蛋白激酶A催化亚基TPK1基因改造方法及其应用与流程

文档序号：21048111发布日期：2020-06-09 21:02阅读：854来源：国知局

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及通过蛋白激酶a催化亚基的氨基酸点突变，调控无细胞蛋白质合成体系中外源蛋白的合成效率。

背景技术：

大部分蛋白在合成过程中经过蛋白质翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关。蛋白质磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，大约30%的蛋白组可以被磷酸化[1]。蛋白质磷酸化在第二信使传递和酶的级联作用中起到关键作用，很多最基础的生物过程如信号传导、基因表达和细胞分裂等都受到蛋白磷酸化的调控，是原核和真核生物中重要的调控修饰形式之一[2]。蛋白质的磷酸化位点在肽链的氨基酸残基上，如酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。这些氨基酸残基本身不带电荷，在侧链加入带有强负电荷的磷酸基团后，蛋白质的构型和活性进而发生变化[3]。蛋白质磷酸化是在一系列蛋白激酶的催化作用下完成的。

3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶(camp-dependentproteinkinase)，即蛋白激酶a（proteinkinasea，pka)，最早在1968年被识别和纯化，是蛋白激酶家族中重要的一类丝/苏氨酸蛋白激酶[4]。信号分子与质膜上受体结合后，通过g蛋白偶联受体（gi或gs）调节腺苷酸环化酶（ac）的活性。ac催化atp生成camp从而控制camp的含量，进而决定蛋白激酶pka的活性。由pka负责细胞内很多不同类型的蛋白质磷酸化，从而调节生物代谢和基因表达。比如在有营养的状态下，通过ras-camp的信号通路，促进细胞的营养生长。

pka全酶结构是特殊的四聚体，由两个催化亚基（c）和两个调节亚基（r）组成。催化亚基含有水解atp的活性位点和一个结合调节亚基的结构域。调节亚基含有可以结合camp的结构域[5]。在没有camp时，催化亚基的活性被调节亚基所抑制，因此四聚体全酶结构下的pka没有活性。4个camp分子可以分别结合两个调节亚基，引起pka激酶的构象变化，导致两个催化亚基的脱离。在atp存在时，没有调节亚基结合抑制的催化亚基即可开始磷酸化含有arg-arg-x-ser/thr序列的丝/苏氨酸蛋白[6]。在酿酒酵母中，pka激酶的调节亚基是bcy1基因所编码，催化亚基是由三个功能上部分重复的基因所编码，分别为tpk1,tpk2,tpk3。在葡萄糖的刺激下，camp/pka通路被激活，tpk1的ser179位点的自磷酸化增加，从而导致pka激酶的活性增强。tpk1的自磷酸化机制有效地调控了在葡萄糖存在下的pka活性[7]。

在酵母中，pka信号通路在对营养物质的反应上对细胞生长有着重要的作用。在细胞被破碎前，被ser179的自磷酸化激活的pka促进细胞生长。而将丝氨酸突变为天冬氨酸，处于pka持续激活状态下的细胞被制备成裂解液以后，可能有效改变蛋白质的体外合成的效率。鉴于此，我们以克鲁维酵母菌作为试验菌株，模拟丝氨酸的自磷酸化作用，从而判断其是否对无细胞蛋白合成体系中的外源蛋白合成效率有影响。

参考文献如下：

1.ptaceketal.,globalanalysisofproteinphosphorylationinyeast.nature,2005.438:679-684.

2.huntert.signaling-2000andbeyond.cell,2000.100:113-127.

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4.walshetal.,anadenosine3’,5’-monophosphate-dependantproteinkinasefromrabbitskeletalmuscle.j.biol.chem.,1968.243:3763-3765.

5.bauman&scott.,kinase-andphosphatase-anchoringproteins:harnessingthedynamicduo.naturecellbiology,2002.4(8):e203-6.

6.voetetal.,fundamentalsofbiochemistry.wiley.2006,pg492

solarietal.,regulationofpkaactivitybyanautophosphorylationmechanisminsaccharomycescerevisiae.biochem.j.,2014.462:567–579。

技术实现要素：

为了解决上述问题，通过序列比对查找到克鲁维酵母菌中相应的丝氨酸位点，并对其相应的核苷酸序列进行改造，从而将该位点的丝氨酸改造成天冬氨酸，以提升无细胞蛋白合成体系中的外源蛋白的合成效率。

本发明第一方面提供一种真核生物的基因改造方法，其通过基因编辑对3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶，即蛋白激酶a催化亚基的tpk1编码基因进行碱基突变，从而将该真核生物的tpk1氨基酸序列中与酿酒酵母tpk1氨基酸序列179号位点相对应的丝氨酸突变为天冬氨酸。

进一步的，该相对应的位点为237号位点。

进一步的，基因编辑技术为现有技术，可以选择crispr/cas9基因编辑技术。

本发明第二方面提供一种基因工程细胞，该基因工程细胞的基因组中包含利用第一方面的基因改造方法进行的改造。

进一步的，所述细胞为真核细胞。

进一步的，所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。

进一步的，酵母细胞选毕氏酵母、克鲁维酵母属酵母之一或其组合。

进一步的，所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母之一或其任意组合。

本发明第三方面提供一种真核无细胞蛋白质合成体系，该合成体系至少包括细胞提取物，所述细胞提取物来自于第二方面中任一项基因工程细胞。

本发明第四方面提供第一方面中所述基因改造方法、第二方面中所述基因工程细胞在提高真核无细胞蛋白质合成体系中外源蛋白表达量中的应用。

本发明第五方面提供一种提高真核无细胞蛋白合成体系中外源蛋白表达量的方法，该方法包括：

步骤1，提供第三方面所述的真核无细胞蛋白合成体系；

步骤2，在步骤1的合体体系中加入编码外源蛋白的dna分子，在一定条件下进行孵育，合成所述的外源蛋白。

进一步的，反应温度为20-35℃，优选的为20-30℃，更优选的为25℃。

进一步的，反应时间为0.5-20h，优选的为1-18h，更优选的为2-15h，更优选的为3-12h；上述反应时间可根据具体情况人为确定，也可以为3-15h，也可以为3-20h，也可以为具体的时间点，如3h、5h、10h、15h、18h、20h。

本发明的主要优点和积极效果主要包括:

（1）本发明首次通过基因改造技术，借助高效的细胞转化平台，对细胞内的tpk1基因进行改造，从而改变翻译系统的蛋白合成效率；

（2）本发明首次通过crispr-cas9基因编辑技术对tpk1进行s237d点突变，从而改变体外蛋白质合成能力；

（3）本发明提供的pka通路改造思路增加了宿主菌中可以选择的改造目标靶点，不仅能够增强真核体外生物合成体系起始蛋白质翻译效率，更主要的是能够增加体外生物合成体系针对不同蛋白质合成的可能性。

附图说明

图1.s.cerevisiae的tpk1-3和k.lactis的tpk1-2的蛋白序列比对。该图中确定s.cerevisiae中tpk1的179位点的丝氨酸在其他蛋白中均较为保守，其对应的k.lactis的tpk1为237位点的丝氨酸。

图2.pcas9_kltpk1质粒图谱示意图。

图3.pmd18t-tpk1s237d质粒图谱示意图。

图4.改造菌株体外翻译活性测定数据图。利用绿色荧光蛋白（egfp）作为外源蛋白，根据绿色荧光蛋白的荧光强度指示体外生物合成系统的重组蛋白的合成能力。其中a代表改造前（未改造）的克鲁维酵母，b代表tpk1基因改造后的克鲁维酵母。

具体实施方式

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明通过crispr-cas9基因编辑技术，以乳酸克鲁维酵母菌（k.lactis）为例进行改造，将其基因组中的tpk1基因进行突变改造。tpk1是pka（蛋白激酶a）的催化亚基，通过点突变使其模拟发生自磷酸化，从而激活催化活性和提高pka通路活性，以影响和调控无细胞体外翻译系统的效率。但需要说明的是上述改造利用crispr-cas9基因编辑技术，但并未说明基因编辑只能选择该技术，现有的基因编辑技术均能够适用。上述改造在乳酸克鲁维酵母体系中进行验证，并未说明该改造只能适用于乳酸克鲁维酵母体系，对于其他真核生物体系都是适用的。

基于s.cerevisiae酵母中tpk1基因序列，在ncbi数据库中以tpk1基因进行blast比对分析，确定乳酸克鲁维酵母中，tpk1基因的编号是klla0b07205p（seqidno.1）。编码tpk1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述tpk1的蛋白序列如seqidno.2所示。

seqidno.1

atgagaccttttgacaacgaatccaagggatttctttctggccgaacagatcaaattgaattacctgtggtacaggctgtttcaacaagttcaaattctcaagaaccacttctttctagcaaagacccactacgagatggaagcaacgtggggaataggttgagtggaaacagcgaaactctgataaccaactctgatgctgatcatcctatggagacggataataataactctaatcttaataatactaattcctctactaatactaatgataacaaagattcgtcatccaattccagcaataatgaaaatggggacagtagcaacaattcaaatagaaggcatagcaaccattgtcacaagcataaccatctaagcagcacttctaccctcaaggcaagagttacttctggaaaatatgcattatatgattttcagattctgagaactttgggtacaggttcgtttggtagagttcatttggtgagatccaatcacaacggcaggttctatgcaatgaaagttttgaaaaaaaacaccgttgtcaaattgaaacaagtggagcataccaacgatgaaagaaatatgctaagtatagtatcccatcctttcataattagaatgtggggaactttccaggactcacagcaattgtttatgatcatggattacatcgaaggtggtgaactattctctcttttaaggaagtctcaaaggttcccaaacccggtcgcgaagttttatgcagcagaagtttgtcttgcgttggaatacctacattctaaaggcatcatttacagagatttgaaaccagaaaatatccttttagataagaacggacatatcaagttaactgatttcgggttcgctaaatatgttcctgatgtcacttacactctctgtggaacaccggactatatcgcacctgaagtggtaagcacaaaaccttacaacaaatctgtggattggtggagttttggtgttttaatctacgaaatgttagcaggatatacacctttctacgattcaaacacaattaagacctatgagaatattctaaatgctccagtaagattcccaccatttttccattctgatgctcaagatctaatatcgaaactcatcacaagagacttaagtcaacggctaggtaatttacaaaatggaagtgaggacgtaaagaatcatccgtggttcagcgaggttgtgtgggaaaaactactctgcaaaaacattgaaactccatatgaacctcctattcaggccggacaaggcgatacctctcaatacgataggtatccagaggaagaggttaattatggcattcaaggcgaagatccgtaccatagtattttcaccaacttttag

seqidno.2

mrpfdneskgflsgrtdqielpvvqavstssnsqepllsskdplrdgsnvgnrlsgnsetlitnsdadhpmetdnnnsnlnntnsstntndnkdsssnssnnengdssnnsnrrhsnhchkhnhlsststlkarvtsgkyalydfqilrtlgtgsfgrvhlvrsnhngrfyamkvlkkntvvklkqvehtndernmlsivshpfiirmwgtfqdsqqlfmimdyieggelfsllrksqrfpnpvakfyaaevclaleylhskgiiyrdlkpenilldknghikltdfgfakyvpdvtytlcgtpdyiapevvstkpynksvdwwsfgvliyemlagytpfydsntiktyenilnapvrfppffhsdaqdlisklitrdlsqrlgnlqngsedvknhpwfsevvwekllcknietpyeppiqagqgdtsqydrypeeevnygiqgedpyhsiftnf

通过序列比对查找s.cerevisiae中tpk1的179位点的丝氨酸与克鲁维酵母菌中相应的丝氨酸位点为237位点（参见图1），并对其相应的核苷酸序列进行改造，从而将该位点的丝氨酸改造成天冬氨酸。经过改造后的序列如下：

编码tpk1s237d的核苷酸序列如seqidno.3所示，tpk1s237d的蛋白序列如seqidno.4所示。

atgagaccttttgacaacgaatccaagggatttctttctggccgaacagatcaaattgaattacctgtggtacaggctgtttcaacaagttcaaattctcaagaaccacttctttctagcaaagacccactacgagatggaagcaacgtggggaataggttgagtggaaacagcgaaactctgataaccaactctgatgctgatcatcctatggagacggataataataactctaatcttaataatactaattcctctactaatactaatgataacaaagattcgtcatccaattccagcaataatgaaaatggggacagtagcaacaattcaaatagaaggcatagcaaccattgtcacaagcataaccatctaagcagcacttctaccctcaaggcaagagttacttctggaaaatatgcattatatgattttcagattctgagaactttgggtacaggttcgtttggtagagttcatttggtgagatccaatcacaacggcaggttctatgcaatgaaagttttgaaaaaaaacaccgttgtcaaattgaaacaagtggagcataccaacgatgaaagaaatatgctaagtatagtatcccatcctttcataattagaatgtggggaactttccaggactcacagcaattgtttatgatcatggattacatcgaaggtggtgaactattctctcttttaaggaaggaccaaaggttcccaaacccggtcgcgaagttttatgcagcagaagtttgtcttgcgttggaatacctacattctaaaggcatcatttacagagatttgaaaccagaaaatatccttttagataagaacggacatatcaagttaactgatttcgggttcgctaaatatgttcctgatgtcacttacactctctgtggaacaccggactatatcgcacctgaagtggtaagcacaaaaccttacaacaaatctgtggattggtggagttttggtgttttaatctacgaaatgttagcaggatatacacctttctacgattcaaacacaattaagacctatgagaatattctaaatgctccagtaagattcccaccatttttccattctgatgctcaagatctaatatcgaaactcatcacaagagacttaagtcaacggctaggtaatttacaaaatggaagtgaggacgtaaagaatcatccgtggttcagcgaggttgtgtgggaaaaactactctgcaaaaacattgaaactccatatgaacctcctattcaggccggacaaggcgatacctctcaatacgataggtatccagaggaagaggttaattatggcattcaaggcgaagatccgtaccatagtattttcaccaacttttag

seqidno.4

mrpfdneskgflsgrtdqielpvvqavstssnsqepllsskdplrdgsnvgnrlsgnsetlitnsdadhpmetdnnnsnlnntnsstntndnkdsssnssnnengdssnnsnrrhsnhchkhnhlsststlkarvtsgkyalydfqilrtlgtgsfgrvhlvrsnhngrfyamkvlkkntvvklkqvehtndernmlsivshpfiirmwgtfqdsqqlfmimdyieggelfsllrkdqrfpnpvakfyaaevclaleylhskgiiyrdlkpenilldknghikltdfgfakyvpdvtytlcgtpdyiapevvstkpynksvdwwsfgvliyemlagytpfydsntiktyenilnapvrfppffhsdaqdlisklitrdlsqrlgnlqngsedvknhpwfsevvwekllcknietpyeppiqagqgdtsqydrypeeevnygiqgedpyhsiftnf

实施例1通过crispr-cas9改造酵母tpk1蛋白

1.1tpk1序列检索及crisprgrna序列确定

根据蛋白序列比对，s.cerevisiae和k.lactis细胞中的tpk1基因在待改造的s位点是高度保守的。为了实现tpk1中s237d的点突变改造，通过搜索该s237残基附近的pam序列(ngg)，确定对应的grna以切割造成双链断裂。本实施例中grna选择的原则为：gc含量适中(40%-60%)，避免polyt结构的存在。最终，本发明确定的优化的tpk1的grna序列为gtctcaaaggttcccaaacc。

1.2crispr质粒的构建

在pcas9质粒上构建了tpk1grna，所用引物为tpk1-grna-pf：gtctcaaaggttcccaaaccgttttagagctagaaatagc;tpk1-grna-pr：ggtttgggaacctttgagacgattcgaactgccgagaaagtaac。以pcas质粒为模板，进行pcr扩增。取扩增产物17µl，加入0.2µldpni，2µl10×digestionbuffer，混匀后37℃水浴3h。取dpni处理后产物10µl加入50µldh5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mllb液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于kan抗性lb固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在lb液体培养基中振荡培养，pcr检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pcas9_kltpk1（质粒图参见图2）。

1.3供体dna质粒构建及扩增

为了便于线性供体dna的保存及扩增，本实施例将供体dna插入到pmd18t质粒中，并通过pcr扩增得到线性供体dna序列。

以pmd18t质粒为模板，引物pmd18t-pf：atcgtcgacctgcaggcatg和pmd18t-pr：atctctagaggatccccggg进行pcr扩增，取扩增产物17µl，加入1µldpni，2µl10×digestionbuffer，混匀后37℃水浴3h，获得质粒骨架线性片段pmd18t-vector。

1.3.1构建供体质粒pmd18t-tpk1s237d

以乳酸克鲁维酵母基因组dna为模板，用引物kltpk1-hr1-pf：gagctcggtacccggggatcctctagagatgaaccgctatatcttgcatg和kltpk1-mutant-pr：gactggattaggaaaacgctggtctttccttaaaagagagaatag进行pcr扩增，产物名为tpk1-hr1；

以乳酸克鲁维酵母基因组dna为模板，用引物kltpk1-mutant-pf：aaggaaagaccagcgttttcctaatccagtcgcgaagttttatgcagcag和kltpk1-hr2-pr：gcatgcctgcaggtcgacgattaacggcagcgtttctgaag进行pcr扩增，产物名为tpk1-hr2；

将扩增产物tpk1-hr1、tpk1-hr2和pmd18t-vector各1µl，加入3µlcloningmix(transgenepeasy-uniseamlesscloningandassemblykit，全式金公司，下同)，混匀后50℃水浴1h。水浴结束后置于冰上2min，将6µl反应液全部加入50µltrans-t1感受态细胞(全式金公司，下同)中，冰上放置30min，42℃热激30s后，加入1mllb液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于amp抗性lb固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在lb液体培养基中振荡培养，pcr检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pmd18t-tpk1s237d。

1.4k.lactis电转化

从-80℃冰箱取出感受态，冰上融化，加入400nggrna&cas9质粒(或grna/cas9片段)和通过引物对pmd18t-tpk1s237d扩增得到的1000ng供体dna片段，混匀后全部转入电击杯中，冰浴2min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5kv，200ω，25μf)；电击结束后立即加入700μlypd，30℃，200rpm摇床孵育1～3h；取2～200μl接种于ypd(含g418抗性)平板，30℃培养2～3天至单菌落出现。

1.5阳性鉴定

在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物f:agtctcaaaggttcccaaac和r：ataagattattgcatcgagc对样品进行pcr检测。阴性菌株无pcr条带。pcr结果阳性并用引物对f:gggtatttcgaataagggac、r:ataagattattgcatcgagc经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并命名为tpk1s237d。

实施例2体外蛋白质合成体系

2.1细胞提取物的制备

细胞提取液的制备方法包括以下步骤：

(i)提供细胞，细胞为实施例1制备的tpk1s237d细胞株；

(ii)对细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的细胞；

(iii)对经洗涤的细胞进行细胞破碎处理，从而获得细胞粗提物；

(iv)对所述细胞粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为细胞提取物。

其中，固液分离方式不受特别限制，本实施例选择的方式为离心。离心条件为30000×g；离心时间为30min；离心4^oc下进行。

其中，洗涤处理方式不受特别限制，本实施例选择的洗涤处理方式为采用洗涤液在ph为7.4下进行处理，所述洗涤液没有特别限制，典型的所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。本实施例选择醋酸钾。

其中，细胞破碎处理的方式不受特别限制，一种优选的所述的细胞破碎处理包括高压破碎、冻融(如液氮低温)破碎。

2.2体外蛋白质合成体系的配制

终浓度为22mmph为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，30-150mm醋酸钾，1.0-5.0mm醋酸镁，1.5-4mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸)，0.08-0.24mm的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，25mm磷酸肌酸，1.7mm二硫苏糖醇，0.027-0.054mg/mlt7rna聚合酶，0.27mg/ml磷酸肌酸激酶，1%-4%的聚乙二醇，0.5%-2%的蔗糖，最后加入50%体积的细胞提取物。

2.3体外蛋白质合成反应

将上述的反应体系放置在约为25℃的环境中，反应3h；

增强型绿色荧光蛋白(egfp)活性测定：反应结束后，在96孔白板或384孔白板中加入10µl反应液，立即放置于envision2120多功能酶标仪(perkinelmer),读数，检测增强型绿色荧光蛋白活性，相对荧光单位值(relativefluorescenceunit，rfu)作为活性单位，如图4所示。

其中a为未经改造的克鲁维酵母菌，b为改造后的克鲁维酵母菌，其中，a的rfu值为373.7，b的rfu为676。b的数值是a的1.8倍。即通过基因编辑技术对tpk1进行s237d点突变，能够提高无细胞蛋白合成体系中的外源蛋白的合成能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>康码（上海）生物科技有限公司

<120>蛋白激酶a催化亚基tpk1基因改造方法及其应用

<130>2018

<141>2018-11-30

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1368

<212>dna

<213>乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)

<400>1

atgagaccttttgacaacgaatccaagggatttctttctggccgaacagatcaaattgaa60

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aaagacccactacgagatggaagcaacgtggggaataggttgagtggaaacagcgaaact180

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ggcattcaaggcgaagatccgtaccatagtattttcaccaacttttag1368

<210>2

<211>455

<212>prt

<213>乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)

<400>2

metargpropheaspasngluserlysglypheleuserglyargthr

151015

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hisserilephethrasnphe

450455

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3