人参病程相关基因及其检测引物、试剂盒及应用与检测方法与流程

本发明涉及中草药病虫害防治领域，具体而言，涉及人参病程相关基因及其检测引物、试剂盒及应用与检测方法。

背景技术：

人参黑斑病(英文名alternariapanaxwhetz)属半知菌亚门，链格孢属真菌，分布在东北地区，病菌以菌丝体和分生孢子在地上部病残体上、土壤中及种子表面越冬，成为翌年发病的初侵染源。

主要为害叶片，也可为害茎、花梗、果实等部位。致叶片上病斑近圆形或不规则形，黄褐色至黑褐色，稍有轮纹，病斑时常导致早期枯落。茎上病斑椭圆形，黄褐色，向上、下扩展，中间凹陷变黑，上生黑色霉层，使茎秆倒伏。果实受害时，表面产生褐色斑点，逐渐干瘪成“吊干籽“。潮湿时病斑上生出的黑色霉层，为病原菌的分生孢子梗和分季孢子。该病发生普遍，是人参最严重的病害之一。

目前对人参病程相关的基因的研究还较少，而且外源施用硅能有效缓解黑斑病的发生，因此外源硅通过什么基因起作用目前还不知道。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供人参病程相关基因，通过该基因可以获得人参抗病和胁迫相关的结果。

本发明的第二目的在于提供检测上述的人参病程相关基因的检测引物，该引物能检测到与人参病程相关的基因。

本发明的第三目的在于提供上述的人参病程相关基因的检测引物在人参病程相关基因检测中的应用。

本发明的第四目的在于提供上述的人参病程相关基因的检测引物在制备人参病程相关基因的检测试剂盒中的应用。

本发明的第五目的在于提供人参病程相关基因的检测试剂盒，检测试剂盒方便对人参病程相关基因进行检测。

本发明的第六目的在于提供人参病程相关基因的检测方法。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

人参病程相关基因，人参病程相关基因的碱基序列如seqidno.1所示。

人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。

上述的人参病程相关基因的检测引物在人参病程相关基因检测中的应用。

上述的人参病程相关基因的检测引物在制备人参病程相关基因的检测试剂盒中的应用。

人参病程相关基因的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的人参病程相关基因的检测引物。

人参病程相关基因的检测方法，检测方法包括以下步骤：

用rna提取试剂提取人参叶片样本的总rna；

然后以总rna和反转录试剂进行反转录合成cdna；

以cdna、荧光定量pcr反应试剂和人参病程相关基因的检测引物进行荧光定量pcr反应，以人参actin作为内参基因，分析人参病程相关基因的表达量。

与现有技术相比较，本发明的有益效果包括：本发明提供的人参病程相关基因的检测引物，方便对人参病程相关基因进行检测，对人参病虫害防治具有积极的效果，帮助人参病虫害防治提较好的指导和帮助，将检测引物应用于制备试剂盒，方便对相关基因的检测，具有较高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例提供的不同样本的人参病程相关基因的表达量qpcr检测图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的人参病程相关基因及其检测引物、试剂盒及应用与检测方法进行具体说明。

通过土培实验发现外源施硅能有效缓解人参黑斑病的发病进程，对植物进行转录组试验，得到六个病程相关蛋白，在接种黑斑病时显著升高(p<0.05)；将得到的转录组数据进行过滤得到cleandata，与指定的参考基因组进行序列比对，得到的mappeddata，进行插入片段长度检验、随机性检验等文库质量评估；进行可变剪接分析、新基因发掘和基因结构优化等结构水平分析；根据基因在不同样品或不同样品组中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因功能注释和功能富集等表达水平分析；筛选得到与人参黑斑病相关的基因数据。

人参病程相关基因，人参病程相关基因的碱基序列如seqidno.1所示。

人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.2-3所示。

本发明中针对人参病程相关基因设计特异性较强的引物对，通过该检测引物能特异性的检测样本中的人参病程相关基因。

检测引物的上游引物如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。

产物长度120bp。

上述的人参病程相关基因的检测引物在人参病程相关基因检测中的应用。

上述的人参病程相关基因的检测引物在制备人参病程相关基因的检测试剂盒中的应用。

人参病程相关基因的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的人参病程相关基因的检测引物。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，至少还包括rna提取试剂、反转录试剂和荧光定量pcr反应试剂中的一种。

通过试剂盒提供的rna提取试剂提取人参样本中的总rna，利用反转录试剂进行反转录，并用荧光定量pcr反应试剂进行pcr反应，就通过相关基因的表达情况就能检测人参的发病情况。

在试剂盒中，包括集成检测引物及相关配套的化学试剂，方便对基因进行检测；同时，通过试剂盒提供相应的检测试剂，能提高检测的稳定性、可靠性和精确度。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，rna提取试剂为trizol、氯仿、异丙醇和75％的乙醇中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，反转录试剂为oligo(dt)18primer、反转录缓冲液、rnaseinhibitor、dntp以及反转录酶中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，荧光定量pcr反应试剂包括transstarttopgreenqpcrsupermix。

人参病程相关基因的检测方法，检测方法包括以下步骤：

用rna提取试剂提取人参叶片样本的总rna；

然后以总rna和反转录试剂进行反转录合成cdna；

以cdna、荧光定量pcr反应试剂和人参病程相关基因的检测引物进行荧光定量pcr反应，以人参actin作为内参基因，分析人参病程相关基因的表达量，荧光定量pcr反应的条件为：93-95℃预变性2min；93-95℃变性5s；58-61℃退火15s；72℃延伸10s；45个循环。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供人参病程相关基因，人参病程相关基因的碱基序列如seqidno.1所示。

人参病程相关基因的碱基序列如下所示：

gaccaatagttgcgctgccgggcagcagtgcgggcattatacgcagattgtgtggagaacaacgcgacgagttgggtgtgctcgggttgtttgtgacagtggcgacgtgttcatgacttg

本实施例还提供人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.2-3所示。

检测引物的上游引物如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。

上述检测人参病程相关基因的检测引物针对人参病程相关基因，针对性强，因此具备较好的特异性，通过检测引物，使得检测结果更为可靠和准确，因此可以应用到人参病程相关基因检测中。

同时，还可以将人参病程相关基因的检测引物应用到制备人参病程相关基因的检测试剂盒中。

实施例2

本实施例提供人参病程相关基因的检测试剂盒，检测试剂盒包括人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。

检测引物的上游引物如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。

实施例3

本实施例提供人参病程相关基因的检测试剂盒，检测试剂盒包括人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。

检测引物的上游引物如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。

人参病程相关基因的检测试剂盒至少还包括rna提取试剂、反转录试剂和荧光定量pcr反应试剂中的一种。

rna提取试剂为trizol、氯仿、异丙醇和75％的乙醇中的至少一种。

反转录试剂为oligo(dt)18primer、反转录缓冲液、rnaseinhibitor、dntp以及反转录酶中的至少一种。

荧光定量pcr反应试剂包括transstarttopgreenqpcrsupermix。

实施例4

本实施例使用本发明提供的人参病程相关基因的检测引物对人参病程相关基因的检测方法。

感染人参黑斑病的人参叶片总rna的提取，本实验例中采用trizol提取总rna，实验所用试剂和耗材均为rnase-free，具体步骤如下：

1.1取100mg人参叶片组织，液氮研磨成粉转移至离心管中；

1.2加入1mltrizol立即涡旋混匀，室温放置5-10min；

1.3在4℃，13,000g离心15min，取900μl上清至新的离心管中，加入500μl氯仿涡旋混匀；

1.4在4℃，13,000g离心15min，取500μl上清至新的离心管中，加入500μl异丙醇震荡混匀；

1.5在4℃，13000g离心15min,弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2-3次，弃乙醇，室温晾干5min；

1.6加入适量的rnase-free水溶解沉淀；

1.7取2μlrna样品稀释10倍，用nanovue超微量分光光度计测定rna的浓度及纯度，同时进行琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量及完整性室温放置10min；

1.8如检测发现rna样品中有dna污染，需要使用dnasei(rnase-free)处理样品并重复之前的抽提检测步骤；总rna样品无问题后，-80℃保存备用或直接进行下一步的反转录实验。

利用前述提取的总rna记进行反转录合成得到cdna，使用transscriptiiall-in-onefirst-strandcdnasynthesissupermixforqpcr(one-stepgdnaremoval)(货号：ah341),具体实验如下：

反应体系如下：

反转录条件：

55℃30min；

85℃5s。

反应结束后加入80μlrnase-freewater稀释得到cdna。

用人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。

检测引物的上游引物(forwardprimer)如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物(reverseprimer)如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。进行人参病程相关基因的表达量的测定，并用人参actin基因作为内参基因。

qpcr的反应体系为：

反应条件为：93℃预变性2min；93℃变性5s；58℃退火15s；72℃延伸10s；45个循环。

实施例5

本实施例使用本发明提供的人参病程相关基因的检测引物对人参病程相关基因的表达量进行检测。

感染人参黑斑病的人参叶片总rna的提取，本实验例中采用trizol提取总rna，实验所用试剂和耗材均为rnase-free，具体步骤如下：

1.1取100mg人参叶片组织，液氮研磨成粉转移至离心管中；

1.2加入1mltrizol立即涡旋混匀,室温放置5-10min；

1.3在4℃，13,000g离心15min，取900μl上清至新的离心管中,加入500μl氯仿涡旋混匀；

1.4在4℃，13,000g离心15min，取500μl上清至新的离心管中，加入500μl异丙醇震荡混匀；

1.5在4℃，13,000g离心15min,弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2-3次，弃乙醇，室温晾干5min；

1.6加入适量的rnase-free水溶解沉淀；

1.7取2μlrna样品稀释10倍，用nanovue超微量分光光度计测定rna的浓度及纯度，同时进行琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量及完整性室温放置10min；

1.8如检测发现rna样品中有dna污染，需要使用dnasei(rnase-free)处理样品并重复之前的抽提检测步骤；总rna样品无问题后，-80℃保存备用或直接进行下一步的反转录实验。

利用前述提取的总rna记进行反转录合成得到cdna，使用transscriptiiall-in-onefirst-strandcdnasynthesissupermixforqpcr(one-stepgdnaremoval)(货号：ah341),具体实验如下：

反应体系如下：

反转录条件：

55℃30min；

85℃5s。

反应结束后加入80μlrnase-freewater稀释得到cdna。

用人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。

检测引物的上游引物(forwardprimer)如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物(reverseprimer)如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。进行人参病程相关基因的表达量的测定，并用人参actin基因作为内参基因。

qpcr的反应体系为：

反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；61℃退火15s；72℃延伸10s；45个循环。

实施例6

本实施例使用本发明提供的人参病程相关基因的检测引物对人参病程相关基因的表达量进行检测。

感染人参黑斑病的人参叶片总rna的提取，本实验例中采用trizol提取总rna，实验所用试剂和耗材均为rnase-free，具体步骤如下：

1.1取100mg人参叶片组织，液氮研磨成粉转移至离心管中；

1.2加入1mltrizol立即涡旋混匀，室温放置5-10min；

1.3在4℃，13,000g离心15min，取900μl上清至新的离心管中,加入500μl氯仿涡旋混匀；

1.4在4℃，13,000g离心15min，取500μl上清至新的离心管中，加入500μl异丙醇震荡混匀；

1.5在4℃，13,000g离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2-3次，弃乙醇，室温晾干5min；

1.6加入适量的rnase-free水溶解沉淀；

1.7取2μlrna样品稀释10倍，用nanovue超微量分光光度计测定rna的浓度及纯度，同时进行琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量及完整性室温放置10min；

1.8如检测发现rna样品中有dna污染，需要使用dnasei(rnase-free)处理样品并重复之前的抽提检测步骤；总rna样品无问题后，-80℃保存备用或直接进行下一步的反转录实验。

利用前述提取的总rna记进行反转录合成得到cdna，使用transscriptiiall-in-onefirst-strandcdnasynthesissupermixforqpcr(one-stepgdnaremoval)(货号：ah341),具体实验如下：

反应体系如下：

反转录条件：

55℃30min；

85℃5s。

反应结束后加入80μlrnase-freewater稀释得到cdna。

用人参病程相关基因的检测引物，检测引物的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。

检测引物的上游引物(forwardprimer)如：

seqidno.2为112777:5’-gaccaatagttgcgctgccg-3’；

下游引物(reverseprimer)如：

seqidno.3为112777r:5’-caagtcatgaacacgtcgcc-3’。进行人参病程相关基因的表达量的测定，并用人参actin基因作为内参基因。

qpcr的反应体系为：

反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性5s；60℃退火15s；72℃延伸10s；45个循环。

实验例

本实验例通过实施例6提供的检测方法对选择的4个样品进行人参病程相关基因(代号：112777)表达量进行检测。本实验例的定量结果如图1所示。

如图1所示，可以看出，4个不同的样本中人参病程相关基因(代号：112777)表达量存在较大差异。

综上所述，本发明实施例提供的人参病程相关基因的检测引物，以及利用该检测引物制备的检测试剂盒，具有较好的特异性和较高的灵敏度，检测结果准确可靠，可以在人参种植和病虫害防治中。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

sequencelisting

<110>中国农业科学院特产研究所

<120>人参病程相关基因及其检测引物、试剂盒及应用与检测方法

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>alternariapanax

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aacgcgacgagttgggtgtgctcgggttgtttgtgacagtggcgacgtgttcatgacttg120

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gaccaatagttgcgctgccg20

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<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

caagtcatgaacacgtcgcc20