特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用的制作方法

本发明涉及一种特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)是来源于胚胎中胚层的一类成体干细胞，除具有向多胚层细胞分化、促进损伤修复、抗炎以及神经营养等功能外，msc还可减低以树突状细胞(dendriticcells,dc)为代表的单核巨噬细胞抗原递呈能力，具有免疫抑制作用。

脐带间充质干细胞(umbilicalcoralderivemesenchymalstemcells，uc-mscs)在特性上类似于骨髓间充质干细胞，但在增殖及分化潜能方面优于骨髓间充质干细胞、取材方便，容易工业化制备，是组织工程和再生医学理想的种子细胞。目前，用msc治疗疾病的临床试验正在许多国家进行，但干细胞疗法的成功与否很大程度依赖足量的干细胞归巢到损伤组织，提高msc归巢至靶器官是治疗疾病的关键。

巨噬细胞在胶原诱导的关节炎、肾炎、甲状腺炎、变应性脑脊髓炎等实验性自身免疫性疾病的组织损伤中发挥着重要作用。骨髓来源的活化的巨噬细胞是实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimentalautoimmuneuveitis,eau)组织损伤中主要的效应细胞。研究还发现dc位于正常的脉络膜组织中，有一部分dc在脉络膜视网膜的交接处，并与视网膜色素上皮(rpe)接近，提示这些dc与eau肉芽肿的发生密切相关。在eau中，相当数量的树突状细胞和单核巨噬细胞还渗入到脉络膜。骨髓来源的髓系dc是eau中主要的抗原呈递细胞，而巨噬细胞并未行使抗原呈递的功能，而是在组织损伤中发挥了效应细胞和清除死亡细胞的功能。目前所有研究结果均提示抑制树突状细胞和单核巨噬细胞功能，改变免疫应答类型将是治疗eau的一个有效途径。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用。

本发明保护一种多肽，如序列表的序列1所示。

编码所述多肽的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子具体如序列表的序列2所示。

本发明还保护具有所述核酸分子的重组质粒。所述重组质粒具体可为重组质粒p2。重组质粒p2具体可为在载体gv287的bamhi和agei酶切位点之间插入序列表的序列5第5-52位核苷酸所示的dna分子得到的重组质粒。重组质粒p2的构建方法具体如下：将序列表的序列5所示的单链dna分子1和序列表的序列6所示的单链dna分子2混合后进行退火，得到具有粘末端的双链dna分子；用限制性内切酶bamhi和agei双酶切载体gv287,回收载体骨架；将具有粘末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到重组质粒p2。

本发明还保护表达所述多肽的的重组慢病毒。所述重组慢病毒的制备方法如下：取293t细胞，共转染三种质粒，然后培养，得到重组慢病毒。所述三种质粒为重组质粒p2、phelper1.0载体和phelper2.0载体。

本发明还保护表达所述多肽的重组间充质干细胞。所述重组间充质干细胞是将所述重组慢病毒感染间充质干细胞得到的。所述重组间充质干细胞的制备方法具体如下：用含15％fbs的dmem培养基培养间充质干细胞至细胞融合率为30％～50％，然后加入重组慢病毒的病毒液，然后加入polybrene并使其在体系中的浓度为5μg/ml，混匀、然后继续培养8～12h，然后更换培养基为新鲜的含15％fbs的dmem培养基，继续培养；感染病毒液72小时后，收集细胞，即为表达所述多肽的重组间充质干细胞。所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

本发明还保护以上任一所述核酸分子，或，以上任一所述重组质粒，或，以上任一所述重组慢病毒，或，以上任一所述重组间充质干细胞在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。

本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组间充质干细胞；所述产品的用途为治疗自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。

本发明还保护所述多肽的应用，为促使间充质干细胞靶向单核巨噬细胞。所述单核巨噬细胞为树突状细胞。

本发明对于自身免疫性疾病的治疗具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例2中的细胞形态照片(倒置差显微镜下的细胞，200×)。

图2为实施例2中观察荧光表达的细胞照片(荧光显微镜下的细胞，200×)。

图3为实施例2中cd105/cd44和cd73/cd90分子在细胞表面的表达情况。

图4为实施例3中小鼠眼部的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。采用spss11.0统计软件分析处理。各组间数据的差异比较采用单因素的方差分析及组内数据的差异比较采用q检验。p<0.05为差异有统计学意义。

载体gv28、phelper1.0载体、phelper2.0载体：吉凯基因。

离体的新生儿脐带获自37～40周胎龄剖腹产健康胎儿，获得孕妇知情同意。

irbp片段即光感受器间维生素a类结合蛋白(interphotoreceptorretinoid-bindingprotein，irbp)1169-1191位多肽片段，序列为：ptarsvgaadgsswegvgvvpdv。

弗氏完全佐剂(completefreund’sadjuvant，cfa)：sigma。百日咳毒素(pertussistoxin，ptx)：sigma。

p2多肽(序列1)：ssekaeqqwagq。

p2多肽的编码基因(序列2)：5’-agcagtgaaaaggctgaacaacagtgggctggacaa-3’。

p1多肽(序列3)：ssekaeqqwa。

p1多肽的编码基因(序列4)：5’-agcagtgaaaaggctgaacaacagtgggct-3’。

实施例1、重组慢病毒病毒液的制备

一、构建重组质粒

1、将单链dna分子1和单链dna分子2混合后进行退火，得到具有粘末端的双链dna分子。

单链dna分子1(序列表的序列5)：

5’-gatcccgccaccatgagcagtgaaaaggctgaacaacagtgggctggacaaa-3’；

单链dna分子2(序列表的序列6)：

5’-ccggtttgtccagcccactgttgttcagccttttcactgctcatggtggcgg-3’。

2、用限制性内切酶bamhi和agei双酶切载体gv287,回收载体骨架。

3、将步骤1得到的具有粘末端的双链dna分子和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒p2。

根据测序结果对重组质粒p2进行结构描述如下：在载体gv287的bamhi和agei之间具有序列表的序列2所示的双链dna分子。重组质粒p2中，外源插入的dna分子与载体骨架上的gfp基因形成融合基因，表达具有序列表的序列1所示的p2多肽和gfp蛋白的融合蛋白。

4、将单链dna分子3和单链dna分子4混合后进行退火，得到具有粘末端的双链dna分子。

单链dna分子3：5’-gatcccgccaccatgagcagtgaaaaggctgaacaacagtgggcta-3’；

单链dna分子4：5’-ccggtagcccactgttgttcagccttttcactgctcatggtggcgg-3’。

5、将步骤4得到的具有粘末端的双链dna分子和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒p1。

根据测序结果对重组质粒p1进行结构描述如下：在载体gv287的bamhi和agei之间具有序列表的序列4所示的双链dna分子。重组质粒p1中，外源插入的dna分子与载体骨架上的gfp基因形成融合基因，表达具有序列表的序列3所示的p1多肽和gfp蛋白的融合蛋白。

二、制备重组慢病毒病毒液

1、取对数生长期的293t细胞，用胰蛋白酶消化，然后用含10％fbs的dmem培养基重悬细胞，得到细胞液。将20ml细胞液(含1.2×10⁷个细胞)接种至直径为15cm的细胞培养皿中，培养至细胞密度达70％～80％。转染前两小时，更换培养基为dmem培养基。

2、完成步骤1后，借助lipofectamine2000试剂共转染三种质粒(每皿细胞转染重组质粒20μg、phelper1.0载体15μg、phelper2.0载体10μg)，培养8小时，然后用pbs缓冲液洗涤。

3、完成步骤2后，采用含10％fbs的dmem培养基培养细胞48小时。

4、完成步骤3后，4℃、4000g离心10min，收集上清液。

5、取步骤4得到的上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

6、取步骤5得到的滤液，进行浓缩，得到病毒液。

步骤2中采用的重组质粒为重组质粒p1时，得到的病毒液命名为病毒液p1。

步骤2中采用的重组质粒为重组质粒p2时，得到的病毒液命名为病毒液p2。

步骤2中采用的重组质粒为载体gv287时，得到的病毒液命名为病毒液p0。

三、检测病毒液的病毒滴度

细胞采用293t细胞，以actin为内参基因，采用realtime定量pcr法测定步骤二制备的病毒液的滴度。

病毒液p2的滴度为(3.00e+8)tu/ml。

病毒液p1的滴度为(2.00e+8)tu/ml。

病毒液p0的滴度为(2.12e+8)tu/ml。

实施例2、高效靶向间充质干细胞的获得

细胞培养条件：37℃、体积分数5％co2培养箱中。

1、取离体的新生儿脐带，分离获得脐带间充质干细胞。

2、用含15％fbs的dmem培养基培养脐带间充质干细胞至细胞融合率为30％～50％。

3、完成步骤2后，向细胞体系中加入实施例1制备的病毒液p2(moi＝4-5)，然后加入polybrene并使其在体系中的浓度为5μg/ml，轻轻混匀，然后继续培养8～12h。

4、完成步骤3后，更换培养基为新鲜的含15％fbs的dmem培养基，继续培养。

完成步骤1时的细胞照片见图1a，细胞形态为不规则长梭形，边缘较钝，细胞内外不见明显颗粒，表面光滑、状态良好。

完成步骤2时的细胞照片见图1b，细胞形态仍呈不规则长梭形，边缘光滑，细胞内外偶见颗粒，状态良好。

从感染病毒液开始计时，间隔时间观察荧光表达情况。感染18小时后细胞开始出现绿色荧光(照片见图2a)，随着培养时间的延长荧光强度逐渐增强，感染72小时后细胞荧光达到高峰(照片见图2b)。

感染病毒液72小时后，收集细胞，采用facscaliburtm流式细胞仪检测cd105/cd44和cd73/cd90分子在细胞表面的表达情况。结果见图3。cd105阳性率为90.0％，cd44阳性率为98％，cd73阳性率为85.0％，cd90阳性率为98.5％。

感染病毒液72小时后，收集细胞，即为高效靶向间充质干细胞，命名为p2间充质干细胞,用p2-ucmsc表示，用于实施例3的动物试验。

用病毒液p1代替病毒液p2，进行上述操作，得到p1间充质干细胞,用p1-ucmsc表示，用于实施例3的动物试验。

用病毒液p0代替病毒液p2，进行上述操作，得到p0间充质干细胞,用p0-ucmsc表示，用于实施例3的动物试验。

实施例3、动物模型建立与治疗效果评价

6～10周龄雌性健康c57bl/6小鼠：海军总医院实验动物中心，动物使用许可证号scxk(京)2011-0006。

动物模型为实验性自身免疫性葡萄膜炎(eau)动物模型。

一、建立动物模型和治疗

c57bl/6小鼠随机分为6组，每组50只，分组处理如下(饲养条件均相同)：

正常对照组：不进行任何处理；

模型对照组：试验第1天，注射诱导剂(单次注射；4个足垫均注射，每个足垫150μl)，然后尾静脉注射生理盐水(单次注射；每只小鼠0.1ml)；

ucmsc组：试验第1天，注射诱导剂(单次注射；4个足垫均注射，每个足垫150μl)，然后尾静脉注射实施例2的步骤1得到的脐带间充质干细胞(单次注射；每只小鼠0.1ml，含1×10⁶个细胞)；

载体组：试验第1天，注射诱导剂(单次注射；4个足垫均注射，每个足垫150μl)，然后尾静脉注射p0-ucmsc(单次注射；每只小鼠0.1ml，含1×10⁶个细胞)；

p1靶向ucmsc组：试验第1天，注射诱导剂(单次注射；4个足垫均注射，每个足垫150μl)，然后尾静脉注射p1-ucmsc(单次注射；每只小鼠0.1ml，含1×10⁶个细胞)；

p2靶向ucmsc组：试验第1天，注射诱导剂(单次注射；4个足垫均注射，每个足垫150μl)，然后尾静脉注射p2-ucmsc(单次注射；每只小鼠0.1ml，含1×10⁶个细胞)。

600μl诱导剂中的有效成分为：500μgirbp片段、0.8μg百日咳毒素、300μl弗氏完全佐剂和0.4μg卡介苗。

二、疗效评价

每天用裂隙灯显微镜观察小鼠眼前节的眼部炎症情况，并进行半定量评分。0分：无炎症反应。1分：虹膜充血和轻度的视网膜血管炎。2分：前房轻度纤维组织渗出。3分：前房明显渗出和轻度积脓。4分：前房重度积脓和出血。

模型对照组：试验第7～9天，开始发病，可见虹膜血管扩张、充血，前房内有少量渗出；试验第14天的照片见图4a，病变达高峰，睑裂区大量白色黏稠分泌物，角膜轻度水肿，虹膜表面血管扩张、充血，前房纤维素样渗出增多，瞳孔区虹膜后粘连；试验第14天进行散瞳后的照片见图4b，前房混浊，有大量纤维素样渗出物覆盖于晶状体表面，前部玻璃体絮状混浊。p2靶向ucmsc组：试验第16～20天眼前节炎症减轻，试验第21天后眼内炎症逐渐消退、自愈。各组小鼠的评分见表1。

表1

三、免疫应答检测

试验第9天、第15天分别随机处死各组小鼠5只，用流式细胞术检测小鼠脾脏dc特异性标志cd11c和共刺激分子cd86表达情况(即cd11c⁺cd86^-分子表达)。

建模后小鼠非成熟dc(cd11c⁺cd86^-)细胞数量增加，经过高效靶向ucmsc治疗后cd11c⁺cd86^-细胞数量下降。治疗后第15天，cd11c⁺cd86^-细胞数量继续下降，基本恢复至治疗前水平，经过治疗后成熟dc百分比逐渐增加，在第15天时也基本恢复至正常水平。p2-ucmsc的效果显著优于p1-ucmsc的效果。

sequencelisting

<110>中国人民解放军海军总医院

<120>特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用

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