本发明属于多肽提取领域，具体涉及一种鱼皮活性多肽的提取方法。
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：我国地大物博，水域辽阔，水产资源十分丰富，近几年来，随着生活水平的提高，人们对水产资源需求的多样性及实用性逐渐提高，从而促进我国水产加工业的飞速发展。但是，在水产加工业高速发展的同时会产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，这些下脚料约占原料鱼的40-50％，除了少量用来生产鱼粉和鱼饲料，大部分都被丢弃，不仅造成了资源极大的浪费，而且还会造成环境污染。因此，如何能够高效利用鱼下脚料中的营养活性物质已经引起国内外科研工作者的高度重视，其中主要的废弃物鱼皮中的胶原含量相当丰富，胶原蛋白可以占到蛋白质总含量的60-80％，而占鱼皮湿重的18％，将其作为新型的胶原蛋白资源，具有很高的开发和利用价值。鱼皮胶原蛋白不仅具有良好的理化性质，如低抗原性、优良的生物相容性、可降解性和止血功能，而且有其他一些独特的性质。迄今提取鱼皮胶原蛋白的方法可分为5类，即热水浸提法、酸法、碱法、盐法及酶法。鱼皮胶原多肽具有多方面的生理功能，蛋白质消化吸收率几乎达100％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，促进ca2+吸收和降低血清中胆固醇含量等。现有技术如授权公告号为cn108531534a的中国发明专利，公开了小分子鱼皮多肽的制备方法：先将鱼皮进行脱脂除杂蛋白处理，然后使用浸泡剂溶胀后添加复合酶进行酶解，酶解过程中控制温度、时间及ph，酶解结束后，沸水浴灭酶活，离心后所得上清液即为鱼皮多肽水解液，之后对鱼皮多肽水解液进行脱色脱腥处理，最后对鱼皮多肽水解液超滤纯化，低温冷冻，真空干燥得到小分子鱼皮多肽成品；该发明中获得的小分子鱼皮多肽，其分子量、组成、活性等未知，不利于其进一步应用于化妆品、保健食品、医药等领域。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种纯度高、分子量低、抗氧化能力强的鱼皮活性多肽的提取方法，该提取方法简单、环保、高效，提取所得鱼皮活性多肽分子量低易于吸收，具有较强的抗氧化活性，因而可将其应用于制备化妆品、食品、医药中的抗氧化物质。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种鱼皮活性多肽的提取方法，具体包括以下步骤：脱脂处理：将鱼皮在无菌情况下，用组织剪机械剪碎成1×1cm的组织块，浸于乙二醇:乙醚＝1-3:1(v/v)溶液中，料液比为1:10-25，于5-30℃下脱脂处理12-48h，连续低速搅拌；脂肪会使胶原多肽溶液成乳浊液，影响胶原的色泽、透明度、亲水性能等，不利于后续提取分离工序的进行；去杂蛋白：将经过脱脂处理的鱼皮置于0.05-0.2mnaoh中连续低速搅拌，于5-20℃去杂12-24h，水洗至中性，置于2-3.5％nacl中盐析12-24h，蒸馏水透析，取沉淀冷冻干燥得鱼皮胶原粉末；利用胶原蛋白和非胶原蛋白的分子结构的差异，获得高纯度的胶原蛋白；多肽提取：取鱼皮胶原粉末，采用中性蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1(u/u)作为水解酶，在ph为6-8、温度35-50℃下持续震荡水解2-10小时，酶解结束，待冷却后加入正己烷萃取5-10min，4000-8000r/min离心，收集水解液，浓缩、冷冻干燥得鱼皮胶原多肽粉末；采用复合酶解特定酶切肽链，获得更多低分子量多肽，易于被吸收利用；抗氧化胶原多肽纯化：取鱼皮胶原多肽粉末，采用胃蛋白酶作为水解酶，在ph为6-8、温度25-50℃下持续震荡水解3-5小时，水解液经离心、去沉淀、真空浓缩、喷雾干燥得粗提取胶原多肽；粗提取胶原多肽经凝胶色谱柱层析柱分离纯化得抗氧化胶原多肽；采用二次酶解，获得具有抗氧化活性相关的氨基酸片段，可获得纯度高的抗氧化胶原多肽。作为优选，去杂蛋白用naoh溶液中溶有0.05-0.1％含量的1,2-二苯基乙二胺和0.001-0.01％含量的氨基脲；1,2-二苯基乙二胺和氨基脲有助于提高杂蛋白的溶出率和降低胶原蛋白的损失率，这是因为，二者共同破坏杂蛋白分子链结构的氢键作用，使杂蛋白发生变性和交联，而对于胶原蛋白的无论是[α1(ⅰ)]2α2(ⅰ)结构或是α1(ⅰ)α2(ⅰ)α3(ⅰ)结构，α链间的氢键作用稳定，这可能是因为胶原蛋白中羟脯氨酸对其产生了抑制作用。作为优选，先将鱼皮胶原粉末溶于含有0.5-1％的月桂醇聚氧乙烯醚和0.1-0.6％的水杨酰胺水溶液中，反应3-5min，再进行酶解反应；月桂醇聚氧乙烯醚和水杨酰胺一是能够使反应底物和酶剂迅速形成均相体系，增加单位时间内胶原蛋白与酶接触位点，提高酶解速率；二是易于使胶原蛋白特定化学键位点形成暴露，提高酶解效率。作为优选，中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶用量为1000-5000u/g；胃蛋白酶的酶用量为2000-3000u/g。作为优选，经凝胶色谱柱层析柱分离纯化所得的抗氧化胶原多肽用于制备化妆品、食品、医药中抗氧化物质的用途。本发明的有益效果为：1)本发明采用复合酶解及二次酶解获得高纯度、低分子量的鱼皮抗氧化胶原多肽，提取方法简单、环保，高效，提取获得的鱼皮活性多肽易于吸收，具有较强的抗氧化活性，可广泛应用于制备化妆品、食品、医药中的抗氧化物质；2)本发明利用naoh溶液中溶有的1,2-二苯基乙二胺和氨基脲协同去除杂蛋白，归因于1,2-二苯基乙二胺和氨基脲能够提高杂蛋白的溶出率和降低胶原蛋白的损失率；这是因为，二者共同破坏杂蛋白分子链结构的氢键作用，使杂蛋白发生变性和交联，而对于胶原蛋白的无论是[α1(ⅰ)]2α2(ⅰ)结构或是α1(ⅰ)α2(ⅰ)α3(ⅰ)结构，α链间的氢键作用稳定，这可能是因为胶原蛋白中羟脯氨酸对其产生了抑制作用；3)本发明利用月桂醇聚氧乙烯醚和水杨酰胺水溶液对鱼皮胶原粉末进行预处理再酶解；月桂醇聚氧乙烯醚和水杨酰胺一是能够使反应底物和酶剂迅速形成均相体系，增加单位时间内胶原蛋白与酶接触位点，提高酶解速率；二是易于使胶原蛋白特定化学键位点形成暴露，提高酶解效率。本发明采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：所用鱼皮来自鮟鱇鱼。实施例1：一种鱼皮活性多肽的提取方法，具体包括以下步骤：(1)脱脂处理：将鱼皮在无菌情况下，用组织剪机械剪碎成1×1cm的组织块，浸于乙二醇:乙醚＝1:1(v/v)溶液中，料液比为1:10，于15℃下脱脂处理12h，连续低速搅拌(150r/min)；脂肪会使胶原多肽溶液成乳浊液，影响胶原的色泽、透明度、亲水性能等，不利于后续提取分离工序的进行；(2)去杂蛋白：将经过脱脂处理的鱼皮置于0.05mnaoh中连续低速搅拌(150r/min)，于10℃去杂12h，水洗至中性，置于2％nacl中盐析12h，蒸馏水透析，取沉淀冷冻干燥得鱼皮胶原粉末；利用胶原蛋白和非胶原蛋白的分子结构的差异，获得高纯度的胶原蛋白；其中，naoh溶液中溶有0.05％含量的1,2-二苯基乙二胺和0.001％含量的氨基脲；1,2-二苯基乙二胺和氨基脲有助于提高杂蛋白的溶出率和降低胶原蛋白的损失率，这是因为，二者共同破坏杂蛋白分子链结构的氢键作用，使杂蛋白发生变性和交联，而对于胶原蛋白的无论是[α1(ⅰ)]2α2(ⅰ)结构或是α1(ⅰ)α2(ⅰ)α3(ⅰ)结构，α链间的氢键作用稳定，这可能是因为胶原蛋白中羟脯氨酸对其产生了抑制作用；(3)多肽提取：取鱼皮胶原粉末，溶于含有0.5％的月桂醇聚氧乙烯醚和0.1％的水杨酰胺水溶液中，反应3min后进行酶解反应；采用中性蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1(u/u)作为水解酶，酶用量为1000u/g，在ph为6、温度35℃下持续震荡水解3小时，酶解结束，待冷却后加入正己烷萃取5min，4000r/min离心，收集水解液，浓缩、冷冻干燥得鱼皮胶原多肽粉末；采用复合酶解特定酶切肽链，获得更多低分子量多肽，易于被吸收利用；月桂醇聚氧乙烯醚和水杨酰胺一是能够使反应底物和酶剂迅速形成均相体系，增加单位时间内胶原蛋白与酶接触位点，提高酶解速率；二是易于使胶原蛋白特定化学键位点形成暴露，提高酶解效率；(4)抗氧化胶原多肽纯化：取鱼皮胶原多肽粉末，采用胃蛋白酶作为水解酶，酶用量为2000u/g，在ph为6、温度25℃下持续震荡水解3小时，水解液经离心、去沉淀、真空浓缩、喷雾干燥得粗提取胶原多肽；粗提取胶原多肽经凝胶色谱柱层析柱分离纯化得抗氧化胶原多肽；采用二次酶解，获得具有抗氧化活性相关的氨基酸片段，可获得纯度高的抗氧化胶原多肽。实施例2：一种鱼皮活性多肽的提取方法，具体包括以下步骤：(1)脱脂处理：将鱼皮在无菌情况下，用组织剪机械剪碎成1×1cm的组织块，浸于乙二醇:乙醚＝2.5:1(v/v)溶液中，料液比为1:18，于26℃下脱脂处理24h，连续低速搅拌(150r/min)；脂肪会使胶原多肽溶液成乳浊液，影响胶原的色泽、透明度、亲水性能等，不利于后续提取分离工序的进行；(2)去杂蛋白：将经过脱脂处理的鱼皮置于0.15mnaoh中连续低速搅拌(150r/min)，于18℃去杂20h，水洗至中性，置于2.5％nacl中盐析15h，蒸馏水透析，取沉淀冷冻干燥得鱼皮胶原粉末；利用胶原蛋白和非胶原蛋白的分子结构的差异，获得高纯度的胶原蛋白；其中，naoh溶液中溶有0.06％含量的1,2-二苯基乙二胺和0.003％含量的氨基脲；1,2-二苯基乙二胺和氨基脲有助于提高杂蛋白的溶出率和降低胶原蛋白的损失率，这是因为，二者共同破坏杂蛋白分子链结构的氢键作用，使杂蛋白发生变性和交联，而对于胶原蛋白的无论是[α1(ⅰ)]2α2(ⅰ)结构或是α1(ⅰ)α2(ⅰ)α3(ⅰ)结构，α链间的氢键作用稳定，这可能是因为胶原蛋白中羟脯氨酸对其产生了抑制作用；(3)多肽提取：取鱼皮胶原粉末，溶于含有0.7％的月桂醇聚氧乙烯醚和0.45％的水杨酰胺水溶液中，反应5min后进行酶解反应；采用中性蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1(u/u)作为水解酶，酶用量为3000u/g，在ph为7、温度38℃下持续震荡水解5小时，酶解结束，待冷却后加入正己烷萃取8min，6000r/min离心，收集水解液，浓缩、冷冻干燥得鱼皮胶原多肽粉末；采用复合酶解特定酶切肽链，获得更多低分子量多肽，易于被吸收利用；月桂醇聚氧乙烯醚和水杨酰胺一是能够使反应底物和酶剂迅速形成均相体系，增加单位时间内胶原蛋白与酶接触位点，提高酶解速率；二是易于使胶原蛋白特定化学键位点形成暴露，提高酶解效率；(4)抗氧化胶原多肽纯化：取鱼皮胶原多肽粉末，采用胃蛋白酶作为水解酶，酶用量为2000u/g，在ph为6.5、温度30℃下持续震荡水解4小时，水解液经离心、去沉淀、真空浓缩、喷雾干燥得粗提取胶原多肽；粗提取胶原多肽经凝胶色谱柱层析柱分离纯化得抗氧化胶原多肽；采用二次酶解，获得具有抗氧化活性相关的氨基酸片段，可获得纯度高的抗氧化胶原多肽。实施例3：对鮟鱇鱼鱼皮的成分分析得：鮟鱇鱼鱼皮水分/％总蛋白/％胶原蛋白/％脂肪/％灰分/％湿基72.3624.3921.271.140.73干基-87.1963.627.695.32由上表可知，鱼皮中胶原蛋白丰富，是很好的胶原蛋提取来源，因而也为胶原活性多肽的提取提供了来源。采用液质联用测定提取获得的胶原多肽的分子量，其中，胶原多肽的分子量集中在600-3000da，抗氧化胶原多肽的分子量则集中在1000-2000da；即采用本发明提取方法获得的鱼皮活性多肽分子量较低，易于被吸收利用。采用氨基酸分析仪对胶原多肽的氨基酸种类进行分析，统计得：甘氨酸占38.6％，脯氨酸和羟脯氨酸占15.7％，依次还有丙氨酸、谷氨酸、精氨酸等；这些氨基酸与可能与其抗氧化活性有关。其中，利用凝胶色谱柱层析柱分离纯化获得抗氧化胶原多肽的过程为：取粗提取胶原多肽80mg溶于2ml蒸馏水中，上葡聚糖g-25凝胶柱洗脱液为蒸馏水，洗脱速度为0.8ml/min，4mlep管收集洗脱液，200-300nm检测吸光度；收集组分，测定其dpph清除能力；将dpph清除能力高的组分(c组分)40mg溶于2ml蒸馏水中，上葡聚糖g-10凝胶柱洗脱液为蒸馏水，洗脱速度为0.4ml/min，4mlep管收集洗脱液，200-300nm检测吸光度；收集组分，测定其dpph清除能力；将dpph清除能力高的组分(c2组分)1mg进行高效液相色谱分离；将c2溶于1ml0.1％tfa溶液中，吸取20μl，注入到zorbaxsb-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)中；用乙腈线性洗脱(0-15min，5-50％；15-40min，50-100％)，洗脱速度1ml/min，200-300nm检测吸光度。采用同样方法获得羟基清除能力和超氧根清除能力较强的多肽组分。其中，dpph清除能力测定方法为：采用dpph·酶标仪法，加不同浓度的样品溶液100μl和1mmo1/l的dpph·甲醇溶液100μl于96孔酶标板中，振荡30s，37℃保温20min后在517nm波长下测定。每个样品平行测定3次。按下式计算：dpph·清除率(％)＝[1-(ap-ac)/amax]×100式中：ap为样品与1mmol/mldpph·反应后的吸光值；ac为不加dpph·时样品的吸光值；amax为加dpph·但不加样品(以80％甲醇代替样品)的吸光值。羟基清除能力测定方法为：取0.025mol/lph为7.4的磷酸缓冲液1ml，40μg/ml的番红花红1ml，供试样品0.5ml，3％过氧化氢1ml(新鲜配制)，0.945mmol/ledta-fe(ⅱ)1ml(新鲜配制)，混合后37℃水浴中反应30min后，520nm处测定吸光度。空白组以0.5ml蒸馏水代替供试样品，对照组以1.5ml蒸馏水代替edta-fe(ⅱ)和供试样品，按下式计算清除率：·oh清除率(％)＝(a样品-a空白)/(a对照-a空白)×100式中：a样品、a空白、a对照分别为样品、空白和对照的吸光值。超氧根清除能力测定方法为：采用邻苯三酚自氧化法，邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化，生成有色中间产物和o-2·，o-2·对自氧化有催化作用。具体操作：取0.05mol/lph为8.2的tris-hcl缓冲液4.5ml，置25℃水浴预热20min，加0.1ml不同浓度的样品，2.5mmol/l邻苯三酚0.4ml，混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用维生素c溶液终止反应，测a299nm值。以蒸馏水代替样品做空白组，按下式计算清除率并求得ic50。o-2·清除率(％)＝(a空白-a样品)/(a空白)×100式中：a样品、a空白分别为样品和空白的吸光值。当采用上述方法，测定样品浓度为10mg/ml时，其dpph清除率、羟基清除率和超氧根清除率分别为78.86％、81.35％和54.73％，即本发明提取的鱼皮胶原多肽具有较强的抗氧化活性，可用于制备化妆品、食品、医药中的抗氧化物质。对比例1：去杂蛋白用naoh溶液中不含1,2-二苯基乙二胺和氨基脲；其余部分和实施例2完全一致。对比例2：鱼皮胶原粉末进行酶解之前，未利用月桂醇聚氧乙烯醚和水杨酰胺水溶液对其预处理；其余部分和实施例2完全一致。上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。当前第1页12