一种儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及一种儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法，属于临床检测试剂盒领域。
背景技术：
：一、儿童癫痫及其特点儿童癫痫又称小儿癫痫，是儿童时间(0～18岁)时期常见的一种病因复杂的、反复发作的、阵发性、暂时性脑功能紊乱所致神经系统综合征。儿童癫痫的病因多为围生期缺血缺氧，皮质发育不良，低级别胶质瘤、脑炎、外伤等引起。癫痫是儿童神经系统最常见的疾病之一，我国调查发现儿童发病率约是总体人群的4倍。儿童癫痫的流行病学，国外流行病学研究报道癫痫发病率在1岁以内为118/10万，1～5岁为48/10万，5～10岁为43/10万，10～15岁为21/10万。人群中活动性癫痫的患病率为0.5％～0.7％，其中半数以上是在12岁之前起病。0岁～14岁儿童的流行病学调查显示，儿童癫痫(不含热性惊厥)的发病率为151/10万/年，患病率为3.45‰。由于新生儿期到青春期，神经系统结构和功能都处于快速发育塑形过程中，因此，不同年龄段的癫痫从病因、发病机制、临床特征表现到预后，很多方面与成人不同。小儿癫痫病因多样，临床表现各异，应尽可能做到病因诊断，选择恰当的适宜的治疗。特别是6岁以下，是脑发育的关键时期，建议积极控制癫痫发作，以利于患儿的生长发育。儿童癫痫与成人癫痫的发病机理基本一致，是由大脑神经元超同步化异常放电引起的具有共同特征的中枢神经功能失调。大多数儿童癫痫患者的癫痫发作可以得到控制，约25％的患者发展成为难治性癫痫(refractoryepilepsy，re)，其中颞叶癫痫(temporallobeepilepsy，tle)占60％～70％。尽管关于癫痫的具体分子机制还不是很清楚，但是在动物模型以及癫痫患者中已证实如白细胞介素-1(interleukin-1，il-1)和拓样受体(tlrs)等炎症因子的高表达。微小rna(mirna)是一类在进化中高度保守的内源性非编码单链rna，通过影响后转录过程进而调节靶基因表达。已有实验证明，在儿童癫痫患者脑组织中特异性表达的mirna有mir-124、mir-134、mir-132、mir-146等。在确认了患儿脑内的mirna的特异性表达后，是否可以通过mirna的检测来预测儿童癫痫的发病风险，成为了发明人研究的重点。mirna-146a(mir-146a)在炎症信号通路中起着至关重要的作用，近来研究发现在癫痫小鼠模型以及儿童癫痫患者中其表达量显著上升，表明mir-146a可能是儿童癫痫发生的重要调控因子。发明人对mir-146a进行临床检测，确认其与儿童癫痫之间的易感性有关之后，对该检测方法及产品进行了系统的开发，设计出一款高效简便检测儿童癫痫的诊断试剂盒。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法。为实现上述发明目的，本发明采用的儿童癫痫的诊断试剂盒的技术方案如下：所述诊断试剂盒包括snp位点的两对上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、dna聚合酶、dntps和缓冲液，所述snp位点为mir-146a的snp位点，第一轮扩增产物长于第二轮扩增产物且包含第二轮扩增产物，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板进行扩增。本发明以巢式pcr法两轮扩增儿童癫痫的易感位点，通过检测该位点的基因型可判断待测者是否发生儿童癫痫或是否有儿童癫痫的风险。优选的，所述mir-146a的snp位点为rs57095329。更优选的，第一轮扩增引物如序列表seqidno：1～2所示。第二轮扩增引物如序列表seqidno：3～4所示。本发明中由于待测序列的特殊性，设计了两轮引物序列，使得试剂盒特异性高且扩增结果准确，使用简单方便，为后续的测序工作奠定了良好的基础。上述检测方法中提供的引物序列仅为最基础的引物序列，检测过程中可以根据最后检测手段的不同对引物序列进行修饰，如在引物中加入荧光标记、生物素标记、纳米微球、磁珠等，修饰方法可采用本领域常规方法，上述各类型修饰应认为落入本发明的保护范围之内。本发明中的检测样本可以选自血样或口腔拭子，基因筛查无痛无副作用，可以快速准确地为儿童癫痫的临床用药提供遗传方面的依据，便于临床用药及预后跟踪。所述试剂盒第一轮和第二轮扩增采用的dna聚合酶均为primixtaq酶。本发明的第二个目的在于提供一种采用上述的儿童癫痫的诊断试剂盒的检测方法，所述试剂盒对基因组dna进行两轮巢式pcr扩增后，扩增产物为mir-146a的snp位点基因片段，对snp位点基因片段进行测序检测。优选的，所述第一轮扩增体系为25μl体系，其中包括dna聚合酶10μl，第一轮扩增引物各0.5μl和基因组dna模板5μl，其余rnasefreeddh2o补足。所述第二轮扩增体系为20μl体系，其中包括dna聚合酶10μl，第一轮扩增引物各0.5μl和第一轮扩增产物2μl，其余rnasefreeddh2o补足。具体的，第一轮扩增的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃1min10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃1min10个循环；72℃延伸10min。第二轮扩增的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s，62℃30s，72℃1min8个循环；95℃30s，60℃30s，72℃1min10个循环；95℃30s，55℃30s，72℃1min8个循环；72℃延伸10min。本发明还提供了一种上述的儿童癫痫的诊断试剂盒的应用，该儿童癫痫的诊断试剂盒可用于儿童癫痫易感性的检测和筛查，也可以用于预测儿童癫痫的发病风险，以及儿童癫痫患者的预后监测。也就是说，本发明的试剂盒可以在有关儿童癫痫的检测条件下使用，检测结果也可以为临床及实验室研究提供详实的第一手数据资料，便于对儿童癫痫的发病机理、相关影响因素等方面的研究。同时，检测结果对于临床的儿童癫痫诊断、用药和恢复等方面，也有一定的指导意义。本发明的试剂盒也可以用于mir-146a的snp位点rs57095329相关的其他研究，在此不做赘述。与现有技术相比，本发明采用两套引物作为巢式pcr引物，灵敏度高，利用本发明的试剂盒可准确、快速、灵敏和特异地对儿童癫痫进行特异性分子检测。试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和tm值设计合理，扩增产物便于检测分离。本发明采用两轮扩增的方法对同一段片段进行重复扩增，第二轮引物结合在第一次pcr产物内部，使得第二次pcr扩增片断短于第一次扩增，由于第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此两轮扩增可以很好地修正第一次扩增中产生的错误片断，扩增的特异性非常高，基本杜绝了引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。高效准确地扩增待扩增片段并进行焦磷酸测序检测mir-146a基因的snp位点，可以快速的给出结论，便于临床对儿童癫痫的疗效预判，取样方便并且检测高效快速成本低，为患者减轻了经济及身体上的负担。试剂盒检测结果不仅可以作为临床对于儿童癫痫发病的预判初检等方面，更能够用于儿童癫痫的用药指导和预后检测。统计后的检测结果还可以作为地区性儿童癫痫的研判依据，为进一步揭示儿童癫痫的发病机理提供数据支持。这种检测试剂盒可以扩展延伸到其他的snp位点检测中，具有良好的推广价值。附图说明图1是本发明提供的pcr扩增产物电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。借鉴现有的文献资料及武汉人民医院的病例研究，确认了mir-146a的snp位点rs57095329与儿童癫痫之间关联的显著性，因此以该位点作为检测位点进行试剂盒设计。通过ncbi中记录的mir-146a的rs57095329的序列信息，设计特异性扩增引物，具体的序列信息如下：tcaaagggtgagcaaatccaggcctcgtgtatctgcagcaatgaaacaagggagctttctgcctgatcttctccccaaaggcagtctctctttttaaatgcctgcacacatgttatttatttatttttggttaacgtttaaattgaggttttggctgaaactcagcctgcgcgcacttgaaaagccaacaggctcattgggcagccgataaagctctcgggatttccccgcggggctgcggagagtacagrcaggaagcctggggacccagcgcctgaccagaacttcctcgggggaggctgcaggggagcaggcgcatcctgcacagaacgctctagagcgcgcaggccaaagcaccaggctgctcctgacacgtgctgcaagagggtccccgacccgggggtccagaccctgcacgcatgatggggaaggtggaggcttccccctcagctccgcggagagaagctgacactgccaggctggaaccttccattccggccc其中snp位点为“a/g”突变，序列中以“r”表示。根据序列设计特异性扩增引物，用于待测样本的检测前扩增。实施例1设计扩增引物本实施例采用巢式pcr的方法对该mirna的snp序列进行测序，测序采用两对特异性测序引物进行。采用primerpremier5设计两对扩增引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。两对扩增引物对应两轮pcr反应，第二轮待扩增片段包含于第一轮待扩增片段中，引物序列如序列表seqidno：1～4所示，f1、f2为forwardprimer，r1、r2为reverseprimer。引物序列具体如下表1所示：表1合成好的引物序列分装入瓶中，与dna聚合酶、dntp等一同装入检测试剂盒中。实施例2抽样扩增抽取待测儿童的静脉血进行mirna抽提，采用edta-k2为抗凝剂的抗凝管抽提不同个体的血液，在1h内，经4℃，1600g离心10min去除血细胞，然后吸取上清转至1.5mlrnase/dnase-free的离心管，随后再4℃，16000g离心10min，去除细胞碎片，最后取上清血浆于1.5mlrnase/dnase-free的离心管中，长期保存于-80℃，短期(4周内)保存于-20℃。本实施例采用mirna抽提试剂盒进行mirna抽提，抽提过程以说明书为准。抽提后的mirna在浓度范围10-100ng/ul，od260/od280的比值在1.8～2.0之间即可进行下一步操作。mirna扩增采用复合扩增的方式，扩增包括常规pcr扩增第一轮和巢式pcr扩增第二轮。两轮pcr反应体系均在冰上混合。第一轮pcr扩增的条件为：取2μl模板dna，引物f1/r1引物进行扩增，反应条件：95℃5min预变性，(95℃30s，60℃30s，72℃1min)×10个循环，(95℃30s，58℃30s，72℃1min)×10个循环，(95℃30s，50℃30s，72℃1min)×10个循环，72℃延伸10min，4℃保存。第二轮pcr扩增的条件为：取第一轮pcr产物为模板，引物f2/r2引物进行扩增，反应条件：95℃5min预变性，(95℃30s，62℃30s，72℃1min)×8个循环，(95℃30s，60℃30s，72℃1min)×10个循环，(95℃30s，55℃30s，72℃1min)×8个循环，72℃延伸10min，4℃保存。两轮pcr反应体系具体如下表2所示：表2试剂第一轮使用量(μl)第二轮使用量(μl)primixtaqtm(2×)10.010forwardprimer(20μm)0.50.5reverseprimer(20μm)0.50.5模板5.02.0rnasefreeddh2o97总量2520pcr产物纯化后经1％琼脂糖凝胶电泳，上样缓冲液中含有追踪染料，每孔上样量相同，电泳结果如图1所示。图中400kb附近，175kb附近之间条带清晰可见，其中条带1为dnamarker，条带2为第一轮扩增产物，条带3为第二轮扩增产物，条带4为阴性对照。说明扩增体系稳定有效，引物扩增无误。回收dna凝胶，测序后送检与公开序列相同。扩增产物经单链分离后可进行焦磷酸测序，或可直接送检测序检测snp位点基因型，产物处理方法因测序方法的不同而进行对于的更改。实施例3抽样检测选取武汉人民医院入院的5岁以下癫痫患儿150例作为患病组，武汉地区的同龄健康儿童150例作为对照组，采用上述检测试剂盒和检测方法检测两组患儿的mir-146a的snp位点rs57095329。检测结果的基因型和等位基因频率如表3所示。表3通过分析mir-146a的snp位点与儿童癫痫之间的关系，确认了mir-146a的snp位点rs57095329与儿童癫痫之间具有相关性；并且由于该位点位于启动子区域，说明该位点的突变会影响mir-146a的转录调控，进一步影响下游的免疫及炎症因子的水平，从而导致疾病的发生。rs57095329的g等位基因频率明显高于对照组，是儿童癫痫发生的风险因子，与其他检测方式所得结果一致，说明本发明的诊断试剂盒检测结果的准确有效。实施例4儿童癫痫诊断试剂盒本实施例中涉及的儿童癫痫的诊断试剂盒包括：mir-146a基因snp位点的特异性扩增引物、taqdna聚合酶、dntps和缓冲液，所述snp位点为rs57095329，特异性引物包括第一轮扩增引物和第二轮扩增引物。第一轮扩增的特异性引物如序列表seqidno：1～seqidno：2所示，第二轮扩增的特异性引物如序列表seqidno：3～seqidno：4所示。dna聚合酶为primixtaq酶。本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后提取的人血dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。序列表<110>昆明新开源暾秀生物科技有限公司<120>一种儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法<130>2018<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>第一轮扩增f1引物序列<400>1gcagcaatgaaacaaggg18<210>2<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>第一轮扩增r1引物序列<400>2tcatgcgtgcagggtctg18<210>3<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>第二轮扩增f2引物序列<400>3attgggcagccgataaag18<210>4<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>第二轮扩增r2引物序列<400>4agcagcctggtgctttgg18当前第1页12