用于检测碳青霉烯类耐药基因NDM1-24亚型的LAMP引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型的lamp引物组合及其应用。

背景技术：

抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物。近年来，感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，随着抗生素使用量的加大，细菌耐药的情况也越发严重。抗生素种类繁多，作用机制多样。

碳青霉烯类抗菌药物如亚胺培南、美罗培南等具有抗菌谱广、抗菌作用强、对多种β-内酰胺酶高度稳定的特点，尤其在治疗耐药革兰阴性菌感染中具有极其重要的地位。但近年来铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药率迅速上升。2009年，英国卡迪夫大学timothyr.walsh教授研究团队在肺炎克雷伯杆菌中首次发现了一种新型金属β-内酰胺酶，该酶可以水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类药物，介导菌株对碳青霉烯类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素的耐受。由于该菌株分离自曾在印度首都新德里接受治疗的患者，于是研究者将这一新型金属β-内酰胺酶命名为新德里金属β-内酰胺酶(newdelhimetallo-β-lactamase1)，即ndm-1，同时以blandm-1命名编码ndm-1的基因，携带有blandm-1基因的菌株被称为“ndm超级耐药菌”。因此，“ndm超级耐药菌”并不是一种细菌，而是指一类细菌。任何一种细菌在获得能表达blandm-1基因后，可以使碳氢霉烯类和其他滭内胺抗生素如青霉素失去功效。含有ndm基因的细菌通常会对多种抗菌药物呈抗药性，限制治疗方法，并导致严重的临床感染，难以治理给临床感染治疗带来很大困难。

常见检测细菌耐药基因的方法主要有：聚合酶链式反应、pcr-限制性片段长度多态性分析、pcr-单链构象多态性分析、生物芯片技术、自动dna测序等。传统的基因鉴定方法为pcr法和dna测序法，其中传统的pcr法检测周期较长，通常需要3-4个小时；sangerdna测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。

环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的bstdna聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。lamp针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的dna聚合酶在恒定温度下不断复制扩增dna。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。

lamp具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展lamp试剂盒的应用推广。lamp技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

公开号为cn102242210a的中国专利申请公开了环介导等温扩增超级细菌ndm-1基因的引物及检测超级细菌ndm-1基因的试剂盒及检测方法，公开号为cn102242197a的中国专利申请公开了用于检测ndm-1基因的lamp试剂盒及其专用引物，公开号为cn103614465a的中国专利申请公开了用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的lamp引物、试剂盒及其检测方法。然而，这些方法均为ndm-1的检测。目前，尚未见使用环介导等温核酸扩增技术检测碳青霉烯类耐药基因ndm所有亚型(已知的1-24亚型)的报道，更无合适高效的引物用于该领域的lamp检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型的lamp引物组合及其应用。所述引物组合可对碳青霉烯类耐药基因ndm的1-24亚型实现高覆盖检测。

本发明首先提供了用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型的lamp引物组合，所述引物组合由外引物-f3、外引物-b3、内引物-fip、内引物-bip、环引物-lf和环引物-lb组成，

所述外引物-f3为如下(a1)或(a2)：

(a1)如seqidno.1所示的单链dna分子；

(a2)含有(a1)的dna分子；

所述外引物-b3为如下(a3)或(a4)：

(a3)如seqidno.2所示的单链dna分子；

(a4)含有(a3)的dna分子；

所述内引物-fip为如下(a5)或(a6)：

(a5)如seqidno.3所示的单链dna分子；

(a6)含有(a5)的dna分子；

所述内引物-bip为如下(a7)或(a8)：

(a7)如seqidno.4所示的单链dna分子；

(a8)含有(a7)的dna分子；

所述环引物-lf为如下(a9)或(a10)：

(a9)如seqidno.5所示的单链dna分子；

(a10)含有(a9)的dna分子；

所述环引物-lb为如下(a11)或(a12)：

(a11)如seqidno.6所示的单链dna分子；

(a12)含有(a11)的dna分子。

所述引物是针对ncbi数据库中提供的ndm基因的压缩序列进行设计的。通过文献调研，本发明从ncbi数据库中搜集不同亚型的ndm耐药基因序列，将下载下来的ndm耐药基因的全长序列使用bioedit软件进行比对，之后在选项中选择‘createconsensussequence’选项，生成consensussequence序列，此序列即为压缩序列。从压缩序列中选取最保守的一段区域(即为所有亚型共有的保守区域，只有在共有的保守区域设计引物，才能保证设计的lamp引物可以完全覆盖1-24亚型。)，再根据此保守区域进行lamp引物的设计。因为lamp引物设计没有比较好的软件，因此本发明针对上述分析得到的代表性基因序列区段，通过人工设计多套引物组合，然后进行引物组合的筛选和修改优化等一系列工作，得到灵敏度、重复性和特异性都达到最好水平的引物组合，其对碳青霉烯类耐药基因ndm具有极高的特异性和灵敏度。

在上述基础上，含有本发明所述引物组合的试剂和试剂盒也属于本发明的保护范围。相应的，使用本发明所述引物组合、所述试剂和所述试剂盒进行的应用，也属于本发明的保护范围。

作为优选，所述引物组合中，外引物-f3、外引物-b3、内引物-fip、内引物-bip、环引物-lf和环引物-lb的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。

进一步地，所述试剂或试剂盒中，需将所述引物组合中的各条引物单独包装。

更为具体地，所述试剂或试剂盒的用途包括但不限于：

(1)鉴定碳青霉烯类耐药基因ndm；

(2)用于检测待测样本中是否含有碳青霉烯类耐药基因ndm；

(3)用于检测待测微生物是否为碳青霉烯类耐药微生物。

本发明进一步提供了所述引物组合在检测待测样本中是否含有碳青霉烯类耐药基因ndm中的应用。

所述应用具体可表现为一种检测待测样本中是否含有碳青霉烯类耐药基因ndm的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，根据扩增结果判断待测样本中是否含有碳青霉烯类耐药基因ndm。

判断时，如果采用所述引物组合可以实现以所述总dna为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有多碳青霉烯类耐药基因ndm；如果采用所述引物组合不可以实现以所述总dna为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有碳青霉烯类耐药基因ndm。

本发明进一步提供了所述引物组合在检测待测微生物是否为碳青霉烯类耐药微生物中的应用。

所述应用具体可表现为一种检测待测微生物是否为碳青霉烯类耐药微生物的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测微生物的基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，采用所述的引物组合进行环介导等温扩增，根据扩增结果判断待测微生物是否为碳青霉烯类耐药微生物。

判断时，如果采用所述引物组合可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为碳青霉烯类耐药基因ndm；如果采用所述引物组合不可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，待测菌不为或候选不为碳青霉烯类耐药基因ndm。

作为优选，前述两种方法中，所述环介导等温扩增的反应条件为65℃恒温50min。

前述两种方法中，所述待测样本可为微生物、含ndm耐药基因的质粒、痰液、肺泡灌洗液和口腔拭子等，所述待测微生物可为肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等。

上文中，所述实现环介导等温扩增具体可体现为：在利用荧光定量pcr进行检测时可出现环介导等温扩增曲线。所述环介导等温扩增曲线可为为典型的“s型”扩增曲线。

利用本发明提供的lamp引物组合检测碳青霉烯类耐药基因ndm，具有准确率高、特异性好、检测时间短、结果可实时观测的特点，从样品处理到报告结果只需1.5h的快速简便且后期可能用于现场实时检测。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

附图说明

图1为实施例2中引物组合的特异性实验结果。

图2为实施例3中引物组合的灵敏度实验结果；其中，(a)为1000拷贝/反应、(b)为100拷贝/反应、(c)为10拷贝/反应；每个浓度下重复20次。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

dna拷贝数的计算方法如下：

1a260吸光度值＝dsdna50μg/ml；

核酸浓度＝(od260)×(稀释倍数)×(50)＝xng/μl；

平均分子量(mw)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

摩尔＝6.02×10²³；

平均分子量(mw):dsdna＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；

拷贝数计算公式:(6.02×10²³copies/摩尔)×(xng/μl×10^-9)/(dna长度×660)＝copies/μl。

下述实施例中的含耐药基因ndm1-24亚型保守片段的基因质粒，其制备方法为：将puc57质粒的mcs区间的dna片段替换为：ccgctcaaggtattttaccccggccccggccacaccagtgacaatatcaccgttgggatcgacggcaccgacatcgcttttggtggctgcctgatcaaggacagcaaggccaagtcgctcggcaatctcggtgatgccgacactgagcactacgccgcgtcagygcgcgcgtttggtgcggcgttccccaaggccagcatgatcgtgatgagccattccgcccccgatagccgcgccgcaatcactcatacggcccgcatggccgacaagctgcgctga。

上述序列为所有亚型(ndm1-24亚型)压缩成的保守核苷酸序列dna分子，得到的重组质粒即为含耐药基因ndm1-24亚型共有保守片段的质粒。puc57质粒为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。

所有引物的合成由上海生工公司完成。

反应缓冲液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为cp.440020。

实施例1引物组合的筛选制备

1、针对碳青霉烯类耐药基因ndm，设计用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm引物组合如下(5’→3’)：

外引物-f3：atcaccgttgggatcga；

外引物-b3：ccgtatgagtgattgcgg；

内引物-fip：tgctcagtgtcggcatcattttggtggctgcctgatc；

内引物-bip：gcgtttggtgcggcgttctatcgggggcggaatgg；

环引物-lf：cgagattgccgagcgactt；

环引物-lb：aaggccagcatgatcgtgat。

上述的引物组合中，各单链dna均各自独立包装。

上述的引物组合中，引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb的摩尔比均为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。

2、以碳青霉烯类耐药基因ndm检测基因质粒dna为模板，采用步骤1制备的引物组合对模板进行环介导等温扩增检测。

含耐药基因ndm检测基因质粒：将puc57质粒的mcs区间的dna片段替换为genebank号为fn396876.1的核苷酸序列所示的dna分子，得到的重组质粒即为含耐药基因ndm的质粒。

反应体系(10μl)：5μl反应液(博奥生物集团有限公司产品，产品目录号：cp.440020)、1.09μl引物混合物、2μl模板dna(5pg-50pg)，补水至10μl。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，引物f3和引物b3的终浓度均为0.3μm，引物fip和引物bip的终浓度均为2.4μm，引物lf和引物lb的终浓度均为1μm。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

每个反应体系设置3次重复。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“s型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“s型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

实施例2引物组合的特异性实验

待测样本1：含碳青霉烯类耐药基因ndm-1亚型的质粒dna。

待测样本2：含碳青霉烯类耐药基因ndm-2亚型的质粒dna。

待测样本3：含碳青霉烯类耐药基因ndm-3亚型的质粒dna。

待测样本4：含碳青霉烯类耐药基因ndm-4亚型的质粒dna。

待测样本5：含碳青霉烯类耐药基因ndm-5亚型的质粒dna。

待测样本6：含碳青霉烯类耐药基因ndm-6亚型的质粒dna。

待测样本7：含碳青霉烯类耐药基因ndm-7亚型的质粒dna。

待测样本8：含碳青霉烯类耐药基因ndm-8亚型的质粒dna。

待测样本9：含碳青霉烯类耐药基因ndm-9亚型的质粒dna。

待测样本10：含碳青霉烯类耐药基因ndm-10亚型的质粒dna。

待测样本11：含碳青霉烯类耐药基因ndm-11亚型的质粒dna。

待测样本12：含碳青霉烯类耐药基因ndm-12亚型的质粒dna。

待测样本13：含碳青霉烯类耐药基因ndm-13亚型的质粒dna。

待测样本14：含碳青霉烯类耐药基因ndm-14亚型的质粒dna。

待测样本15：含碳青霉烯类耐药基因ndm-15亚型的质粒dna。

待测样本16：含碳青霉烯类耐药基因ndm-16亚型的质粒dna。

待测样本17：含碳青霉烯类耐药基因ndm-17亚型的质粒dna。

待测样本18：含碳青霉烯类耐药基因ndm-18亚型的质粒dna。

待测样本19：含碳青霉烯类耐药基因ndm-19亚型的质粒dna。

待测样本20：含碳青霉烯类耐药基因ndm-20亚型的质粒dna。

待测样本21：含碳青霉烯类耐药基因ndm-21亚型的质粒dna。

待测样本22：含碳青霉烯类耐药基因ndm-22亚型的质粒dna。

待测样本23：含碳青霉烯类耐药基因ndm-23亚型的质粒dna。

待测样本24：含碳青霉烯类耐药基因ndm-24亚型的质粒dna。

待测样本25：肺炎克雷伯菌。

待测样本26：大肠埃希氏菌。

待测样本27：铜绿假单胞菌。

待测样本28：鲍曼不动杆菌。

上述待测样本中：

含碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型的质粒dna、均为生工生物公司合成。肺炎克雷伯菌atcc10031和大肠埃希氏菌atcc25922均保藏于美国模式培养物集存库(简称atcc，地址：americantypeculturecollection(atcc)10801universityboulevardmanassas，va20110usa)，公众可从美国模式培养物集存库获得菌株。

铜绿假单胞菌cmcc10104保藏于中国医学细菌保藏管理中心(简称cmcc，地址：北京市大兴区生物医药产业基地华佗路31号院)，公众可从中国医学细菌保藏管理中心获得菌株。

鲍曼不动杆菌cicc22933保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称cmcc，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼)，公众可从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得菌株。

各个待测样本分别进行如下步骤：

1、提取待测样本的基因组\质粒dna。

2、以步骤1提取的基因组\质粒dna为模板，采用实施例1制备的引物组ⅰ进行环介导等温扩增。

反应体系(20μl)：由10μl2×反应缓冲液(博奥生物集团有限公司)、2μl待测样本的基因组dna(在50pg-50ng之间)、0.12μl外引物f3水溶液、0.12μl外引物b3水溶液、0.96μl内引物fip水溶液、0.96μl内引物bip水溶液、0.4μl环引物lf水溶液、0.4μl环引物lb水溶液和6.04μl无菌水。反应体系中，外引物f3和外引物b3的终浓度均为0.3μm，内引物fip和内引物bip的终浓度均为2.4μm，环引物lf和环引物lb的终浓度均为1μm。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制扩增曲线。

按照上述方法，将待测样本的基因组dna替换为灭菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。

采用引物组合的结果见图1。只有当待测样本为1-24的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“s型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本25、26、27、28的时候均不显示阳性扩增曲线。

以上结果表明，本发明提供的引物组ⅰ对其靶标基因具有很高的特异性。

实施例3引物组合的灵敏度实验

待测样本1：含碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型的质粒dna。

lb液体培养基：胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、水100ml。灭菌121℃20min。

100mg/ml氨苄青霉素：北京全式金生物公司的产品。

各个待测样本分别进行如下步骤：

1、将待测样品的菌液(上海生工合成)接种于含100mg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基(浓度比为1:1000)中，37℃培养16h，得到培养菌液。

2、取步骤1得到的培养菌液，提取质粒dna，采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定dna浓度及纯度。

使用invitrogenqubit2.0荧光定量仪及invitrogenqubit定量检测试剂盒对质粒dna进行定量，并通过公式计算拷贝数，对质粒dna进行梯度稀释。

3、以步骤2得到的稀释液为模板，采用实施例1制备的引物组合i进行环介导等温扩增。

反应体系(20μl)：由10μl2×反应缓冲液(博奥生物集团有限公司)、1μl质粒dna稀释液(1μl稀释液中含有的基因组拷贝数为1000个、100个和10个)、0.12μl外引物f3水溶液、0.12μl外引物b3水溶液、0.96μl内引物fip水溶液、0.96μl内引物bip水溶液、0.4μl环引物lf水溶液、0.4μl环引物lb水溶液和7.04μl无菌水。反应体系中，外引物f3和外引物b3的终浓度均为0.3μm，内引物fip和内引物bip的终浓度均为2.4μm，环引物lf和环引物lb的终浓度均为1μm。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制扩增曲线。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“s型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

引物组合检测靶标菌(即碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型)的灵敏度为100个拷贝数/反应体系(见图2)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>博奥生物集团有限公司，北京大学人民医院

<120>用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm1-24亚型的lamp引物组合及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atcaccgttgggatcga17

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccgtatgagtgattgcgg18

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgctcagtgtcggcatcattttggtggctgcctgatc37

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcgtttggtgcggcgttctatcgggggcggaatgg35

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgagattgccgagcgactt19

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aaggccagcatgatcgtgat20

<210>7

<211>279

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ccgctcaaggtattttaccccggccccggccacaccagtgacaatatcaccgttgggatc60

gacggcaccgacatcgcttttggtggctgcctgatcaaggacagcaaggccaagtcgctc120

ggcaatctcggtgatgccgacactgagcactacgccgcgtcagygcgcgcgtttggtgcg180

gcgttccccaaggccagcatgatcgtgatgagccattccgcccccgatagccgcgccgca240

atcactcatacggcccgcatggccgacaagctgcgctga279