一种多酶耦合制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法与流程

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法。

背景技术：

(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid)是一种重要的药物中间体，被广泛应用于多种有机小分子药物以及肽基药物的合成。例如，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸是降压药喹那普利的重要组成部分(diversity-orientedsynthesisofmedicinallyimportant1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid(tic)derivativesandhigheranalogs[j].orgbiomolchem,2014,12(45):9054-91.)。此外，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸可用于合成含有四氢异喹啉母核的小分子拮抗剂，作用于趋化因子受体cxcr4，从而有望用于治疗hiv等疾病(discoveryoftetrahydroisoquinoline-basedcxcr4antagonists[j].acsmedchemlett,2013,4(11):1025-30.)。

现有技术中，制备光学纯(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法有化学手性合成和生物催化动力学拆分两种。研究人员最初利用pictet-spengler反应制备光学纯(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，以l-苯丙氨酸为原料，在浓酸与高温条件下，与甲醛缩合生成目标产物，该法工艺相对简单，但生成的产物会发生部分消旋化。随后，bischler-nepieralski反应，[2+2+2]环加成方法等也被用于制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸及其衍生物，该类方法路线较复杂，成本高(diversity-orientedsynthesisofmedicinallyimportant1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid(tic)derivativesandhigheranalogs[j].orgbiomolchem,2014,12(45):9054-91.)。近年来，kurata等通过臭氧分解、氧化及去保护作用三步不对成合成(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(synthesisofopticallypure(r)-and(s)-tetrahydroisoquinoline-1-and-3-carboxylicacids[j].synthesis,2015,47(09):1238-44.)。该法产率低，步骤较多，不易于工业化应用。龚等利用化学酶法制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸即以外消旋苯丙氨酸为原料,经pictet-spengler反应合成外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，然后经酯化作用、脂肪酶动力学拆分制备(s)-构型产物。23.8g外消旋酯盐酸盐(0.1mol)，脂肪酶和底物质量比为0.2，反应48h，产物ee>99％，收率为49.1％。该法所得产物立体选择性高，工艺相对简单，但仍存在最大理论产率只有50％的问题(化学酶法合成光学纯(s)-1,2,3,4-四氢喹啉-3-羧酸的研究[j].现代化工,2003,23(12):23-5.)。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(i)的方法，

所述方法包括如下步骤：

以1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸外消旋体或1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐的外消旋体为底物，使该底物中(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸在氧化脱氢酶的催化作用下反应生成式(ii)所示的亚胺酸；

使所述式(ii)所示的亚胺酸在哌啶酸还原酶与能够供给氢负离子的辅酶的存在下转化为所述(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸。

进一步地，所述1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐可以为1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的碱金属盐或铵盐等，具体例如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钠、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钾、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸铵。

根据本发明，所述氧化脱氢酶是能够选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的酶，且选择性大于等于80％，优选大于等于90％。

根据本发明的一些优选方面，所述氧化脱氢酶为d-氨基酸氧化酶。

根据本发明，所述d-氨基酸氧化酶为选自如下d-氨基酸氧化酶中的一种或多种的组合：来源于三角酵母(trigonopsisvariabilis)cbs4095的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶、来自禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)cs3005的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶、来自梨孢镰刀菌(fusariumpoae)2516的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶，来自茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶。

优选地，所述d-氨基酸氧化酶具有如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示的氨基酸序列。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述d-氨基酸氧化酶的添加量以8000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应体系重量的1～5％。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述d-氨基酸氧化酶的使用形式为离体的d-氨基酸氧化酶，或者离体的d-氨基酸氧化酶的粗酶液或者纯酶或者固定化酶，或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞。

进一步地，所述细胞为表达d-氨基酸氧化酶且含有表达载体pet-28a(+)的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为e.colibl21(de3)；其中，所述d-氨基酸氧化酶基因连接在所述表达载体pet-28a(+)上。

根据本发明，所述哌啶酸还原酶为选自如下哌啶酸还原酶中的一中或多种的组合：来源于恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)kt2440的哌啶酸还原酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的哌啶酸还原酶、来源于绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1的哌啶酸还原酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的哌啶酸还原酶、来源于荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)pf0-1的哌啶酸还原酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的哌啶酸还原酶、来源于虫媒假单胞菌(pseudomonasentomophilastr.)l48的哌啶酸还原酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的哌啶酸还原酶。

优选地，所述哌啶酸还原酶具有如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示的氨基酸序列。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述哌啶酸还原酶的添加量以4000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应体系重量的0.1～5％。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述哌啶酸还原酶的使用形式为离体的哌啶酸还原酶，含有离体的哌啶酸还原酶的粗酶液或者纯酶或者固定化酶，或胞内表达哌啶酸还原酶的细胞。

进一步地，所述细胞为表达哌啶酸还原酶且含有表达载体pet-28a(+)的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为e.colibl21(de3)；其中，所述哌啶酸还原酶基因连接在所述表达载体pet-28a(+)上。

根据本发明的一些优选方面，所述能够供给氢负离子的辅酶为nadh和/或nadph。

根据本发明的一些优选方面，使所述生成亚胺酸的反应还在黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的存在下进行。使反应在fad存在下进行，有助于进一步提高转化率。进一步地，fad与所述的底物等当量或者是过量的。一般情况下，所制备的d-氨基酸氧化酶的粗酶液中已经含有足够量的fad，在直接采用粗酶液的情况下，无需再另外添加fad。在使用d-氨基酸氧化酶纯酶的情况下，可以根据需要再外加适量的fad。

根据本发明的一些优选方面，使所述生成亚胺酸的反应还在过氧化氢酶的存在下进行。

根据本发明的一些具体且优选的方面，使生成所述亚胺酸的反应在设定温度和有氧环境中进行。

根据本发明的优选方面，所述设定温度为20～70℃。更优选地，所述设定温度为20～50℃。进一步优选地，所述设定温度为30～40℃。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述方法的实施过程包括：首先构建反应体系，然后控制所述反应体系处于设定温度和有氧环境中进行反应，所述反应体系包括所述底物、所述氧化脱氢酶、所述哌啶酸还原酶、辅酶、辅酶再生系统、溶剂，所述反应体系还选择性地包括ph缓冲剂和/或ph调节剂，所述辅酶包括nad+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或nadh(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，或者，所述辅酶包括nadp+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和/或nadph(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。

根据本发明的一些优选方面，控制所述反应体系的ph值为6～9。更优选地，控制所述反应体系的ph值为7～8.5。

根据本发明的一些优选方面，控制所述反应体系中起始底物的浓度为1～20g/l。

根据本发明的一个具体且优选的方面，所述ph缓冲剂为磷酸盐，将其溶于水可以配制成磷酸盐缓冲溶液。

根据本发明的一些优选方面，所述的ph调节剂为氨水、碱金属氢氧化物或其水溶液。

根据本发明的一个具体且优选方面，所述的ph调节剂为20wt％～35wt％氨水。

根据本发明的又一具体方面，所述的ph调节剂为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述辅酶的添加量为底物浓度的1‰～1％。

根据本发明，所述辅酶再生系统包括辅酶再生酶和辅酶再生底物。

根据本发明的一些优选方面，所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶，所述辅酶再生底物为葡萄糖；或者，所述辅酶再生酶为醇脱氢酶，所述辅酶再生底物为异丙醇。根据本发明的一个具体方面，所述葡萄糖具体使用d-葡萄糖。

根据本发明的一个具体方面，所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168；和/或，所述醇脱氢酶来源于乳酸杆菌(lactobscilluskefir)dsm20587。

优选地，所述葡萄糖脱氢酶具有如seqidno.9所示的氨基酸序列。

优选地，所述醇脱氢酶具有如seqidno.10所示的氨基酸序列。

根据本发明的一些优选方面，所述反应体系还包括过氧化氢酶。

根据本发明的一些优选方面，所述过氧化氢酶为牛肝过氧化氢酶冻干粉。根据本发明的一个具体方面，所述牛肝过氧化氢酶冻干粉的酶活为4000u/mg。

根据本发明的一些优选方面，所述过氧化氢酶与所述氧化脱氢酶的酶活比为1000～2000：1。

根据本发明的一些优选方面，所述反应体系还包括黄素腺嘌呤二核苷酸。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述方法还包括分离步骤。

根据本发明，所述分离步骤包括：将反应后的反应体系的ph值调至5.0-6.0，加热使蛋白变性析出，抽滤，滤液浓缩后，冷却析晶，干燥，即得所述式(i)所示的化合物的s型异构体。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

本发明发现在哌啶酸还原酶与能够供给氢负离子的辅酶的共同存在下可高效地使亚胺酸转化得到(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，其选择性好，收率高，反应条件温和，制备得到的产物中s型异构体相对r型异构体的ee值>99％，且工艺相对简单。

附图说明

图1为实施例3中反应体系中0小时取样的底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的两个光学异构体高效液相检测图谱；

其中，保留时间8.877min为(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸；保留时间11.308min为(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸；

图2为实施例3中反应12小时取样的高效液相色谱检测图谱。

具体实施方式

本发明提供一种制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的新方法，本发明方法具有反应条件温和、立体选择性强、反应效率高、产率高等特点，具有工业化应用前景。

根据本发明的一个具体方面，该方法以外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸为底物，经多酶体系催化获得(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，所述多酶体系可由氧化脱氢酶(优选为d-氨基酸氧化酶)、过氧化氢酶、哌啶酸还原酶和辅酶(优选为nadp⁺和/或nadph)、辅酶再生系统等组成。

具体原理为：以外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸为底物，利用d-氨基酸氧化酶立体选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸进行氧化脱氢生成亚胺酸，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸基本未被催化而保留在反应体系中。反应过程中产生的过氧化氢经过氧化氢酶催化分解成水和氧气。亚胺酸被哌啶酸还原酶不对称还原为(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸。在此过程中，还原型辅酶ii即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)被氧化为nadp⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，nadp⁺经辅酶再生系统还原为nadph。

反应过程示意如下：

进一步地，优选使生成亚胺酸的反应还在黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)存在下进行，在反应过程中，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)被还原为fadh2，随后，一分子氧被还原为过氧化氢(h2o2)，而fadh2则被氧化为fad。过氧化氢在过氧化氢酶的催化下分解成水和氧气。反应过程示意如下：

作为优选，所述d-氨基酸氧化酶来源于三角酵母、禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、茄病镰刀菌。具体地，所述d-氨基酸氧化酶来源于三角酵母(trigonopsisvariabilis)cbs4095、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)cs3005、梨孢镰刀菌(fusariumpoae)2516或茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718。

作为优选，所述哌啶酸还原酶来源于恶臭假单胞菌，绿脓杆菌，荧光假单胞菌，虫媒假单胞菌。具体的，所述哌啶酸还原酶源于恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)kt2440、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)pf0-1或虫媒假单胞菌(pseudomonasentomophilastr.)l48的哌啶酸还原酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的哌啶酸还原酶。

作为优选，所述辅酶再生系统包括辅酶再生酶和辅酶再生底物，所述辅酶再生酶来源于枯草芽胞杆菌，乳酸杆菌。具体地，所述辅酶再生酶来源于枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168的葡萄糖脱氢酶，来源于乳酸杆菌(lactobscilluskefir)dsm20587的醇脱氢酶。

具体地，反应体系中，多酶体系中的酶的使用形式可以为离体酶、粗酶液，或者是纯酶，或者固定化酶，或者表达重组酶的工程菌静息细胞。

作为优选，反应体系中起始底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为1～20g/l。

作为优选，反应体系中，d-氨基酸氧化酶的添加量以4000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应液重量的1～5％。

作为优选，反应体系中，过氧化氢酶为牛肝过氧化氢酶冻干粉末，酶活为4000u/mg，过氧化氢酶与d-氨基酸氧化酶的酶活比为1000～2000：1。

作为优选，反应体系中，哌啶酸还原酶的添加量以4000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应液重量的0.1～5％。

作为优选，反应体系中，辅酶再生酶的添加量以4000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应液重量的0.1～5％。

作为优选，反应体系中，起始的辅酶可以添加氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp⁺)，其添加量为1‰～1％。

作为优选，反应体系中，反应的温度为20～70℃，时间为6～72小时，反应液的ph值为6～9；更优选，温度为30～40℃，时间为12～48小时。磷酸缓冲溶液控制反应的ph值为7～8.5。

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

本发明实施例中所用基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。e.colibl21(de3)菌种购自novagen公司；dnamarker、primestardna聚合酶、低分子量标准蛋白等分子生物学实验试剂购自takara。基因克隆及表达具体操作可参见j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明通过高效液相色谱(hplc)分析催化反应的各个产物和底物。外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的hplc分析方法为：色谱柱/zwix(-)；柱温/25℃；流速/0.5ml/min；检测波长/uv210nm；流动相：hplc级甲醇/乙腈(50/50,v/v)(加入50mm甲酸和25mm二已胺)。具体各相关物质出峰情况见图1。

实施例1基因工程菌菌种构建

1.1d-氨基酸氧化酶的筛选及表达d-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建

根据底物特异性的不同，微生物来源的d-氨基酸氧化酶可分为两大类:1)偏好底物侧链基团较小的氨基酸(如d-丙氨酸),如尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)来源的d-氨基酸氧化酶；2)偏好底物侧链基团较大的氨基酸(如d-苯丙氨酸)，如三角酵母(trigonopsisvariabilis)来源的d-氨基酸氧化酶(pollegionil,mollag,sacchis,etal.propertiesandapplicationsofmicrobiald-aminoacidoxidases:currentstateandperspectives[j].applmicrobiolbiotechnol,2008,78(1):1-16.)。分别用这两种d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列在美国国立生物技术信息中心(ncbi)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行blastp分析，选取序列一致性不同的4种d-氨基酸氧化酶作进一步研究(如表1所示)。

表1四种不同来源的d-氨基酸氧化酶

将上述d-氨基酸氧化酶基因序列经密码子优化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pet-28a(+)上。重组质粒转入表达宿主e.colibl21(de3)中，经测序验证无误后，向所得工程菌菌液中加入起始浓度为25％的甘油并置于-80℃保藏备用。

1.2表达哌啶酸还原酶的基因工程菌的构建

分别从恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)kt2440、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)pf0-1、虫媒假单胞菌(pseudomonasentomophilastr.)l48基因组中克隆哌啶酸还原酶基因(如表2所示)。

表2四种不同来源的哌啶酸还原酶

根据相应基因dna序列设计pcr上游引物和下游引物。

来源于pseudomonasputidakt2440的哌啶酸还原酶的引物：

kt2440-f：5’-cgggatccatgtccgcaccttccaccagcac-3’(bamhi)

kt2440-r：5’-cccaagctttcagccaagcagctctttcagg-3’(hindiii)

来源于pseudomonasaeruginosapao1的哌啶酸还原酶的引物：

pao1-f：5’-cgggatccgtgatccgaatgacgctggac-3’(bamhi)

pao1-r：5’-cccaagctttcactccagcaacgccagc-3’(hindiii)

来源于pseudomonasfluorescenspf0-1的哌啶酸还原酶的引物：

pf0-1-f：5’-cgggatccatgtctgcgccacacgatc-3’(bamhi)

pf0-1-r：5’-ccgctcgagttactcgccggccagttcac-3’(xhoi)

来源于pseudomonasentomophilastr.l48的哌啶酸还原酶的引物：

l48-f：5’-cgggatccgtgcgcgtagccttcaac-3’(bamhi)

l48-r：5’-cccaagctttcacctcgccagcgccttc-3’(hindiii)

在上、下游引物中分别加入限制性内切酶切位点，如下划线所示，具体限制性内切酶见引物序列括号内。分别以恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)kt2440、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)pf0-1、虫媒假单胞菌(pseudomonasentomophilastr.)l48基因组dna为模板，利用相应的上下游引物分别进行pcr扩增反应，pcr反应体系和反应条件如下：

pcr扩增体系：

pcr扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保温。

pcr扩增反应结束后，利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果显示扩增产物为单一条带，大小约为1000bp。用dna回收纯化试剂盒回收目的条带，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

表达载体pet-28a(+)和pcr扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切完成后用dna回收纯化试剂盒回收目的条带。随后，利用t4dna连接酶将双酶切后的pcr扩增产物连接到具有相对应黏性末端的表达载体pet-28a(+)上，连接体系如下表3所示：

表3重组表达质粒构建体系

将酶连产物转化至e.colidh5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落到lb液体基中培养，菌液pcr鉴定阳性转化子，并送测序公司来验证插入序列的正确性。从验证无误的阳性转化子中提取质粒，相关方法参照质粒提取试剂盒。再将重组表达载体转入表达宿主e.colibl21(de3)中，经菌液pcr和测序验证无误后，向所得工程菌菌液中加入起始浓度为25％的甘油并置于-80℃保藏备用。

1.3表达辅酶再生酶的基因工程菌的构建

分别从枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168基因组中克隆葡萄糖脱氢酶(ncbi登录号：np_388275.1，seqidno.9)基因；从乳酸杆菌(lactobacilluskefiri)dsm20587基因组中克隆醇脱氢酶(ncbi登录号：aap94029.1，seqidno.10)基因。具体方法步骤参考1.2中哌啶酸还原酶表达菌种的构建方法。相关pcr上游引物和下游引物如下：

来源于bacillussubtilis168的葡萄糖脱氢酶的引物：

bgdh-f：5’-gaagatctgatgtatccggatttaaaaggaaaagtc-3’(bglⅱ)

bgdh-r：5’-catgccatggttaaccgcggc-3’(ncoi)

来源于lactobacilluskefiridsm20587的醇脱氢酶的引物：

ladh-f：5’-ccgaattcatgaccgatcgtctgaagggc-3’(ecori)

ladh-r：5’-cccaagctttcactgtgcggtatacccgcc-3’(hindiii)。

实施例2

2.1微生物的培养

液体lb培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。若为固体lb培养基，则另加15g/l琼脂。

将含有d-氨基酸氧化酶基因的工程菌接种于5ml液体lb(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃，200rpm振荡培养8小时左右。按1％(v/v)的接种量接种于100ml液体lb(含50μg/ml卡那霉素)培养基中培养，od600达到0.6-0.8后，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(起始浓度为0.1mm)，18℃诱导15h。培养结束后，将培养液倒入100ml离心管中4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，用50mm磷酸缓冲液(ph8.0)洗涤细胞两次，放于-80℃超低温冰箱中保存，备用。

2.2粗酶液的制备

将菌体重悬于25ml磷酸缓冲液(50mm,ph值＝8.0)中，超声破碎菌悬液，离心后得到的上清为含d-氨基酸氧化酶或哌啶酸还原酶或辅酶再生酶的粗酶液。

实施例3fsdaao-ppdpka多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

按照实施例2的方法，分别制备源自茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718的d-氨基酸氧化酶粗酶液、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)kt2440的哌啶酸还原酶粗酶液以及枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168的葡萄糖脱氢酶粗酶液。

称取0.16g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸至100ml反应瓶中，加10ml磷酸缓冲液(50mm,ph＝8.0)混匀后，用30％氨水调节溶液ph值到8.0。加入20mlfsdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)，5mlppdpka粗酶液，5ml葡萄糖脱氢酶粗酶液，20mg过氧化氢酶，nadp⁺以及d-葡萄糖，使起始反应体系中底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为4g/l，nadp⁺的浓度为0.025mm，d-葡萄糖浓度为15mm。混匀后，立即取样，作为“0小时”。利用水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，氨水调节反应ph在8～8.5范围内，反应12小时取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应液中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。

检测结果如图1和图2所示，fsdaao表现出严格的r-构型立体选择性，反应液中(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的反应收率为85.7％(反应收率＝实际产物浓度(g/l)/理论产物浓度(g/l)×100％)，ee值为99.6％。

实施例4fpdaao-padpka多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

按照实施例2的方法，分别制备源自梨孢镰刀菌(fusariumpoae)2516的d-氨基酸氧化酶粗酶液、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1的哌啶酸还原酶粗酶液以及乳酸杆菌(lactobacilluskefiri)dsm20587的醇脱氢酶粗酶液。

称取0.2g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸至100ml反应瓶中，加10ml磷酸缓冲液(50mm,ph＝8.0)混匀后，用30％氨水调节溶液ph值到8.0。加入20mlfpdaao粗酶液，2mlpadpka粗酶液，8ml醇脱氢酶粗酶液，50mg过氧化氢酶，nadp⁺以及异丙醇，使起始反应体系中底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为5g/l，nadp⁺的浓度为0.03mm，异丙醇浓度为20mm。混匀后，立即取样，作为“0小时”。利用水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，反应16小时取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应液中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。反应液中(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的收率为82.1％(计算方式同实施例3)，ee值为99.4％。

实施例5fgdaao-pfdpka多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

按照实施例2的方法，分别制备源自禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)cs3005的d-氨基酸氧化酶粗酶液、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)pf0-1的哌啶酸还原酶粗酶液以及枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168的葡萄糖脱氢酶粗酶液。

称取0.1g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸至100ml反应瓶中，加10ml磷酸缓冲液(50mm,ph＝8.0)混匀后，用30％氨水调节溶液ph值到8.0。加入20mlfgdaao粗酶液，2.5mlpfdpka粗酶液，7.5ml葡萄糖脱氢酶粗酶液，20mg过氧化氢酶，nadp⁺以及d-葡萄糖，使起始反应体系中的底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为2.5g/l，nadp⁺的浓度为0.014mm，d-葡萄糖的浓度为10mm。混匀后，立即取样，作为“0小时”。利用水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，氨水调节反应ph在8～8.5范围内，反应18小时取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应液中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。反应液中(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的反应收率为79.8％(计算方式同实施例3)，ee值为99.1％。

实施例6tvdaao-pedpka多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

按照实施例2的方法，分别制备源自三角酵母(trigonopsisvariabilis)cbs4095的d-氨基酸氧化酶粗酶液、虫媒假单胞菌(pseudomonasentomophilastr.)l48的哌啶酸还原酶粗酶液以及乳酸杆菌(lactobacilluskefiri)dsm20587的醇脱氢酶粗酶液。

称取0.3g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸至100ml反应瓶中，加10ml磷酸缓冲液(50mm,ph＝8.0)混匀后，用30％氨水调节溶液ph值到8.0。加入20mltvdaao粗酶液，3mlpedpka粗酶液，7ml醇脱氢酶粗酶液，40mg过氧化氢酶，nadp⁺以及异丙醇，使起始反应体系中底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为7.5g/l，nadp⁺的浓度为0.05mm，异丙醇浓度为25mm。混匀后，立即取样，作为“0小时”。利用水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，反应48小时取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应液中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。反应液中(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的反应收率(计算方式同实施例3)为78.6％，ee值为99.2％。

实施例7纯酶fsdaao-ppdpka多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

底物溶液的配制：用50mm的磷酸盐缓冲溶液(ph＝8.0)配制5g/l外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液ph至8.0。

取1.6ml底物溶液加入到5ml反应管中，再加入fsdaao纯酶液，黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐，过氧化氢酶，ppdpka纯酶液，nadp⁺，葡萄糖脱氢酶纯酶液，以及d-葡萄糖，并用磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph＝8.0)将反应总体积补到2ml，使起始反应体系中底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为4g/l，fsdaao纯酶的起始浓度为0.1mg/ml，fad起始浓度为100μm，纯酶ppdpka的起始浓度为0.1mg/ml，葡萄糖脱氢酶纯酶的起始浓度为0.1mg/ml，nadp⁺的起始浓度为0.01mm，过氧化氢酶起始浓度为0.5mg/ml，d-葡萄糖的起始浓度为15mm。混匀后，立即取样，作为“0小时”。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应5小时。反应结束后用高效液相色谱检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应液中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的反应收率为88.3％(计算方式同实施例3)，ee值达99.5％。

实施例8fsdaao-ppdpka多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

按照实施例2的方法，分别制备源自茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718的d-氨基酸氧化酶粗酶液、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)kt2440的哌啶酸还原酶粗酶液以及枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168的葡萄糖脱氢酶粗酶液。

称取0.24g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸至100ml反应瓶中，加10ml磷酸缓冲液(50mm,ph＝8.0)混匀后，用5m氢氧化钠溶液调节溶液ph值到8.0。加入20mlfsdaao粗酶液，3mlppdpka粗酶液，7ml葡萄糖脱氢酶粗酶液，20mg过氧化氢酶，nadp⁺以及d-葡萄糖，使底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的起始浓度为6g/l，nadp⁺的起始浓度为0.04mm，d-葡萄糖起始浓度为20mm。混匀后，立即取样，作为“0小时”。利用水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，0.5m氢氧化钠溶液调节反应ph在8～8.5范围内，反应24小时取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应液中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的反应收率为84.9％(计算方式同实施例3)，ee值为99.2％。

实施例9(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的制备与分离

底物溶液及反应体系如实施例3。

反应结束后，将反应体系的ph值调至5.0-6.0。99℃水浴，待蛋白变性析出后，抽滤。取滤液于65℃条件下旋蒸，将反应体积浓缩10倍。置于冰上，冷却后，抽滤。将析出的白色晶体，小心刮下，置于烘箱中，烘干并称重。称取0.05g白色烘干晶体，用50mm磷酸盐缓冲溶液(ph＝8.0)定容至50ml，取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知分离后产品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的分离产率为75.1％(分离产率＝实际分离得到的产物的量(mg)/理论的产物的量(mg)×100％)，ee值达99.8％。

对比例1fsdaao制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

底物溶液的配制：用50mm的磷酸盐缓冲溶液(ph＝8.0)配制5g/l的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液ph至8.0。

取1.6ml底物溶液加入到5ml反应管中，再加入0.4mlfsdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)。混匀后，取样，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应24小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，即可得知反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的浓度(g/l)。

fsdaao表现出严格的r-构型立体选择性，转化率为49.9％(转化率＝[(初始外消旋底物的浓度(g/l)-残余的底物浓度(g/l))/初始外消旋底物的浓度(g/l)]×100％)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。

对比例2fsdaao-nh3·bh3制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸

底物溶液的配制：用50mm的磷酸盐缓冲溶液(ph8.0)配制5g/l外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液ph至8.0。

向100ml反应器中加入24ml底物溶液，6mlfsdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)，12mg过氧化氢酶冻干粉末和0.4gnh3·bh3。混匀后，立即取样，作为“0小时”。将反应体系置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应24小时，取样。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。fsdaao表现出严格的r-构型立体选择性，反应收率为81.2％，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值为99.2％。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州同力生物医药有限公司

<120>一种多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法

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