胎盘壁蜕膜间充质干细胞分化为子宫内膜上皮细胞的方法与流程

本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种胎盘壁蜕膜间充质干细胞分化为子宫内膜上皮细胞的方法。

背景技术：

女性子宫是一个具有高度再生能力的器官，在成年女性的育龄期要经历400多次的增殖、分化和脱落，形成月经。子宫内膜由上皮细胞、间质细胞和血管组成，子宫内膜上皮细胞是子宫内膜组织的重要组成部分，随着月经的发生周期性增生和脱落，是维持子宫功能的重要组成部分。子宫内膜上皮细胞的增殖和分化在子宫内膜损伤修复及组织组织工程领域扮演重要的作用。

正常情况下，子宫内膜周期性增生和脱落所需的新细胞必须在正确的时间和空间上产生准确的程序化。子宫内膜病变是造成女性不孕不育的重要原因，包括子宫内膜黏连，子宫内膜癫痕等，而子宫内膜上皮细胞与这些疾病的发生密切相关。有数据统计约90％的子宫黏连发生与妊娠或非妊娠期子宫内膜的机械损伤有关，其中人工流产的清宫手术是主要原因，中国每年有超过1400万人次的人工流产，造成的宫腔粘连已经成为继发性不孕患者的最常见原因，占继发性不孕症发病原因的8％，它还可导致习惯性流产，试管婴儿植入失败等并发症，严重威胁我国育龄期妇女的生殖健康。目前主要的治疗手段是宫腔镜下的黏连松解术，但是效果并不尽如人意，手术后再次黏连发生率约15％，如果子宫内膜损伤面积过大或完全裸露，即使手术恢复了宫腔形态，内膜也很难再生，恢复功能。

组织工程的出现为治疗子宫内膜损伤造成的宫腔黏连带来新的途径，通过将子宫内膜上皮细胞等种子细胞接种于支架材料上，体外培养出一种细胞膜片，通过手术将细胞膜片移植到受损的子宫内，修复内膜损伤成为可行的治疗方法。

但是制备细胞膜片需要大量的子宫内膜上皮细胞作为种子细胞来恢复患者受损的子宫内膜组织，如何大量培养出子宫内膜上皮细胞成为研究的重点。然而，现有的子宫内膜上皮细胞取材困难，分离子宫内膜上皮细胞大多通过刮宫手术收集组织样本，对患者会造成极大损伤。此外子宫内膜上皮细胞增殖活性低，难以大规模培养，难以满足后期组织工程修复受损子宫内膜所需的种子细胞。

技术实现要素：

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种胎盘壁蜕膜间充质干细胞分化为子宫内膜上皮细胞的方法，其能够稳定、有效地提供具有增殖活性的子宫内膜上皮细胞。

为此，本发明提供了以下技术方案。

一种胎盘壁蜕膜间充质干细胞分化为子宫内膜上皮细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)分离胎盘组织中的胎盘壁蜕膜组织并剪碎清洗，加入组织消化液消化，消化终止后过滤去除未消化的组织块，收集细胞悬液离心，去除上清液，清洗沉淀并再次离心，得到胎盘壁胎膜组织间充质干细胞；

(2)用胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基培养所述胎盘壁蜕膜间充质干细胞；

(3)将所述胎盘壁蜕膜间充质干细胞原代细胞传代至p3代胎盘壁蜕膜间充质干细胞；

(4)取所述p3代胎盘壁蜕膜间充质干细胞，加入所述胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基接种培养过夜；

(5)去除所述胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基，然后清洗，再加入用子宫内膜上皮细胞分化培养基进行诱导培养，得到诱导后的子宫内膜上皮细胞。

优选地，所述胎盘组织是人胎盘组织。

优选地，所述组织消化液包括h-dmem、终浓度为10mg/ml的i型胶原酶和终浓度为0.5mg/ml的dna酶。

优选地，所述步骤(1)中，用h-dmem终止消化。

优选地，所述步骤(1)中，用h-dmem清洗沉淀。

优选地，所述步骤(2)中，所述胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基包括：间充质干细胞无血清培养基、以及基于所述间充质干细胞无血清培养基终浓度为15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和终浓度为10ng/ml的肝脏细胞生长因子。

优选地，所述子宫内膜上皮细胞分化培养基包括：h-dmem、按h-dmem体积计2％的胎牛血清、终浓度为20ng/ml的转化生长因子β、终浓度为25ng/ml的表皮细胞生长因子、终浓度为50ng/ml的血小板衍生因子、终浓度为200nm的雌二醇、终浓度为10μm的全反式维甲酸。

优选地，所述步骤(5)中，用pbs清洗。

优选地，所述步骤(5)中，用所述子宫内膜上皮细胞分化培养基诱导至少14天，每3天全量换液。

壁蜕膜组织分离得到的壁蜕膜间充质干细胞可能混合有其他杂细胞，本发明使用的增殖培养基专门针对间充质干细胞生长而配制，可以有效的促进壁蜕膜间充质干细胞生长，加大间充质干细胞与其他杂细胞生长速度的差异，从而获得生长优势，通过正常传代去除杂细胞；此外，本发明还通过使用组织特异性的细胞因子来促进胎盘壁蜕膜间充质干细胞分化为子宫内膜上皮细胞，特别是采用全反式维甲酸(atra)促进间充质干细胞向上皮细胞分化，通过加入雌二醇促进分化。

本发明的方法通过采集胎儿分娩过程中的胎盘壁蜕膜组织(胎盘的壁蜕膜组织是粘附于羊膜内层的薄膜组织，在胎儿发育过程中由母亲的子宫内膜发育而来)，分离其中的壁蜕膜间充质干细胞，再将其体外培养扩增后成功分化为子宫内膜上皮细胞，用于满足子宫内膜修复所需的种子细胞。

现有的子宫内膜上皮细胞取材困难，细胞增殖活性低，难以为子宫内膜修复的组织工程提供足够的种子细胞，本发明通过采集胎盘壁蜕膜间充质干细胞体外培养扩增后诱导分化为子宫内膜上皮细胞，避免了上述困难，为后期患者子宫内膜修复提供支持。

附图说明

图1是p3代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的显微镜照片。

图2是诱导后的子宫内膜上皮细胞的显微镜照片。

图3是诱导后的子宫内膜上皮细胞的免疫荧光染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

值得注意的是，本发明提供的羊水间充质干细胞分化为神经干细胞的方法并不用于疾病诊断目的和治疗目的。

如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得。出于简要目的，部分技术操作并未具体描述细节，但应理解，这些操作都在本领域技术人员所熟知的范围内，其可以根据本说明书中所记载的内容予以实现。

将羊水间充质干细胞分化为神经干细胞，步骤如下：

1.医院采集足月剖腹产人胎儿胎盘组织，采集前签署客户知情同意书，将采集的胎盘组织于4℃冷藏无菌环境下保存并运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护胎盘组织生物学活性，该组织保护液由生理盐水添加终浓度为25μg/ml的硫酸庆大霉素和终浓度为5μg/ml的两性霉素b配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染。

2.在无菌实验室中分离出胎盘壁蜕膜组织，用预冷的组织清洗液清洗胎盘壁蜕膜组织2-3次，将组织上粘黏的血迹清洗干净，使胎盘壁蜕膜组织呈半透明状。该组织清洗液由生理盐水添加终浓度为25μg/ml的硫酸庆大霉素和终浓度为5μg/ml的两性霉素b配制。

3.将胎盘壁蜕膜组织剪碎，加入等体积(5ml)的组织消化液于37℃震荡培养箱(转速为150r/min)中消化1h，该组织消化液的配方如下：h-dmem(高糖dmem培养基，购自gibco公司，货号：12491-015)、终浓度为10mg/ml的i型胶原酶、终浓度为0.5mg/ml的dna酶。

4.加入20mlh-dmem终止消化，过100μm滤网，去除未消化完全的组织块，收集细胞悬液离心(转速：1000r/min，时间：5分钟)；

5.去除上清液，加入20mlh-dmem(高糖dmem培养基，购自gibco公司，货号：12491-015)清洗沉淀，再次离心(转速：1000r/min，时间：5分钟)；

6.加入胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基正常培养，该胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基的配方如下：无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：nc0103)、终浓度为15ng/ml的bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)、终浓度为10ng/ml的hgf(肝脏细胞生长因子)。

7.原代培养7-10天达到融合度80％进行传代培养，其后每3天传代一次，传代比例为1:4。传代至p3代(细胞形态如图1所示)。

8.取p3代胎盘壁蜕膜间充质干细胞(pd-msc)接种于24孔板中(10000/孔)，加入1ml步骤6中的胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基正常培养过夜。

9.培养过夜后去除胎盘壁蜕膜间充质干细胞选择性培养基，然后用pbs清洗3次，加入子宫内膜上皮细胞分化培养基按常规条件培养14天，每3天全量换液，得到诱导成功的子宫内膜上皮细胞(见图2)。该子宫内膜上皮细胞分化培养基的配方如下：h-dmem(高糖dmem培养基，购自gibco公司，货号：12491-015)、按h-dmem体积计2％的(体积比)fbs(胎牛血清，购自gibco公司，货号：10099141)、终浓度为20ng/ml(基于h-dmem的体积)的tgf-β(转化生长因子β)、终浓度为25ng/ml(基于h-dmem的体积)的egf(表皮细胞生长因子)、终浓度为50ng/ml(基于h-dmem的体积)的pdgf(血小板衍生因子)、终浓度为200nm(纳摩尔每升(nmol/l)，基于h-dmem的体积)的e2(雌二醇)、终浓度为10μm(微摩尔每升(μmol/l)，基于h-dmem的体积)的全反式维甲酸(atra)。

10.诱导后的细胞用4％多聚甲醛(pa)4℃固定过夜，使用小鼠来源的ck-18单抗(购自abcam，货号ab82254)和兔来源的ema(cd227)多抗(购自abcam，货号ab15481)标记细胞，冷藏孵育过夜，清洗后添加488标记的抗兔二抗(购自碧云天，货号：a0423)和cy3标记的抗鼠二抗(购自碧云天，货号：a0521)室温孵育2小时，清洗后添加hoechst33258(购自碧云天，货号：c1025)标记细胞核，室温孵育10分钟，清洗后封片镜检。染色结果如图3所示。

由图3的染色结果可见，根据本发明的方法能够成功诱导胎盘壁蜕膜间充质干细胞分化为具有细胞活性的子宫内膜上皮细胞。