一种促进禽流感和/或新城疫疫苗的免疫反应的法氏囊活性六肽及应用的制作方法

本发明属于兽医生物制品
技术领域：
，具体涉及一种具有促进疫苗禽流感和/或与新城疫二联疫苗的免疫反应的法氏囊活性六肽及其应用。
背景技术：
：禽流感(avianinfluenza,ai)是由禽流感病毒(avianinfluenzavirus,aiv)引发的一种感染或疾病综合征，家禽感染aiv后，有的不表现出临床症状，有的表现为产蛋下降和呼吸道疾病，甚至导致全身性疾病，死亡率可达100％。因此，根据致病性高低将禽流感分为低致病性禽流感(lowpathogenicavianinfluenza,lpai)和高致病性禽流感(highlypathogenicavianinfluenza,hpai)。h9n2亚型禽流感病毒作为全世界流行最广泛的低致病性禽流感病毒之一，其对家禽生产和人类健康的影响日趋严重，逐渐成为流感病毒监测的焦点之一。在家禽中，不同亚型禽流感病毒在不同地区、不同年代具有不同的流行性，对家禽造成不同程度的危害，以h3、h4、h6、h5、h7、h9等亚型多见。近年来，由于h5、h7等亚型禽流感病毒感染人并导致死亡的事件层出不穷，严重危害人类的健康和社会秩序，禽流感已成为各国动物疫病防控的焦点。令人关注的是2013年中国暴发的h7n9禽流感，其能感染人并导致人类死亡。通过对其各个片段的基因分析发现，发现其内部基因与h9n2高度同源，也证实了该病毒已经发生了重组。这些大量报道禽流感病毒跨越种间障碍直接传播给了人类的事件，已经越来越多的引起了社会的关注，而其对应的公共卫生意义也日益突显。在我国，独特的地理环境及养殖模式为此病的发生、传播提供了有利条件。而免疫压力及活禽市场的存在又为h9n2亚型禽流感病毒的重组和变异提供了必要条件。疫苗免疫不仅是当前畜禽传染病防制的主要措施，而且也是我国动物疫病防控规划的重要举措。临床上使用的大多数疫苗配合佐剂才能发挥良好的功效。因此，安全、无残留、有效的新型免疫增强剂研究及技术创新已成为养禽业发展防控规划的重要举措。禽流感病毒广谱疫苗的概念是对所有禽流感病毒亚型产生保护效力的疫苗。考虑到禽流感病毒的流行病学和遗传多样性，目前使用的疫苗普遍只能对特定的禽流感毒株具有保护效力，一旦有新的禽流感病毒毒株或亚型出现，原有疫苗将会失去其保护效力。因此，开发出一种具有诱导广泛交叉反应免疫应答的广谱禽流感疫苗具有特别的意义。疫苗免疫不仅是当前畜禽传染病防制的主要措施。临床上使用的大多数疫苗配合佐剂才能发挥良好的功效。因而，提供一种价格低、安全、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。免疫接种是我国防控禽流感和新城疫的主要手段。然而，使用单苗免疫会消耗大量人力物力，免疫次数的增加的同时会加强鸡群的应激反应。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种价格低、安全、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。本发明所述的法氏囊多肽可用于h9n2亚型禽流感病毒、新城疫经典毒株(lasota)的二联灭活疫苗，h9n2亚型禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗等，并对它们的免疫保护效果进行初探，以期为后续的灭活疫苗研制提供依据。本发明所述的目的通过以下方案实现：一种法氏囊多肽bp6，其氨基酸序列如seqidno.1所示，为：5’-lysglyasnargvaltyr-3’。本发明所述法氏囊多肽bp6在制备免疫药物中的应用，优选的在制备畜禽免疫药物中的应用，特别优选的，在制备预防禽流感和/或新城疫的疫苗佐剂中的应用。一种预防禽流感的免疫组合物，包含禽流感疫苗和/或新城疫的疫苗，及本发明所述的法氏囊多肽bp6。本发明所述法氏囊多肽bp6优选以2～255μg/ml计量存在于免疫组合物中，更优选10～250μg/ml，进一步优选10～50μg/ml。在一种具体的实施方式中，本发明所述的法氏囊多肽bp6可以以以下计量存在于免疫组合物中：10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml。本发明通过超滤浓缩技术，回收分子量小于1kda的有效成分(即粗提物)。经真空干燥浓缩，然后采用反向高效液相色谱(rp-hplc)进行分离、纯化，获得洗脱时间11.258分钟(峰值高)的法氏囊活性成分。经modil-tof质谱分析，测定该法氏囊活性肽的分子量为735.35(m/z)，并获得完整的氨基酸序列，kgnrvy(即5’-lysglyasnargvaltyr-3’，序列1)，并命名为法氏囊六肽(bp6)。本发明还提供一种更为具体的法氏囊多肽bp6的制备：以50g健康鸡法氏囊组织为原料，剪去脂肪组织后，冷冻、超声破碎、高速离心、液体上清分子筛分离等技术，获得小分子量(＜1kda)的法氏囊粗提物。经真空冷冻干燥，用超纯水稀释法氏囊粗提物样品进行反向高效液相色谱(rp-hplc)分离纯化，收获洗脱峰值比较高的滞留峰组分。本发明中样品的滞留时间为11.258分钟。利用蛋白质氨基酸质谱分析系统(maldi-tof-ms)分析该样品的氨基酸序列，测定该法氏囊活性肽的分子量为735.35(m/z)，并采用ms/ms二次分析，获得该法氏囊多肽的完整氨基酸序列，即kgnrvy。通过人工合成bp6，纯度为99.936％，接着进行免疫实验验证其免疫调节功能及应用。本发明所述的法氏囊多肽bp6促进禽流感和新城疫二联疫苗的免疫实验证明：将法氏囊多肽bp6按照10、50和250μg/ml三种剂量添加至禽流感和新城疫二联疫苗中进行联合接种小鼠；免疫后的小鼠的aiv抗体水平、ndv抗体亚型高于疫苗组，且t细胞亚型和淋巴细胞增殖活力发生了变化，而且树突状细胞表面分子表达水平高于疫苗组。在小鼠免疫中，添加10μg/ml剂量bp6的实验组aiv疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组，而添加50μg/ml剂量bp6的实验组ndv疫苗的抗体水平显著高于未加该组分的疫苗对照组。本发明的积极意义：本发明从鸡免疫器官法氏囊中分离、鉴定出一个新的免疫活性肽bp6，结构简单，由六个氨基酸组成，免疫原性极弱，可作为畜禽疫苗免疫增强剂，如促进aiv灭活疫苗、新城疫灭活疫苗的免疫活性，在小鼠免疫实验中，不仅促进小鼠产生针对aiv抗原的抗体反应，而且促进小鼠产生针对ndv抗原的抗体反应，此外，还促进细胞免疫反应、淋巴细胞活力增强、抗原递呈反应和提高疫苗免疫效力作用，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。本发明所述的活性肽是一种来源于法氏囊的小分子多肽，安全、副作用小、无残留、具有促进广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激抗体生成、调节细胞免疫反应和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：5’-kgnrvy-3’。附图说明图1法氏囊六肽的分离和纯化。反向高效液相色谱图中，箭头所指，bp6的洗脱峰11.258min。图2：多肽bp6的maldi-tof-ms/ms分析。图3：免疫后4周，小鼠aivelisa特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图4：免疫后4周，小鼠aivhi抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图5：免疫后4周，小鼠ndvelisa特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图6：免疫后4周，小鼠ndvhi特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图7：二免后1周，小鼠t细胞亚型，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图8：二免后1周，小鼠脾脏淋巴细胞活性，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图9：二免后1周，小鼠树突状细胞cd40+cd11c+，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。图10：二免后1周，小鼠树突状细胞mhcii+cd11c+，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。具体实施方式本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。实施例11.bp6的分离及鉴定用0.85％的生理盐水(预冷至4-10℃)洗涤无筋膜和脂肪组织的50gaa肉鸡法氏囊组织一次。沥干后，将法氏囊组织置于组织捣碎机中，再加入预冷的生理盐水，高速匀浆三次，每次三十秒，匀浆过程保持在0-10℃。然后将匀浆液在4℃条件下超声裂解处理2次，5min/次。然后将裂解液加热至80℃，保温5min，之后迅速置于冰上，冷却至10℃。然后将裂解液冷冻离心30分钟(4000×g/min)。收集上清液，反复冻融两次。然后将上清液高速离心，条件为12000g/min，4℃，30min。收集上清液进行超滤操作，收集1000da以下分子量的超滤液，即法氏囊组织粗提物。冻干后，超纯水稀释，然后0.22um滤膜过滤，经反向高效液相纯化分析，收获洗脱峰值时间为11.258min的活性峰(见图1)，经maldi-tof-ms/ms分析，分子量为735.35，氨基酸序列kgnrvy(见图2)。实施例21.人工合成bp6委托商业化多肽合成公司按照kgnrvy序列(seqidno.1)合成多肽，纯度为99.936％。2.疫苗禽流感和新城疫二联灭活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司)。3.实验动物小鼠分组将balb/c小鼠随机分为五组，每组10只：(i)pbs对照组(每只免疫0.2mlpbs)；(ii)aiv+ndv二联灭活疫苗免疫组(每只免疫灭活疫苗0.2ml)；(iii～v)aiv+ndv二联灭活疫苗+bp6组(bp6浓度分别为10、50、250μg/ml)；采用腹腔注射的方式对相应组小鼠分别进行两次免疫。免疫间隔两周，0.2ml/每只/每次(表1)。表1bp6与aiv+ndv二联灭活疫苗混合免疫程序0周(第一次免疫)2周(第二次免疫)1pbspbs2二联疫苗二联疫苗3bp6(10μg/ml)+二联疫苗bp6(10μg/ml)+二联疫苗4bp6(50μg/ml)+二联疫苗bp6(50μg/ml)+二联疫苗5bp6(250μg/ml)+二联疫苗bp6(250μg/ml)+二联疫苗4.免疫小鼠抗体检测小鼠二免后两周，眼眶采血，8000×g离心10min分离血清，分别采用elisa技术和血凝抑制实验检测禽流感病毒特异的抗体igg和hi抗体水平，以及新城疫病毒特异的抗体igg和hi抗体水平，所有检测结果进行统计分析。5.免疫小鼠细胞亚型检测并于第二次免疫后1周，无菌采免疫小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞，采用流式细胞术检测细胞t细胞亚型、淋巴细胞活性、树突状细胞亚型等的情况，所有检测结果进行统计分析。6.结果(1)免疫小鼠的禽流感igg抗体和hi水平检测结果采用间接elisa方法测定了小鼠免疫后4周的血清中针对aiv抗原的抗体水平，结果见图3。实验显示，第4周，bp6联合免疫组与只免疫疫苗组小鼠相比，10μg/mlbp6联合免疫组抗体水平显著高于疫苗对照组，50和250μg/mlbp6联合免疫的抗体水平也高于aiv疫苗对照，但低于10μg/mlbp6联合免疫组(图3)。与此同时，用血凝抑制方法对各组小鼠血清中aiv特异的抗体亚型检测检测。结果表明，与疫苗组相比，10μg/mlbp6联合免疫组的aiv的hi抗体水平明显高于疫苗对照组，而50和250μg/mlbp6联合免疫的aiv的hi抗体水平与疫苗组类似(图4)。(2)免疫小鼠的新城疫igg抗体和hi水平检测结果免疫后4周采血分离血清，采用间接elisa方法和血凝抑制方法检测免疫小鼠体内的igg抗体和hi抗体水平。结果表明，与疫苗组相比，50和250μg/mlbp6联合免疫组的igg抗体水平明显高于疫苗组，且250μg/mlbp6联合免疫组新城疫的igg抗体水平最高(图5)。而且，与疫苗组相比，50μg/mlbp6联合免疫组明显提高hi抗体水平(图6)；这说明bp6促进禽流感和新城疫二联灭活疫苗免疫的抗体水平。(3)免疫小鼠的t细胞亚型第二次免疫后一周，分离脾脏淋巴细胞，采用三色流式细胞术分析t细胞亚型，结果如图7所示。与疫苗组相比，bp6联合免疫组的cd3+cd4+t细胞和cd3+cd8+t细胞比例均明显升高。不过，随着bp9剂量的增加，cd3+cd4+t细胞和cd3+cd8+t细胞比例反而降低。在所有实验组中，10μg/mlbp6联合免疫组的cd3+cd4+t细胞和cd3+cd8+t细胞比例最高。(4)免疫小鼠的淋巴细胞增殖结果采用了mtt比色法检测了bp6联合免疫对淋巴细胞增殖的影响情况，结果见图8。实验结果表明，与疫苗组相比较，bp6联合疫苗组的淋巴细胞增殖能力显著增强。可以看出，与疫苗组相比，lps刺激后，三种bp9剂量联合免疫组的淋巴细胞活力均明显升高，而pha刺激后，50和250μg/mlbp6联合免疫组的淋巴细胞活性明显升高。lps是常用的b细胞促分裂因子即多克隆活化因子，pha是常用的刺激淋巴细胞增殖的分子。因此，可以推测，bp6能够促进淋巴细胞的增殖，且促进b淋巴细胞增殖。(5)免疫小鼠的cd11c+亚型细胞结果第二次免疫三周，分离脾脏淋巴细胞，采用流式细胞术方法检测树突状细胞中cd40+亚型细胞比例。结果如图9所示，10μg/mlbp6联合免疫组的cd11c+cd40+亚型细胞的比例明显高于疫苗组。而且，还检测了mhcii+亚型细胞的比例，如图10所示。与疫苗组相比，三种剂量bp6免疫组的cd11c+mhcii+亚型细胞比例均明显升高，且10μg/mlbp6联合免疫组的cd11c+mhcii+亚型细胞比例最高。小鼠免疫实验结果表明，bp6作为疫苗免疫增强剂的潜力与其剂量有很大关系，也暗示了bp6是一种的能够促进疫苗免疫反应的免疫活性分子。序列表<110>南京农业大学<120>一种促进禽流感和/或新城疫疫苗的免疫反应的法氏囊活性六肽及应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>6<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1lysglyasnargvaltyr15当前第1页12