]⁺)为401.0。经过验证，最后分析计算出多肽的相对分子量质量为399.99da。

利用组分f5a的飞行时间质谱(tofms)二级质谱图鉴定组分f5a的多肽序列，通过masslynx软件中的biolynx鉴定分析出多肽序列为gly-leu-pro-asp，结果见图7。图7的横坐标为离子碎片的分子量(m/z)，纵坐标为丰度。

综合以上结果，可以得到rp-hplc分离组分f5a中的一种呈味肽，其多肽序列为gly-leu-pro-asp。

步骤(7)，双孢菇美拉德肽的制备

将双孢菇呈味肽溶解配制成20％的肽溶液，按肽糖质量比3∶1的比例加入木糖，混匀后ph调至8，在120℃条件下反应3h，采用冰水冷却终止反应。感官评价结果发现，双孢菇呈味肽进行美拉德反应后在浓厚感、余味上更加丰富。本实施例中从双孢菇中提取的呈味肽具有明显的风味增强效果，可以应用于食品领域，可以作为基料和辅料作为调味品，以鲜代咸，在营养安全的同时又可以满足感官的需要。

sequencelisting

<110>上海应用技术大学

<120>一种双孢菇呈味肽及其制备方法和应用

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