一种酒醅中酵母菌分离培养基及其制备方法与流程

本发明涉及微生物发酵工程
技术领域：
的一种酵母菌分离培养基，尤其涉及一种酒醅中酵母菌分离培养基及其制备方法。
背景技术：
：酵母菌广泛存在于制曲、堆积、窖内、空气、晾堂中，是白酒生产过程中的重要微生物。按功能分为产酒功能菌与产香功能菌，其生长代谢情况对白酒的产量与风味具有重要影响。为研究不同酵母菌在白酒生产中的作用机理，首先需对酵母菌进行全面分离筛选。现有分离酵母菌的培养基包括酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd培养基)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)、wl营养琼脂培养基(wl培养基)、孟加拉红培养基等，其中ypd培养基与wl培养基使用频率较高，分离效果较突出。迄今为止，关于酒醅中酵母菌的分离，尚未有在培养基中添加大曲-酒醅浸提液的报道。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种酵母菌分离培养基。本发明的进一步目的在于提供一种针对性强的酵母菌分离培养基。本发明的进一步目的在于提供一种能够分离不同时期酒醅中酵母菌的培养基。本发明的进一步目的在于提供一种上述培养基中所含大曲-酒醅浸提液的制备方法。本发明的进一步目的在于提供一种上述培养基的制备方法。在培养基中添加大曲-酒醅浸提液，能更好的模拟酿造微生物生长环境，促进酒醅微生物的分离。据报道，在对浓香型酒醅中细菌进行分离时，研究者曾尝试将出窖酒醅与煮沸过的蒸馏水振荡制备成大曲-酒醅浸提液，添加在不同的细菌培养基中，但是分离效果不突出。该大曲-酒醅浸提液未添加生产用大曲，且未进行高温煮沸。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案内容具体如下：一种用于分离酒醅中酵母菌的培养基，所述培养基的配方包括如下组分：酵母膏5-10g/l、蛋白胨10-20g/l、葡萄糖5-20g/l、琼脂15-22g/l、大曲-酒醅浸提液100-800ml/l，余量为水。作为优选的实施方式，所述培养基的配方包括如下组分：酵母膏5-10g/l、蛋白胨10-15g/l、葡萄糖10-20g/l、琼脂18-20g/l、大曲-酒醅浸提液200-700ml/l，余量为水。作为一种更为优选的实施方式，所述所述培养基的配方包括如下组分：酵母膏5-7g/l，蛋白胨10-15g/l，葡萄糖15-20g/l，琼脂18-20g/l，大曲-酒醅浸提液500-700ml/l。本发明中，大曲-酒醅浸提液的添加对于筛选尤为重要，一般用于酵母菌分离的培养基，常为通用型培养基，未添加特殊物质，无法更好的模拟酵母菌原有生长环境，增加分离难度。为了进一步优化培养基成分，在普通酵母菌分离培养基中，添加适量大曲-酒醅浸提液，有利于酒醅中微生物的分离。作为优选实施方式，发明人还根据酒醅发酵特点，有针对性的调节培养基ph，有利于分离不同时期酒醅中的酵母菌。作为一种可选的实施方式，所述培养基的ph为3.0-6.0。本发明中，作为一种可选的实施方式，所述培养基用于分离酒醅样品中的酵母菌。对于酒醅样品选自什么时期和或者哪个批次并无特别限定，如酒醅样品可为堆积酒醅、入窖酒醅，也可以为窖内酒醅。作为优选实施方式，培养基配方中，还含有氯霉素0.1-1.0g/l。通过向酵母菌分离培养基中加入氯霉素，抑制细菌的生长，提高酵母菌分离效果。作为可选的方案，上述大曲-酒醅浸提液的制备方法为:(1)称取酒醅与大曲，混合；(2)向酒醅-大曲混合物中加入纯水煮沸；(3)冷却后过滤得滤液备用。作为优选的实施方式，步骤(2)中，煮沸时间为5-30min。作为更为优选的实施方式，步骤(2)中，煮沸时间为10-15min。在一些实施例中，添加煮沸处理的大曲-酒醅浸提液的培养基，与加入未煮沸处理的大曲-酒醅浸提液的培养基相比，更能够促进酵母菌的生长。作为可选的实施方式，步骤(1)中，大曲与酒醅的质量比为1:1-1:20。作为一种更为优选的实施方式，步骤(1)中，大曲与酒醅的质量比为1:3-1:10。作为一种可选的实施方式，步骤(2)中，所述混合物与水的质量比为1:2-1:20。作为一种优选的实施方式，所述混合物与水的质量比为1:4-1:10。作为优选的实施方式，步骤(3)中，煮沸后采用纱布进行过滤。另一方面，本发明还提供了一种上述酵母菌分离培养基的制备方法，步骤如下：(1)按照配方称取各组分，将酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，琼脂粉，大曲-酒醅浸提液加入容器中，用酸溶液调节ph，余量用水补齐，灭菌；(2)将氯霉素溶于乙醇，摇匀，制备氯霉素母液；(3)将步骤(1)灭菌后的混合物冷却至50-60℃，与步骤(2)的氯霉素母液混匀。作为优选的方案，步骤(1)中，使用的酸溶液为盐酸溶液、冰醋酸溶液或是乳酸溶液。进一步优选的，在步骤(1)中，121℃对培养基进行灭菌15-20min。此外，本发明同时还提供了一种分离酵母菌的方法，其中该方法包括采用平板稀释法将酒醅制成一系列稀释菌液涂布于上述培养基中进行培养，从而达到酵母菌分离的作用。其余的培养条件和方法，则与现有技术中酵母菌的培养条件或方法相同。还有一方面，本发明提供了上述培养基在分离酒醅中的酵母菌的应用。本发明的有益效果：(1)本发明首次在酵母菌的分离培养基中添加大曲-酒醅浸提液，该培养基能更好的模拟酿造微生物生长环境，促进酒醅微生物的分离。发明人在实验过程中，曾尝试将酒醅与煮沸过的蒸馏水振荡制备成大曲-酒醅浸提液，用于分离酵母菌，但分离效果不突出。此外，发明人还尝试将未经高温煮沸的大曲-酒醅浸出液用于酵母菌的分离，分离效果也不突出，因此，在本发明中，高温煮沸以及大曲和酒赔共同的大曲-酒醅浸提液是必须的。(2)本发明的培养基相对于常规的酵母菌分离培养基，解决了酒醅酵母菌分离效果不好的问题，更好地模拟了酵母菌生长环境，更有利于酒醅样品中酵母菌的系统分离，其对酵母菌分离的针对性强，且对于酿酒过程不同阶段的酒醅均适用，具有筛选范围广的优点。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。附图说明图1为培养基中大曲-酒醅浸提液含量不同对酵母菌的生长分离的影响。图2为培养基ph不同对堆积酒醅样品中酵母菌生长分离的影响。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。本发明所使用的术语“不同时期的酒醅”指的是整个酿酒过程中任意阶段的酒醅样品。本发明中“ph自然”指的是培养基ph未调节。本发明中“ph已调”指的是培养基ph添加酸溶液进行调节。本发明中“堆积酒醅”为晾堂上进行堆积发酵的酒醅样品。其中“入窖酒醅”指堆积发酵结束准备转入窖池内的酒醅样品。“窖内酒醅”为窖池内进行厌氧发酵的酒醅样品。其中“出窖酒醅”指窖内发酵结束准备开窖进行蒸煮的酒醅样品。本发明实施例中的大曲-酒醅浸提液中使用的大曲是白酒生产的发酵剂，也是糖化剂，还能为白酒提供一定的风味物质，包括低温大曲、中温大曲、高温大曲。使用的大曲来源于白酒生产过程中使用的由小麦发酵而成的大曲，具体为酱香型白酒生产过程中使用的高温大曲。本发明发明中大曲-酒醅浸提液中使用的酒醅是白酒生产过程中蒸煮过后发酵好的粮食，是酿酒过程的重要载体，也能为白酒提供一定的风味物质，包括高粱、玉米、小麦、稻米、糯米、稻壳、麸皮。实施例中大曲-酒醅浸提液中使用的酒醅选自酱香型白酒生产过程中经蒸煮后的高粱发酵而成的不同轮次的窖内发酵酒醅，具体为第三轮次窖内发酵酒醅。实施例1酵母菌分离培养基配方及其制备方法表1培养基的组分及含量组分培养基1培养基2培养基3培养基4培养基5酵母膏5g5g5g7g7g蛋白胨10g10g10g10g15g葡萄糖10g10g15g20g20g琼脂18g18g20g20g20g浸提液100ml150ml200ml200ml200ml注：培养基ph自然。1、浸提液制备方法为：(1)将大曲与酒醅按照1:5的比例，称取并混合；(2)将大曲-酒醅混合物与水按照质量比1:7的比例，加纯水煮沸10-15min；(3)冷却后，采用纱布过滤，得滤液备用。2、酵母菌分离培养基制备方法：(1)按表1配方称取各组分，将酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，琼脂粉和浸提液加入容器中，用水补齐至1l，混匀，121℃灭菌15-20min；(2)将氯霉素溶于100％乙醇，摇匀，制备浓度为60g/l的氯霉素母液；(3)将步骤(1)灭菌后的混合物冷却至50-60℃，加入步骤(2)的氯霉素母液混匀，使培养基中氯霉素浓度稀释到0.2g/l。为了评价本发明培养基中不同配方对酵母菌生长的影响，本发明采用平板稀释法将入窖酒醅制成一系列稀释菌液，并分别涂布于表1所示培养基上进行培养，每组的稀释梯度均有三个，为10-4、10-5、10-6(稀释倍数)。培养48h后，5组培养基均挑选稀释梯度为10-5的平板进行对比，酵母菌生长情况如表2所示。表2本发明培养基配方对酒醅中酵母菌生长的影响酵母菌生长情况培养基1培养基2培养基3培养基4培养基5酵母菌数量(cfu/g)89×10599×105103×105115×105110×105有无杂菌少许无无无无注：此时酒醅为入窖酒醅样品。实验结果：酒醅中酵母菌在上述5种培养基上都有生长，数量略有不同，其中培养基1和培养基2的数量较低，培养基3、4、5上面的酵母菌数量较高，整体上无显著差异，说明在上述配方范围内的培养基均能用于酒醅中酵母菌的分离。实施例2浸提液的添加对酒醅中酵母菌分离的影响为了评价本发明培养基中浸提液的添加对酵母菌生长的影响，本发明采用平板稀释法将酒醅制成一系列稀释菌液，并分别涂布于表3所示培养基上进行培养，每组的稀释梯度均有三个，为10-3、10-4、10-5(稀释倍数)。表3培养基的组分及含量组分培养基6培养基7培养基8对比组酵母膏5.0g5.0g5.0g5.0g蛋白胨10.0g10.0g10.0g10.0g葡萄糖10.0g10.0g10.0g10.0g琼脂20.0g20.0g20.0g20.0g浸提液700ml500ml200ml0培养48h后，挑选稀释梯度为10-4的平板进行对比，酵母菌生长情况如图1、表4、表5所示。表4浸提液含量对酒醅a中酵母菌生长的影响酵母菌生长情况培养基6培养基7培养基8对比组酵母菌数量(cfu/g)48×104129×10442×1049×104有无杂菌少许无无无注：酒醅a为堆积酒醅样品。表5本发明培养基对酒醅b中酵母菌生长的影响注：酒醅b为窖内酒醅样品。上述四种培养基ph自然，氯霉素含量均为0.2g/l。浸提液的制备方法、物质及其含量，与实施例1相同。酵母菌分离培养基除了表3中的成分及其含量，其他的成分及其含量、以及培养基制备方法，与实施例1相同。实验结果：酒醅a与酒醅b中酵母菌在上述4种培养基上均有生长，但数量不同，其中添加浸提液的培养基中酵母菌数量均高于对照组，说明浸提液中的某些营养物质有利于酒醅中酵母菌的生长与分离。且酒醅a和酒醅b中的酵母菌在培养基7上的生长情况最好，此时可以显著促进酵母菌的生长与分离。但是，当浸提液添加量大于700ml后，培养基不易凝固，且颜色较深，因此，当浸提液含量在200至700ml以内，更有利于酵母菌的生长与分离。实施例3培养基ph对堆积酒醅样品中酵母菌分离的影响为了评价本发明培养基ph的不同对酵母菌分离的影响，本发明采用平板稀释法将堆积酒醅制成一系列稀释菌液，并分别涂布于表6所示培养基上进行培养，两组培养基接种的菌液稀释梯度均有3个，为10-4、10-5、10-6。培养基除ph不同以外，其余组分和含量及制备方法同实施例2中的培养基8相同。注：其中“ph自然”指的是培养基ph未添加酸溶液进行调节。“ph已调”指的是培养基ph添加酸溶液(浓度为1mol/l的盐酸溶液)进行调节，使培养基ph调节至5.0。堆积发酵过程，网罗和富集大量场地、空气、大曲中的微生物，堆积前期，酒醅菌群结构较复杂，堆积后期，由于经过一定时间的驯化，菌群结构逐步趋于稳定。培养48h后，挑选稀释梯度为10-4的平板进行对比，酵母菌生长情况如图2与表6所示。表6培养基ph对堆积酒醅c中酵母菌生长的影响酵母菌生长情况ph自然ph已调酵母菌数量(cfu/g)21×10427×104有无杂菌有无实验结果表明，堆积酒醅c中酵母菌在两种培养基上均有生长，但不调节ph的培养基上还有大量霉菌生长，且酵母菌的数量略低；而ph调节至5.0后的培养基上无霉菌生长，且酵母菌生长数量多。因此，能够有效分离堆积酒醅样品中酵母菌，培养基ph也需要满足一定条件。实施例4培养基中大曲与酒醅的不同配比对酵母菌分离的影响为了测试大曲与酒醅的不同配比对酵母菌分离的影响，本发明采用平板稀释法将酒醅制成一系列稀释菌液，并分别涂布于表7所示培养基上进行培养，4组培养基接种的菌液稀释梯度均有3个，为10-2、10-3、10-4。各组培养基除了大曲与酒醅配比不同，其余组分和含量及制备方法与实施例2中培养基8相同。培养48h后，各组培养基挑选稀释梯度为10-2的平板进行对比，酵母菌生长情况如表7所示。表7大曲与酒醅的不同配比对窖内酒醅样品酵母菌生长的影响实验结果：酒醅中酵母菌在上述培养基中均有生长，但当浸提液中大曲与酒醅质量比为1:25时，酵母菌数量最少。且当大曲：酒醅的比例大于1:1以后，大曲与酒醅混合物容易煮糊，配制的培养基形成灰褐色，不利于培养基中培养菌落的观察。因此，浸提液中大曲与酒醅质量比在1:1至1:20的范围以内，更有利于酒醅中酵母菌的生长与分离。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页12