一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法与流程

本发明的技术方案涉及细菌，具体地说是一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法。

背景技术：

甘露醇(mannitol)是一种己六醇，在医药领域、食品领域和塑料领域均得到广泛的应用。

目前，世界上工业生产甘露醇主要有二种工艺。第一种是海藻提取法：提取1吨甘露醇约需13～15吨干海带，在生产海藻酸盐的同时，将提碘后的海带浸泡液，经多次提取浓缩、除去杂质、离子交换、蒸发浓缩、冷却结晶而得；生产过程产生大量废水，能耗高，污染严重，收率低。第二种是催化加氢法：以蔗糖或葡萄糖为原料，通过水解、差向异构与酶异构，然后加氢而得；原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，但是其产率较低，且有山梨醇伴生。

实验室生产甘露醇的方法还有二种。一是酶转化法，酶法氢化须要在体系中加入价格昂贵的辅酶，不经济。二是微生物发酵法，自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。在乳酸细菌转化甘露醇的过程中，甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不产生其它多元醇等副产物，因而易于纯化分离及精制，并且条件温和、转化率较高。

很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；明串珠菌的染色体基因组只有2m左右，故发酵周期只有20小时左右；明串珠菌是耐氧的，故发酵过程中不需要提供氧气；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比较大。

cn201711169481.9公开了一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该明串珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶和d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并敲入甘露醇脱氢酶基因、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并敲入甘露醇脱氢酶基因、果糖激酶基因敲除并敲入甘露醇脱氢酶基因的肠膜明串珠菌突变菌株，虽然比初始菌株提高了产量，但是应用中蔗糖底物的质量仅为20g，还是比较低，不足以应用于生产中。

总之，现有的明串珠菌发酵技术中，以蔗糖为底物产甘露醇的产量仍不够高，还需进一步提高。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该肠膜明串珠菌突变菌株是以现有的保藏号为cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)菌株为出发菌，采用分子生物学技术敲除乙醛脱氢酶编码基因并敲入药物外排转运蛋白编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和敲除乙醛脱氢酶编码基因并敲入药物外排转运蛋白编码基因的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是cctccm2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产量仍不够高的缺陷。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和敲除乙醛脱氢酶编码基因并敲入药物外排转运蛋白编码基因的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccno：m2018814，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。

一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株以重量百分比1％转接到mrs培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到53.7克/升，甘露醇的产率为97.6％。

上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所述mrs培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖110克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、k2hpo42克、mnso4·h2o0.039克和水1000毫升用乙酸调ph到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到mrs培养基。

上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所涉及的原料、试剂和仪器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领域技术人员能够掌握的。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明具有如下突出的实质性特点和显著进步：

(1)本发明采用分子生物学技术敲除现有技术cn201711169481.9中的保藏号是cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδstpk-mdhδfk-mdhδpat-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδstpk-mdhδfk-mdhδpat-mdh)菌株中的乙醛脱氢酶编码基因并敲入药物外排转运蛋白编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和敲除乙醛脱氢酶基因并敲入药物外排转运蛋白基因的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产量仍不够高的缺陷。

(2)将在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccm2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株以重量百分比1％转接到mrs培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，检测代谢产物，mrs培养基中蔗糖底物质量为90g/l，通过对比试验证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产量比初始的保藏号是cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)提高了31.0％，蔗糖到甘露醇的转化率提高了6.5％。

(3)本发明应用方法中，mrs培养基的蔗糖底物质量能达到110克，仍能保证甘露醇的产量较高，更有助于工业化推广应用。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体同源臂的酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建中间带有α-淀粉酶基因标记的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

图4为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建中间带有药物外排转运蛋白基因的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的通过pcr验证乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

图1为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示左右同源臂：1.左同源臂，2.marker，3.右同源臂。

图2为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体同源臂的酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.marker，2.重组载体双酶切条带。

图3为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建中间带有α-淀粉酶基因标记的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.marker，2.重组载体双酶切条带。

图4为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的构建中间带有药物外排转运蛋白基因的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.marker，2.重组载体双酶切条带。

图5为本发明保藏号是cctccno：m2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的通过pcr验证乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1.marker，2.肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy为模板，3.以肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat-mdh△stpk-mdh△fk-mdh菌株为模板，4.肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb菌株为模板。

实施例1

构建乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，具体步骤如下：

以现有的保藏号是cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)为出发菌，构建乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株：

第一步，肠膜明串珠菌乙醛脱氢酶基因部分序列的克隆：

以染色体dna为模板，克隆编码序列长度为1524bp的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh[保藏日期是2017年10月25日，其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctccm2017578](leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)的乙醛脱氢酶基因部分连续序列，具体操作步骤是：

(1.1)保藏号是cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)的肠膜明串珠菌染色体dna的提取：

将在-80℃冻存的保藏号为cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)菌株划线于mrs固体平板上，于30℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升mrs液体培养基中，于30℃，转速为120转/分钟的摇床培养过夜；取2毫升的上述培养的菌液以转速为10000转/分钟离心2分钟，收集菌体；用1毫升双蒸水洗涤菌体两次；将菌体溶于100微升的双蒸水中，吹打混匀；加入100微升的浓度为100毫克/毫升的溶菌酶，37℃水浴1h；加入500微升提取液，轻轻混匀；于80℃孵育10分钟后，以14000转/分钟离心10分钟，弃上清；加100微升悬浮液，使dna溶解；加入等体积即100微升的酚-氯仿，轻轻摇匀，放入4℃冰箱中静置15分钟，然后4℃，12500转/分钟离心15分钟，把上清液抽提到新的离心管中；再重复一次酚-氯仿抽提操作；加入2倍体积即200微升的预冷无水乙醇，于4℃冰箱中静置2h；12000转/分钟离心20分钟，倒掉上清液；用体积百分比为70％的乙醇清洗1次，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液，晾干；将沉淀溶于20微升的te(tris-hcl100毫摩尔/升、edta10毫摩尔/升，ph8.0)中。

上述mrs培养基的组成：酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、k2hpo42克、mgso4·7h2o2克、mnso4·h2o0.039克、吐温801.6毫升和水1000毫升，用乙酸调ph到6.2；121℃灭菌20min。固体培养基加1.5％的琼脂。

上述提取液的组成：240毫摩尔/升naoh、2.7毫摩尔/升edta、74％乙醇。

上述悬浮液的组成：0.1毫摩尔/升edta、50毫摩尔/升tris-hcl，1％tritonx-100(ph8.0)，0.5％吐温20。

上述酚-氯仿溶液为用酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1配制成的溶液。

上述te溶液为用tris-hcl100毫摩尔/升和edta10毫摩尔/升配制，ph为8.0。

(1.2)pcr扩增乙醛脱氢酶基因：

设计一对引物aldhl：5'-actttgcgaatgaataatg-3'和aldhr：5'-tcgtgtaaccaatgataac-3'，以保藏编号为cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδstpk-mdhδfk-mdhδpat-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδstpk-mdhδfk-mdhδpat-mdh)的肠膜明串珠菌染色体dna为模板，pcr扩增得到为1524bp的片段，并用t4连接酶将pcr产物连接到pta2t载体上，重组质粒命名为pta2-aldh。

(1.3)感受态大肠杆菌dh5α的制备和dna转化：

将在-80℃冻存的大肠杆菌dh5α菌株划线于lb固体平板上，37℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升lb液体培养基中，于37℃以转速为180转/分钟摇床过夜培养；取0.2毫升上述培养得到的菌液转接到10毫升液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟振荡培养2～3h至菌液的od600为0.6；取上述od600为0.6的菌液1.0毫升加入到1.5毫升离心管中，冰浴10分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液；加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升cacl2溶液悬浮细胞，冰浴30分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液；加入100微升冰冷的0.1摩尔/升cacl2溶液悬浮细胞，即为感受态细胞，也即感受态大肠杆菌dh5α。

将重组质粒10微升加入到在上述感受态细胞中，冰浴30分钟；于42℃准确热激90秒；立即在冰上放置3分钟；加入400微升lb液体培养基，于37℃振荡培养45分钟；将转化的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体培养基平板上；将平板放置于37℃温箱30分钟，至液体被吸收；倒置平板，于37℃培养12～16h。

挑去单菌落，在含氨苄青霉素的lb培养基中培养，提取质粒，经过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。

上述lb液体培养基：酵母浸粉5克，蛋白胨10克，nacl10克，蒸馏水1000毫升，ph7.0，121℃灭菌20分钟。固体培养基加1.5％的琼脂。

第二步，中间带有α-淀粉酶标记的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的构建：

(2.1)设计一对引物aldhl1：5'-acagaattcgcagagatattaaaca-3'和aldhl2：5'-acatactctagatattcacttgatcgta-3'(与aldhr1互补配对)，以pta2-aldh为模板，pcr扩增得到为453bp的片段。

(2.2)设计一对引物aldhr1：5'-tgaatatctagagtatgtacttcgtcta-3'和aldhr2：5'-tataagcttctcaggtaatgttcca-3'，以pta2-aldh为模板，pcr扩增得到为507bp的片段。

(2.3)将上述(2.1)(2.2)中得到的2个pcr产物经纯化后混匀，以pcr产物混合物为模板，通过8轮pcr循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物aldhl1：5'-acagaattcgcagagatattaaaca-3'和aldhr2：5'-tataagcttctcaggtaatgttcca-3'再进行pcr，扩增得到为948bp的片段。

(2.4)将上述(2.3)中得到的重叠延伸pcr产物和puc19用ecori和hindⅲ进行双酶切后，两者在t4-dna连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选重组质粒puc19-aldhqh，即构建为同源重组载体。

(2.5)设计一对引物amyl：5'-ctatctagatttggcgtgattatcag-3'和染色体dna为模板，pcr扩增得到为2131bp的片段，并用t4连接酶将pcr产物连接到同源重组载体puc19-aldhqh同源臂中间的xbai位点上，重组质粒命名为puc19-aldhqh-amy，即构建为中间带有α-淀粉酶标记的乙醛脱氢酶基因同源重组载体。

第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙醛脱氢酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：

将在-80℃冻存的保藏号为cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)菌株划线于mrs固体平板上，于30℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升mrs液体培养基中，于30℃以转速为120转/分钟摇床培养过夜；以1％转接到mrs含0.48微克/毫升氨苄青霉素的培养基中继续培养，初始od600为0.048的保藏编号为cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)菌液的od600达到0.5时收集菌体，用含溶菌酶浓度为100u/毫升的liac-dtt溶液重新悬浮菌体，于30℃孵育20分钟，用冰冷的pbs溶液洗涤两次，再用50微升冰冷的pbs溶液悬浮菌体，加入5微升上述的同源重组载体质粒(puc19-aldhqh-amy)，冰浴10分钟后进行电转化，所用电转化仪为bio-radgenepulserxcell^tm，电击参数为电击杯间距0.1cm、1400v、25μf、300ω、电击时间为4毫秒，然后加入1毫升mrs培养基，复苏3h后，涂布于含mrs固体平板，培养120h后挑取单菌落验证，以证明从平板上筛选得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙醛脱氢酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy)菌株。

设计一对引物aldhyq：5'-gcagagatattaaacaaaa-3'和aldhyh：5'-tggtggaacattacctgag-3'，提取染色体dna，以染色体dna为模板进行pcr，上述肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy)菌株得到长度为3079bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh，保藏编号为cctccm2017578)得到长度为1125bp的扩增产物。

上述liac-dtt溶液为用100毫摩尔/升liac、10毫摩尔/升dtt、0.6摩尔/升蔗糖、10毫摩尔/升tris-hcl(ph7.5)的溶液；

上述pbs溶液为k2hpo4-kh2po41毫摩尔/升、mgcl21毫摩尔/升和蔗糖0.5摩尔/升配制的溶液，ph为6.9。

第四步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：

(4.1)药物外排转运蛋白基因表达盒的克隆：

(4.1.1)设计一对引物ldh1：5'-acctctagatagttagtagaaagtg-3'和ldh2：5'-attaggcataagatcctccaaaatt-3'(与acrb1互补配对)，以保藏号为cgmcc1.2138的肠膜明串珠菌染色体dna为模板，pcr扩增得到为207bp的片段。

(4.1.2)设计一对引物acrb1：5'-gaggatcttatgcctaatttcttta-3'和acrb2：5'-tattctagacgttgtatcaatgatg-3'，以保藏号为cgmcc1.747的大肠杆菌染色体dna为模板，pcr扩增得到为3173bp的片段。

(4.1.3)将上述(4.1.1)(4.1.2)中得到的2个pcr产物经纯化后混匀，以pcr产物混合物为模板，通过8轮pcr循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物ldh1：5'-acctctagatagttagtagaaagtg-3'和acrb2：5'-tattctagacgttgtatcaatgatg-3'再进行pcr，扩增得到为3362bp的片段。

(4.1.4)将上述(4.1.3)中得到的重叠延伸pcr产物和puc19用xbai进行酶切后，两者在t4-dna连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选重组质粒puc19-acrb，即克隆的药物外排转运蛋白基因表达盒。

(4.2)中间带有药物外排转运蛋白基因表达盒的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的构建：设计一对引物ldh1：5'-acctctagatagttagtagaaagtg-3'和acrb2：5'-tattctagacgttgtatcaatgatg-3'，以puc19-acrb为模板，pcr扩增得到为3362bp的片段，并用t4连接酶将pcr产物连接到同源重组载体puc19-aldhqh同源臂中间的xbai位点上，重组质粒命名为puc19-aldhqh-acrb，即构建为中间带有药物外排转运蛋白基因的乙醛脱氢酶基因同源重组载体。

(4.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：以电转化法将puc19-aldhqh-acrb导入到上述第三步中得到的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::amy)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙醛脱氢酶基因敲除并药物外排转运蛋白基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株。

设计一对引物aldhyq：5'-gcagagatattaaacaaaa-3'和aldhyh：5'-tggtggaacattacctgag-3'，提取染色体dna，以染色体dna为模板进行pcr，上述肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株得到长度为4310bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh，保藏编号为cctccm2017578)得到长度为1125bp的扩增产物。

实施例2

肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccm2018814)，即本发明的一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的发酵应用，具体步骤如下：

在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccm2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株以重量百分比1％转接到mrs培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到53.7克/升，甘露醇产率97.6％。

上述mrs培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖110克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、k2hpo42克、mnso4·h2o0.039克和水1000毫升用乙酸调ph到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到mrs培养基。

表1列出了各种明串珠菌发酵产甘露醇的产量，可见本发明的中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccm2018814的肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株的甘露醇产量比初始的保藏号是cctccm2017578的肠膜明串珠菌δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)提高了31.0％，甘露醇产率提高了6.5％。

表1.肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的产量(g/l)

(注：培养基的蔗糖为90g/l时，原始菌和δdts1δd-ldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh的甘露醇产量最高)

表1中，原始菌为未被改造的原始肠膜明串珠菌，δdts1δldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，即为肠膜明串珠菌δdts1δldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh(leuconostocmesenteroidesδdts1δldhδpat-mdhδstpk-mdhδfk-mdh)菌株，δdts1δldhδpat::mdhδstpk::mdhδfk::mdhδaldh::acrb为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、d-乳酸脱氢酶基因敲除、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和敲除乙醛脱氢酶编码基因并敲入药物外排转运蛋白基因的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb(leuconostocmesenteroides△dts1△ldh△pat::mdh△stpk::mdh△fk::mdh△aldh::acrb)菌株，其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏日期是2018年11月22日，保藏号是cctccm2018814)，即本发明的一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株。

上述实施例中，所涉及的原料、试剂和仪器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领域技术人员能够掌握的，未注明的具体实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或厂商提供的的方案进行。

序列表

<110>河北工业大学

<120>一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4557

<212>dna

<213>肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)

<400>1

atgagctatcaaacaattaatccctttaacgacgaagttattcaaacatttgacaatcat60

gatgacgcttatgttgagaaggccattgccgaaggtcatgcactgtataaaaagtggcgc120

aatgacccggctagtagtcgcgcagagatattaaacaaaattgctgacttgatggaagaa180

gatgctgatcatttagctaaggtacttactattgaaatgggtaagcgatttgtcgaggct240

caaggtgaagtagcattaagtgtttcaattgctcgttactacgccaaaaatggtgcagat300

tttcttaagccagaaccaatcaaatcctcgatgggggatgcgcaagtaatttcgcgcccc360

actggggtattgatgatggttgaaccatggaattttccttactatcaaattattcgtgta420

tttgcaccaaattatatagctggaaacccaatgcttttgaagcacgcaagcaatacgcca480

atggctgcatcagaatttgaaaaaattgttgaacgggctggtgcacctactggtgcgttt540

gctaatttattcattgattacgatcaagtgaatatctagatagttagtagaaagtgcttt600

aattagtgattaaagcaaagaaaatggaatgggttacatttgcttaacgactgtcatttg660

taaggggtgaaattttttctgaaatctatgcattatatgggcttaatcgcgtgcgttagc720

tcgtgaaatagggtacaattatagatgaaataaaattttggaggatcttatgcctaattt780

ctttatcgatcgcccgatttttgcgtgggtgatcgccattatcatcatgttggcaggggg840

gctggcgatcctcaaactgccggtggcgcaatatcctacgattgcaccgccggcagtaac900

gatctccgcctcctaccccggcgctgatgcgaaaacagtgcaggacacggtgacacaggt960

tatcgaacagaatatgaacggtatcgataacctgatgtacatgtcctctaacagtgactc1020

cacgggtaccgtgcagatcaccctgacctttgagtctggtactgatgcggatatcgcgca1080

ggttcaggtgcagaacaaactgcagctggcgtgccgttgctgccgcaagaagttcagcag1140

caaggggtgagcgttgagaaatcatccagcagcttcctgatggttgtcggcgttatcaac1200

accgatggcaccatgacgcaggaggatatctccgactacgtggcggcgaatatgaaagat1260

gccatcagccgtacgtcgggcgtgggtgatgttcagttgttcggttcacagtacgcgatg1320

cgtatctggatgaacccgaatgagctgaacaaattccagctaacgccggttgatgtcatt1380

accgccatcaaagcgcagaacgcccaggttgcggcgggtcagctcggtggtacgccgccg1440

gtgaaaggccaacagcttaacgcctctattattgctcagacgcgtctgacctctactgaa1500

gagttcggcaaaatcctgctgaaagtgaataggatggttcccgcgtgctgctgcgtgacg1560

tcgcgaagattgagctgggtggtgagaactacgacatcatcgcagagtttaacggccaac1620

cggcttccggtctggggatcaagctggcgaccggtgcaaacgcgctggataccgctgcgg1680

caatccgtgctgaactggcgaagatggaaccgttcttcccgtcgggtctgaaaattgttt1740

acccatacgacaccacgccgttcgtgaaaatctctattcacgaagtggttaaaacgctgg1800

tcgaagcgatcatcctcgtgttcctggttatgtatctgttcctgcagaacttccgcgcga1860

cgttgattccgaccattgccgtaccggtggtattgctcgggacctttgccgtccttgccg1920

cctttggcttctcgataaacacgctaacaatgttcgggatggtgctcgccatcggcctgt1980

tggtggatgacgccatcgttgtggtagaaaacgttgagcgtgttatggcggaagaaggtt2040

tgccgccaaaagaagctacccgtaagtcgatggggcagattcagggcgctctggtcggta2100

tcgcgatggtactgtcggcggtattcgtaccgatggccttctttggcggttctactggtg2160

ctatctatcgtcagttctctattaccattgtttcagcaatggcgctgtcggtactggtgg2220

cgttgatcctgactccagctctttgtgccaccatgctgaaaccgattgccaaaggcgatc2280

acggggaaggtaaaaaaggcttcttcggctggtttaaccgcatgttcgagaagagcacgc2340

accactacaccgacagcgtaggcggtattctgcgcagtacggggcgttacctggtgctgt2400

atctgatcatcgtggtcggcatggcctatctgttcgtgcgtctgccaagctccttcttgc2460

cagatgaggaccagggcgtgtttatgaccatggttcagctgccagcaggtgcaacgcagg2520

aacgtacacagaaagtgctcaatgaggtaacgcattactatctgaccaaagaaaagaaca2580

acgttgagtcggtgttcgccgttaacggcttcggctttgcgggacgtggtcagaataccg2640

gtattgcgttcgtttccttgaaggactgggccgatcgtccgggcgaagaaaacaaagttg2700

aagcgattaccatgcgtgcaacacgcgctttctcgcaaatcaaagatgcgatggttttcg2760

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cgcagtttaagattgatatcgaccaggaaaaagcgcaggcgctgggtgtttctatcaacg3000

acattaacaccactctgggcgctgcatggggcggcagctatgtgaacgactttatcgacc3060

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atatcggcgactggtatgttcgtgctgctgatggtcagatggtgccattctcggcgttct3180

cctcttctcgttgggagtacggttcgccgcgtctggaacgttacaacggcctgccatcca3240

tggaaatcttaggccaggcggcaccgggtaaaagtaccggtgaagcaatggagctgatgg3300

aacaactggcgagcaaactgcctaccggtgttggctatgactggacggggatgtcctatc3360

aggaacgtctctccggcaaccaggcaccttcactgtacgcgatttcgttgattgtcgtgt3420

tcctgtgtctggcggcgctgtacgagagctggtcgattccgttctccgttatgctggtcg3480

ttccgctgggggttatcggtgcgttgctggctgccaccttccgtggcctgaccaatgacg3540

tttacttccaggtaggcctgctcacaaccattgggttgtcggcgaagaacgcgatcctta3600

tcgtcgaattcgccaaagacttgatggataaagaaggtaaaggtctgattgaagcgacgc3660

ttgatgcggtgcggatgcgtttacgtccgatcctgatgacctcgctggcgtttatcctcg3720

gcgttatgccgctggttatcagtactggtgctggttccggcgcgcagaacgcagtaggta3780

ccggtgtaatgggcgggatggtgaccgcaacggtactggcaatcttcttcgttccggtat3840

tctttgtggtggttcgccgccgctttagccgcaagaatgaagatatcgagcacagccata3900

ctgtcgatcatcattgatacaacgtctagagtatgtacttcgtctaaacggtttattgta3960

accgaaaaaaattatgatgcggtacttacaatgttaaaagatgcctttgctgaagcaaaa4020

ctaggcgacccattgttggaagatacgacattagcaccattaagtaccagcaaggctaag4080

aaaaacttgaccaaacaagtgaaagcggcagttgatgccggtgctactcttgaatatggt4140

agtgttgtccaagataaaccagctgcactgtttgatcccgttattttaactggtattaca4200

aaagacaacccagcttattatcaagagttcttcggtccagttggacaagtctacaaagtg4260

aaagatgaagaagaggcaattacactagctaatgattctaattatggcttatcgggcgtg4320

gtatttggtggttcacctgagcatgcgacggaagttgcttctcgtattgagacgggagcg4380

gtttatgtgaatagttttggtggaacattacctgagttaccatttggtggtgttaaaaat4440

tctggctatggacgtgagctaggacgctttggtatcgaaacctttgtgaacaaggaactt4500

attgttactaaaaaggaaccaattgatttagataatgcttttggtggatttgtttaa4557