本发明涉及一种从油橄榄叶中同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法，属于天然产物分离技术领域。
背景技术：
油橄榄（oleaeuropaeal.）作为一种经济作物，起初主要种植在地中海沿岸的希腊、意大利等国，后引入我国，主要分布在云南、四川、甘肃、贵州等地。橄榄叶是橄榄种植业的主要副产品，每年在修剪和收获水果时都会被丢弃。这不仅污染环境，还会造成资源的严重浪费。因此，对油橄榄叶进行综合利用开发，是十分必要的。
油橄榄叶中活性物质主要有多酚类、黄酮类、裂环烯醚萜类、双黄酮等，其中橄榄苦苷（oleuropein，ol）和羟基酪醇（hydroxytyrosol，ht）是两种主要的多酚类化合物。根据文献报道，橄榄苦苷和羟基酪醇具有良好的抗氧化作用，可以有效的清除自由基和氧化物，被认为是天然的抗氧剂之一。此外，橄榄苦苷还具有抗真菌、抗病毒、抗癌和降血糖的作用；羟基酪醇具有预防动脉硬化、高血压、脑溢血，降血压、抗癌防癌等作用。因此，含有橄榄苦苷和羟基酪醇的提取物有望成为保健品、药品、化妆品的新原料。目前，从油橄榄叶中同时分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的工艺方法未见报道。
技术实现要素：
本发明提供一种从油橄榄叶中同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：油橄榄叶为原料，用水回流提取两次，混合，冷却，过滤，浓缩至浓度为每升相当于0.05~0.2kg油橄榄叶，此溶液作为上样液；油橄榄叶与水按1:5~1:20的固液质量比进行回流提取，每次提取时间为1.5~2h。
（2）洗脱剂的配制：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混合均匀后，静置分层；然后将上相溶液、下相溶液分开，分别作为洗脱液；正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1:（8~10）:（1~2）:（8~10）。
（3）大孔树脂分离纯化：上样液经过大孔树脂吸附，吸附完毕后树脂柱先用水洗掉水溶性杂质并弃掉洗涤液；再用下相洗脱液洗脱，收集流出液；最后用上相洗脱液洗脱，收集流出液。橄榄苦苷主要在上相洗脱液中，羟基酪醇主要在下相洗脱液中。
大孔树脂选自苯乙烯基质大孔树脂，如d101、lsa-21、hpd450、lsa-40、lsd001、hpd600，树脂柱的径高比为1:5~1:20。
上样液的体积为3bv~15bv，流速为2bv/h~20bv/h；下相洗脱液的体积为3bv~8bv，流速为2bv/h~5bv/h；上相洗脱液的体积为3bv~8bv，流速为3bv/h~8bv/h。
本发明提取液经一次树脂处理后，橄榄苦苷的含量达到45%以上，回收率达到90%以上；羟基酪醇的含量达到3%左右，回收率达到85%以上。
本发明相对于现有技术具有以下优点：
1、本发明通过一步将橄榄苦苷和羟基酪醇分离开，得到高纯度橄榄苦苷和较高纯度的羟基酪醇，可用作抗衰老、降血压、降血糖、防癌抗癌类药物、保健食品和化妆品的原料；
2、生产过程中使用绿色溶剂，环境友好、工艺路线简单，成本低、效率高，适用于工业生产；
3、大孔树脂再生性能好，可以再生重复使用。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法作进一步说明。
实施例1
（1）提取：称取200g油橄榄叶，置于5l圆底烧瓶中，加入3l水，于电热套加热常压回流2h，倒出提取液。料渣中加入2.4l水，常压回流2h，倒出提取液，料渣弃去。合并两次提取液，冷却，过滤，将滤液减压浓缩，最后用水定容至2l，使其浓度为每升相当于油橄榄叶0.1g，摇匀，即得上样液；
（2）洗脱液的配制：取20ml正己烷、180ml乙酸乙酯、20ml甲醇和180ml水，置于1000ml分液漏斗中，摇晃数分钟，静置分层，将上、下相分开，作为洗脱液；
（3）大孔树脂分离纯化：取大孔树脂lsa-2112g，湿法装入内径为1.5cm，柱高为27cm的玻璃柱内，其中径高比为1:14，1bv=12ml。取步骤（1）所得上样液7bv上柱进行吸附，以10bv/h的流速吸附，弃去流出液；再向吸附后的树脂柱加入5bv水洗涤除杂，弃去水洗涤液。然后用5bv配好的下相洗脱液以2bv/h的流速洗脱，此时主要洗脱的为羟基酪醇；最后用5bv配好的上相洗脱液以6bv/h的流速洗脱，此时主要洗脱的为橄榄苦苷；
（4）采用高效液相色谱（hplc）分析：下相和上相洗脱液中的羟基酪醇的峰面积比例为17.81，纯度从0.46%提高到2.96%，回收率为88%。上相和下相洗脱液中的橄榄苦苷的峰面积比例为27.71，纯度从11.40%提高到47.59%，回收率为93%。
实施例2
（1）提取：同实施例1；
（2）洗脱液的配制：取20ml正己烷、160ml乙酸乙酯、20ml甲醇和160ml水，置于1000ml分液漏斗中，摇晃数分钟，静置分层，将上、下相分开，作为洗脱液；
（3）大孔树脂分离纯化：取大孔树脂hpd45012g，湿法装入内径为1.5cm，柱高为27cm的玻璃柱内，其中径高比为1:14，1bv=12ml。取步骤（1）所得上样液8bv上柱进行吸附，以12bv/h的流速吸附，弃去流出液；再向吸附后的树脂柱加入6bv水洗涤除杂，弃去水洗涤液。然后用7bv配好的下相洗脱液以3bv/h的流速洗脱，此时主要洗脱的为羟基酪醇；最后用7bv配好的上相洗脱液以5bv/h的流速洗脱，此时主要洗脱的为橄榄苦苷；（4）采用高效液相色谱（hplc）分析：下相和上相洗脱液中的羟基酪醇的峰面积比例为13.31，纯度从0.46%提高到2.72%，回收率为85%。上相和下相洗脱液中的橄榄苦苷的峰面积比例为23.31，纯度从11.40%提高到45.53%，回收率为92%。
实施例3
（1）提取：同实施例1；
（2）洗脱液的配制：取30ml正己烷、300ml乙酸乙酯、50ml甲醇和240ml水，置于1000ml分液漏斗中，摇晃数分钟，静置分层，将上、下相分开，作为洗脱液；
（3）大孔树脂分离纯化：取大孔树脂lsd00120g，湿法装入内径为1.5cm，柱高为27cm的玻璃柱内，其中径高比为1:14，1bv=20ml。取步骤（1）所得上样液6bv上柱进行吸附，以9bv/h的流速吸附，弃去流出液；再向吸附后的树脂柱加入8bv水洗涤除杂，弃去水洗涤液。然后用6bv配好的下相洗脱液以4bv/h的流速洗脱，此时主要洗脱的为羟基酪醇；最后用6bv配好的上相洗脱液以6bv/h的流速洗脱，此时主要洗脱的为橄榄苦苷；
（4）采用高效液相色谱（hplc）分析：下相和上相洗脱液中的羟基酪醇的峰面积比例为15.46，纯度从0.46%提高到2.83%，回收率为80%。上相和下相洗脱液中的橄榄苦苷的峰面积比例为23.67，纯度从11.40%提高到48.53%，回收率为89%。