一种小鼠主动脉内皮细胞的分离及培养方法与流程

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠主动脉内皮细胞的分离及培养方法。

背景技术：

血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其它血管壁的接口。血管内皮细胞(vec)位于血浆与血管组织之间，它不仅能完成血浆和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。目前的研究表明，血管内皮细胞是多种心脑血管疾病或危险因子作用的靶器官，内皮功能损伤常伴发和加重心脑血管疾病。血管内皮功能障碍与动脉粥硬化、高血压等一系列疾病和状态有关，是动脉粥硬化最早期的改变。因此，如何早期评价血管内皮的功能对于临床防治血管性疾病具有重要意义。而内皮细胞体外培养方法的建立是研究内皮细胞生物学功能及多种疾病关系的基础。

目前，国内外可供应的小鼠主动脉内皮细胞很少且有关体外正常小鼠主动脉内皮细胞培养方法的研究甚少，而且多数方法不稳定，再加上小鼠主动脉血管较细，因此分离内皮细胞难度较大，严重制约了后续的研究工作。本研究通过多次操作实践，使用诱导分化方法获取内皮细胞，成功率高，细胞纯度较高，同时培养基中加入适当生长因子可促进内皮细胞增殖。本发明旨在提供一种操作简单、稳定高效的小鼠主动脉内皮细胞分离方法，建立一套完整可靠的正常小鼠主动脉内皮细胞体外培养技术。

技术实现要素：

根据上述问题，本发明提供了一种小鼠主动脉内皮细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，提高了细胞纯度，是一种较为理想的小鼠主动脉内皮细胞原代培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

本发明采用的的技术方案如下：(1)取出4只成年小鼠的完整的腿部组织（包含大腿和小腿），修剪去除周边结缔组织和肌肉，然后放入75%酒精中浸泡2min，再转入预冷无菌含双抗(100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)的pbs缓冲液中清洗2次，每次2min；(2)清洗完之后，用无菌手术剪剪断关节处，用5ml注射器吸取m199培养基冲出骨髓组织直至骨髓腔变白；(3)收集骨髓液，1200~1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；(4)取两个15ml离心管，各加入4ml淋巴分离液。将上述沉淀用m199培养基重悬，按1:2比例将此重悬液加入分离液上方；(5)然后将离心管放入水平式低速离心机中，2000rpm离心20min，离心结束后，吸取中间白膜层细胞到50ml离心管中，1200~1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；(6)沉淀用m199培养基清洗1次，1200~1500rpm离心5min，弃上清，保留沉淀；(7)完全培养基配制：m199培养基中加入100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，20%胎牛血清，10ng/ml血管内皮生长因子和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，ph值为7.2~7.4；(8)沉淀加完全培养基重悬，接种纤维连接蛋白包被的25cm²培养瓶，于37℃、5%co2培养箱培养；(9)接种24h后进行首次换液，之后每隔3d换液；(10)诱导分化；细胞培养约两周之后，可分化为血管内皮细胞；(11)细胞形态观察：原代培养的小鼠主动脉内皮细胞呈圆形或类圆形，多边形，细胞排列呈铺路石样；(12)细胞鉴定：细胞培养约两周之后，进行cd31抗体流式鉴定；(13)细胞传代：细胞达到80~90%融合时，用pbs缓冲液（浓度为0.01m，ph值为7.2~7.4）清洗细胞2次，加入1ml0.25%胰酶37℃消化3~5min，用含10%胎牛血清的m199培养基终止消化，1500rpm离心去上清，加入完全培养基重悬细胞沉淀，按照1:2比例进行传代培养，记为p1；(14)细胞计数及存活率的测定：锥虫蓝排斥实验计算p1代活细胞百分比；其中，步骤(1)所述的成年小鼠为6~8周龄。其中，步骤(1)所述的pbs缓冲液已4℃预冷，pbs缓冲液浓度为0.01m，ph值为7.2~7.4。其中，步骤(4)所述的淋巴分离液密度为1.077~1.080g/cm³。其中，步骤(8)所述的培养瓶用纤维连接蛋白包被，可以提高细胞的贴壁率。

有益效果

本发明建立了一种简单、高效的分离培养小鼠主动脉内皮细胞的方法，所得原代细胞经过形态观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95%以上，通过流式细胞仪检测细胞标记物，纯度可达80%左右。

本发明采用美国chiscientific公司特制研发的小鼠主动脉内皮细胞完全培养基，其培养的细胞经过cd31抗体流式检测证实纯度达80％左右。相对于免疫磁珠分选等方法，其技术简单易掌握，价格更低。

本发明采用纤维连接包被培养瓶，细胞生长状态好，可满足主动脉内皮细胞实验的要求，纤维连接蛋白包被比apes包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究主动脉内皮细胞的特性，为后续实验提供可靠的细胞资源。

附图说明

图1为培养13d的小鼠主动脉内皮细胞cd31抗体流式鉴定分析。

图2为培养13d的小鼠主动脉内皮细胞图片，100×。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本实验所用的实验仪器与试剂如下：外科手术器械一套，倒置显微镜（xds-1a，上海），cytomicsfc500流式细胞仪（beckmancoulter，美国），恒温孵育箱（heraeus，美国），低温离心机（td24b-ws，上海），超低温冰箱（中科美菱），移液枪（eppendorf，美国），电子分析天平（sartorius，美国），超净工作台（hj-cj-1d，上海），co2细胞培养箱（sanyomco-17ai，日本）。m199培养基，青霉素-链霉素，胎牛血清均购买于美国gibco公司，纤维连接蛋白来自sigma，碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子均购买于美国bd，apcanti-mousecd31antibody和apcratigg2a,κisotypectrlantibody购买于biolegend，pbs缓冲液自制（8.0gnacl、0.2gkcl、0.2gkh2po4、1.44gna2hpo4溶于1l超纯水中，调整ph值为7.2~7.4，非特殊指出，本专利所用的pbs缓冲液皆为此配方），胰蛋白酶购买于碧云天公司，淋巴分离液购买于美国mp公司，细胞培养瓶、离心管购于美国corning公司，锥虫蓝购买于美国biofer。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：(1)用超纯水配制pbs缓冲液，灭菌锅消毒灭菌，室温冷却后使用；实验器械置于铝盒中121℃高压灭菌，烘干后备用；(2)包被液的配制：pbs缓冲液中加入纤维连接蛋白粉末配制成5ug/ml，0.22um滤膜过滤，4℃保存备用；(3)取出4只成年icr小鼠(约18~22g)的完整的腿部组织（包含大腿和小腿），修剪去除周边结缔组织和肌肉，然后放入75%酒精中浸泡2min，再转入预冷无菌含双抗(100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)的pbs缓冲液（浓度为0.008~0.015m，ph值为7.2~7.4）中清洗2次，每次2min；(4)清洗完之后，用无菌手术剪剪断关节处，用5ml注射器吸取m199培养基冲出骨髓组织直至骨髓腔变白；(5)收集骨髓液，1200~1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；(6)取两个15ml离心管，各加入4ml淋巴分离液。将上述沉淀用16mlm199培养基重悬，按1:2比例将此重悬液缓慢加入分离液上方；(7)然后将离心管放入水平式低速离心机中，2000rpm离心20min，离心结束后，吸取中间白膜层细胞到50ml离心管中，1200~1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；(8)沉淀用20mlm199培养基清洗1次，1200~1500rpm离心5min，弃上清，保留沉淀；(9)完全培养基配制：m199培养基中加入100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，20%胎牛血清，10ng/ml血管内皮生长因子和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，ph值为7.2~7.4；(10)沉淀加5ml完全培养基重悬，接种纤维连接蛋白包被的25cm²培养瓶，于37℃、5%co2培养箱培养；(11)接种24h后进行首次换液，之后每隔3d换液；(12)诱导分化；细胞培养约两周之后，可分化为血管内皮细胞；(13)细胞形态观察：原代培养的小鼠主动脉内皮细胞呈圆形或类圆形，多边形，细胞排列紧密，呈铺路石样；（14）细胞传代：细胞达到80~90%融合时进行传代，用pbs缓冲液（浓度为0.01m，ph值为7.2~7.4）清洗细胞2次，加入1ml0.25%胰酶37℃消化3~5min，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆，开始脱落时加入含10%胎牛血清的m199培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，制成单细胞悬液，之后1200~1500rpm离心5min，弃上清，沉淀用10ml完全培养基重悬，按照1:2比例进行传代培养，记为p1，以后以同样方法进行传代；（15）cd31抗体流式鉴定：①.细胞经过0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，离心去掉消化液，再用pbs缓冲液清洗两次，收集沉淀细胞；②.使用血球计数板进行细胞计数，分为两管，每管调整细胞密度为1×10⁶个/ml；③.其中一管加入一定体积的apcanti-mousecd31antibody，另一管加入相同体积的apcratigg2a,κisotypectrlantibody，放在冰上孵育30min；④.孵育结束后，1500rpm离心5min，去上清，沉淀用pbs缓冲液洗3次，每次5min；⑤.沉淀最后用100ulpbs缓冲液重悬，上流式细胞仪；⑥.flojo软件进行结果分析。（16）细胞计数及成活率测定：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2mlp1代细胞悬液加入0.2ml的0.4%锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示小鼠主动脉内皮细胞存活，如细胞核被染蓝，提示小鼠主动脉内皮细胞死亡，计数四个大格子细胞数（四大格细胞总数/4×10⁴），计算细胞成活率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%；

经流式细胞仪鉴定，flojo软件进行结果分析，阳性率即细胞纯度约80%。

本发明所得到的小鼠主动脉内皮细胞数量多，p1代细胞成活率达95%以上，细胞纯度达80%左右。

本发明分离得到的小鼠主动脉内皮细胞可大量增殖，并且可以培养2-3代，为后续的实验提供可靠的细胞资源。

以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。