抗Eno1抗体及其用途的制作方法

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种抗eno1抗体。

背景技术：

真菌烯醇化酶1(enolase，eno1)又称2-磷酸-d-甘油盐水解酶，由440个氨基酸组成，烯醇化酶的基本功能是参与糖酵解反应，能催化2-磷酸甘油酸(2-pge)与磷酸烯醇式丙酮相互转化。近年来研究发现，侵袭性真菌烯醇化酶除了分布于细胞质外，还分布于侵袭性真菌细胞壁表面。eno1分子可以通过与纤溶酶原结合激活纤溶系统感染宿主。血纤维溶酶原是血纤维溶解酶的前体，存在于多数脊椎动物体内，是纤溶系统的关键成分。血纤维溶酶原在血纤维溶酶原激活蛋白(plasminogenactivator)的作用下会切去n端部分序列，转化为具有丝氨酸蛋白酶活性的血纤维溶酶(plasmin)，它能转化胶原酶原为胶原酶，然后与之一起降解纤维蛋白和其他细胞外基质比如层粘连蛋白和纤连蛋白。侵袭性真菌表面的烯醇化酶结合血纤维溶酶原后，会加速其活化为血纤维溶酶并引发一系列下游反应，这样侵袭性真菌便可以利用寄主纤溶系统降解其组织屏障，以进行组织侵染或迁移扩散。抑制真菌细胞表面eno1分子活性能够有效的抑制真菌对宿主的侵袭。有文献报道，免疫白念珠菌eno1蛋白的兔血清能够抑制白念珠菌对人肠道上皮细胞的粘附，提示eno1蛋白在白念珠菌粘附宿主上皮细胞中发挥了重要的作用。小鼠免疫白念珠菌eno1蛋白再次感染白念珠菌时，小鼠肾脏、脑组织、肺、脾载菌量显著减少。这一现象可能与th1介导的适应性免疫应答有关。综上所述，真菌eno1蛋白在致病真菌细胞内高度保守，生物学功能重要(与真菌毒力、应激反应等密切相关)；真菌细胞内定位与哺乳动物细胞不同(哺乳动物细胞eno1位于细胞浆内；真菌细胞eno1位于细胞壁表面)，基于真菌细胞壁表面eno1蛋白设计抗体药物不会对人体细胞eno1蛋白造成影响，也不会被小分子化合物药物取代(小分子化合物可透过细胞膜影响人体细胞eno1蛋白功能)；真菌eno1蛋白结构可以在感染患者体内诱导保护性抗体产生。所以，eno1蛋白是抗真菌感染抗体药物理想的作用靶点。

近年来，随着医学治疗技术的发展，比如造血干细胞移植、实体器官移植、高强度免疫抑制剂、广谱抗生素、各种置管技术的广泛使用以及重症监护病人、老龄病人、艾滋病患者的增多使得侵袭性真菌感染发病率逐年增高。侵袭性真菌感染在中国、美国及欧洲院内感染位居第4-6位。由于侵袭性真菌具有高度适应性，在体内转变成菌丝、形成生物被膜后也会高度耐药，加上新型抗真菌药物的研发及相关早期的诊断方法进展缓慢，使得侵袭性真菌感染病死率高达40％，对人类健康造成严重威胁。念珠菌血症的病死率高达40％，侵袭性曲霉菌感染未能及时诊疗的病死率高达90％以上，已经成为严重威胁人类健康的感染性疾病。

目前临床上可供选择的抗真菌药物非常有限，应用较多的仍然是唑类抗真菌药物如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等，随着在临床上的长期应用，真菌耐药现象日趋严重；有些真菌如克柔念珠菌、烟曲霉菌等先天耐药；真菌有高适应性特点，在体内形成生物被膜、转变成菌丝后也会高度耐药，甚至出现了“超级耐药”真菌的流行，耐药性也成为侵袭性真菌感染治疗失败的主要原因之一。所以研究高效的新型抗真菌药物是临床上亟待解决的问题。目前尚未有产业化针对靶向真菌eno1蛋白开发的单克隆抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种特异性结合真菌eno1蛋白的抗体或其功能片段，并基于该抗体或其功能片段提供其用途。

为实现上述目标，本发明提供了如下技术方案：

一种特异性结合真菌eno1蛋白抗体或其片段，所述抗体或其片段对真菌eno1蛋白具有特异性结合亲和力；

所述抗体包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；

其中，所述重链可变区(vh)包含以下的cdr组合：vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；

所述轻链可变区(vl)包含以下的cdr组合：vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3；

所述重链可变区为：

vh-cdr1氨基酸：gfnikdyy，

vh-cdr2氨基酸：idpengnn，

vh-cdr3氨基酸：aryegnyvsy，

所述轻链可变区为：

vl-cdr1氨基酸：qsivhsngyty，

vl-cdr2氨基酸：kvs，

vl-cdr3氨基酸：fqsshvpyt。

进一步，所述重链可变区(vh)包含选自以下的序列：与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；优选地，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。

和/或，所述轻链可变区(vl)包含选自以下的序列：与seqidno：2所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。优选地，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。

进一步，所述抗体或其片段包含选自以下的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的组合：

如seqidno：1所示的氨基酸序列或与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列的重链可变区；

和与seqidno：2所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。

进一步，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、单域抗体、完全或部分人源化抗体或者嵌合抗体中的任意一种；优选地，所述抗体为iga、igd、ige、igg或igm，更优选为igg1。

所述片段选自所述抗体的scfv、fab、f(ab′)2或fv片段。

另一方面，本发明还提供了一种核酸分子，其编码如前述抗体或其片段中的重链cdr、轻链cdr、重链可变区、轻链可变区、重链或轻链。

另一方面，本发明还提供了一种缀合物，所述缀合物包含前述的抗体或其片段。

另一方面，本发明还提供了一种载体，其包含前述的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体或噬菌体载体等。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含前述的抗体或其片段，或者核酸分子，或者缀合物，或者载体；以及任选的药学上可接受的辅料。

另一方面，本发明还提供了前述的抗体或其片段，或者前述的核酸分子，或者前述的缀合物，或者前述的载体，或者前述的药物组合物在制备用于预防或治疗真菌感染的药物中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种诊断真菌感染的方法，所述方法包括使前述的抗体或其片段，或者前述的核酸分子，或者前述的缀合物，或者前述的载体，或者前述的药物组合物与来自受试者的样品相接触。

所述真菌感染为皮肤与软组织感染、深部真菌感染或侵袭性真菌感染。

优选地，所述真菌为能够引起哺乳动物如人类感染的病原真菌，优选为念珠菌属、隐球菌属和霉菌属真菌，如白念珠菌。

优选地，还可以结合其它抗真菌药物比如唑类抗真菌药物(例如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑等)、棘白菌素类抗真菌药物(例如卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净等)、多烯类抗真菌药(例如两性霉素等)、丙烯胺类抗真菌药物(例如特比萘芬等)或嘧啶类抗真菌药物(例如5-氟胞嘧啶等)制作组合药物。

本发明由于采用以上技术方案，与现有技术相比，作为举例，具有以下的优点和积极效果：所述抗体对真菌eno1蛋白具有特异性结合亲和力，因此具有与致病真菌eno1蛋白结合并抑制真菌侵袭宿主细胞的能力，可以单独或者与现有抗真菌化学药物联合用于治疗侵袭性真菌感染。

侵袭性真菌感染大多为免疫功能低下患者，本发明作为单克隆抗体药物，从免疫调节的角度治疗真菌感染，具有独特优势。同时eno1主要位于真菌细胞壁上，而哺乳动物细胞没有细胞壁结构，并且细胞膜表面没有同源蛋白，eno1单克隆抗体药物主要靶向于真菌细胞壁抗原上，脱靶可能性极低，潜在的毒副作用小。

附图说明

图1为本发明实施例提供的融合his标签的白念珠菌eno1蛋白全长序列的重组表达。

图2为本发明实施例提供的重组白念珠菌eno1蛋白的纯化。

图3为本发明实施例提供的通过elisa方法检测抗体与eno1蛋白的结合的结果分析图。

图4为本发明实施例提供的eno1抗体抑制白念珠菌eno1蛋白活性实验结果。

图5为本发明实施例提供的念珠菌血症动物模型复制及单克隆抗体治疗作用检测结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明公开的抗eno1抗体及其用途作进一步详细说明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中，各附图所出现的相同标号代表相同的特征或者部件，可应用于不同实施例中。因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

需说明的是，对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。

实施例1：融合his标签的白念珠菌eno1蛋白c端序列的重组表达

以白念珠菌eno1蛋白c末端氨基酸为目的序列，人工合成相应的碱基序列，并利用酶切位点ndei和xhoi将其克隆至含his标签的pet-21a质粒中。将重组质粒转化至感受态细胞bl21(de3)plyss中，于次日挑取单菌落接种至含100μg/ml氨苄西林的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜。过夜培养菌液按1∶100接种至含100μg/ml氨苄西林的lb液体培养基中，200rpm于37℃振荡培养至od600约为0.6-0.8，向菌液中加入iptg至终浓度为0.5mm，于37℃诱导4.5h。取诱导后菌液，8，000rpm离心3min收集菌体，-80℃保存。融合his标签的白念珠菌eno1蛋白全长序列的重组表达参见图1所示。

eno1蛋白全长氨基酸序列：

表达白念珠菌eno1蛋白全长的碱基序列：

实施例2：重组白念珠菌eno1蛋白的纯化

将诱导表达重组白念珠菌eno1蛋白的大肠杆菌用超声破碎仪破碎，180w工作3s间歇3s，时间7-9min；13，000rpm离心30min，收集上清液，用0.22μml滤器过滤除菌；室温下将ni柱与上清液于旋转混合仪上混合1h，将ni柱装载到填料柱中；用5倍柱床体积的bd液洗脱(含咪唑浓度30mm)与ni柱非特异性结合蛋白，洗至蛋白显色液不变色，然后用5倍柱床体积的bb液(含咪唑浓度300mm)洗脱目的蛋白；将含目的蛋白的洗脱液使用10kd的浓缩管浓缩置换溶剂为pbs缓冲液。电泳图参见图2所示。

实施例3：重组白念珠菌eno1蛋白免疫balb/c小鼠

参考antibodiesalaboratorymanual，secondedition(edwarda.greenfield2012)，以14天为间隔共计42天的过程免疫8周龄balb/c小鼠。将免疫原白念珠菌eno1蛋白乳化在完全或不完全弗氏佐剂中，并且将其以单侧的方式注射于小鼠颈背部、尾根部、腹股沟3处皮下组织和腹膜腔内。在免疫第35天尾静脉采血，用elisa方法检测抗体滴度后，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。

实施例4：抗eno1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选、鉴定及抗体序列测定

取重组白念珠菌eno1蛋白免疫balb/c小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞p3x63ag8.653使用peg或者电融合方法进行融合，将融合后的杂交瘤细胞接种于96孔板中，24小时后加入含hat培养基和ht的培养基，筛选杂交瘤细胞；于96孔板中培养10-14天后，取细胞上清进行elisa实验，筛选能够分泌抗eno1抗体的杂交瘤母克隆。

将分泌抗eno1抗体的杂交瘤母克隆采用有限稀释法加入铺有饲养细胞的96孔板中，第2-3天后显微镜下观察并标记单克隆细胞，第7天后通过elisa实验筛选能够分泌抗eno1单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞。

将分泌抗eno1单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞扩大培养后，按照rnafast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)说明书步骤提取细胞总rna；利用5×primescriptrtmastermix(takara)将杂交瘤细胞总rna反转录成cdna；使用简并引物(ankekrebber.1997)和extaqpcr试剂(takara)扩增抗体轻链可变区igvl(κ)和重链可变区vh序列；利用pcrclean-upgelextraction试剂盒(macherey-nagel公司)纯化pcr扩增产物；按照pclone007simplevectorkit试剂盒(擎科生物科技有限公司)说明书将扩增pcr产物连接至t载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行dna测序获得单克隆抗体可变区序列。

实施例5：elisa方法检测抗体与eno1蛋白的结合

将真菌eno1蛋白用pbs缓冲液稀释至1μg/ml，每孔100μl包被于96孔板(microwell96f167008，thermo)4℃孵育过夜；次日取出96孔板，用pbst(含0.5％pbs)洗板，每次浸润1min后彻底甩干残余水分。样品孔中分别加入200μl的含5％bsapbst，置于37℃封闭1h；然后用pbst洗板，并甩干孔中水分。分别向96孔板中加入待测样品100μl4℃孵育过夜。取出96孔板后用pbst洗板后每孔加入二抗100μl，并置于37℃孵育1h。再用pbst洗5次，每孔加入100μlsubstratesolution(invitrogen)，于37℃孵育10min；每孔加入2n硫酸50μl终止反应后于酶标仪(multiskcinfc，thermo)450nm波长处检测吸光度。

检测结果参见图3所示。

实施例6：eno1抗体抑制白念珠菌eno1蛋白活性实验

将1ugeno1蛋白与9ug混合，放入37度孵箱孵育10分钟。分别加入试剂盒试剂(sigma公司)；enolasesubstratemix2μl，enolaseconverter2μl，enolasedeveloper2μlperoxidasesubstrate2μl用enolaseassaybuffer补足反应体系至50μl。将混合后的样品放入37度孵育2h，用多功能酶标仪读取570nm吸光光度值。

实验结果参见图4所示。

实施例7：念珠菌血症动物模型复制及单克隆抗体治疗作用检测将培养12小时处于对数生长期念珠菌，pbs缓冲液洗涤3次后，重悬于pbs缓冲溶液中，并调整菌液浓度。采用尾静脉注射的方式感染c57bl/6小鼠。将模型小鼠根据体重随机分为模型组，抗真菌小分子药物治疗组，单克隆抗体药物治疗组，抗真菌小分子药物+单克隆抗体药物治疗组；感染念珠菌2小时后，各组动物通过尾静脉给予相应药物治疗，模型组给予同等体积的pbs缓冲液。实验动物或者每天观察记录生存时间，或者感染48h后处死小鼠取肾脏、称重、匀浆、涂布于sda固体培养基上检测组织载菌量。

检测结果参见图5所示。

其他实施方案

在上面的描述中，本发明的公开内容并不旨在将其自身限于这些方面。而是，在本公开内容的目标保护范围内，各组件可以以任意数目选择性地且操作性地进行合并。另外，像“包括”以及“具有”的术语应当默认被解释为包括性的或开放性的，而不是排他性的或封闭性，除非其被明确限定为相反的含义。所有技术、科技或其他方面的术语都符合本领域技术人员所理解的含义，除非其被限定为相反的含义。在词典里找到的公共术语应当在相关技术文档的背景下不被太理想化或太不实际地解释，除非本公开内容明确将其限定成那样。本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

序列表

<110>上海嘉霈医药科技有限公司

<120>抗eno1抗体及其用途

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