用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒与流程

本发明实施例涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒。

背景技术：

牙周炎是累及四种牙周支持组织的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。但这些方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。

牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，dpscs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。牙髓干细胞的保存对于能够利用干细胞来治疗疾病的越来越多，干细胞疗法将应用于人体所有的器官及功能，并对症下药。将牙髓干细胞注射至损伤部位或者修复受损伤的细胞和组织，是受伤的组织恢复正常，干细胞分泌生物活性物质，抑制病变部位的炎症并促进局部血管新生。

目前，常用的牙髓干细胞提取方法为采用i型胶原酶或者i型胶原酶与中性蛋白酶消化牙髓组织。但该法得到的牙髓干细胞总数量少，细胞活率低，而且，无有效的便利的提取及扩增培养冻存体系。

技术实现要素：

为此，本发明实施例提供一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒，以解决现有技术中由于样本量少、样本来源不同而导致的试剂浪费、交叉污染的问题。

为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：

一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，所述培养冻存体系包括牙髓干细胞提取试剂、牙髓干细胞培养试剂以及牙髓干细胞保存试剂，其中，所述培养试剂包括牙髓干细胞原代培养液、牙髓干细胞传代培养液以及牙髓干细胞消化液。

优选的，所述牙髓干细胞原代培养液包括α-mem培养基、体积分数为20％的胎牛血清、摩尔浓度为2mm/l的l-谷氨酰胺、0.25mg/ml的两性霉素b、0.1mm/l的l-抗坏血酸-2磷酸钠、100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素。

优选的，所述牙髓干细胞传代培养液为无血清培养基，100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素。

优选的，所述牙髓干细胞提取试剂包括牙髓组织消化液、牙髓组织消化液激活液以及牙髓组织消化液终止液；

其中，所述牙髓组织消化液包括3mg/ml胶原酶i、4mg/ml中性蛋白酶；

所述牙髓组织消化液激活液包括cacl2溶液，mgso4溶液；

所述牙髓组织消化终止液为α-mem培养基，其包含体积分数为5％的胎牛血清。

优选的，所述牙髓干细胞保存试剂包括：牙髓干细胞保存原液和牙髓干细胞保存稀释液；

其中，所述牙髓干细胞保存原液包括dmso溶液；

所述牙髓干细胞保存稀释液包括完全无血清培养基，其添加有100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素。

优选的，本发明实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，还包括牙齿储存清洁试剂，所述牙齿储存清洁试剂包括牙齿保存液、牙齿清洁液；

其中，所述牙齿保存液为α-mem培养基；

所述牙齿清洁液为0.9％生理盐水。

优选的，所述无血清培养基还包含体积分数2％的血清替代品，2mm/l的l-谷氨酰胺。

本发明实施提供一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存试剂盒，包括上述所述的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系。

本发明实施例再提供一种体外扩增牙髓干细胞的培养冻存方法，其包括以下步骤：

清洁牙齿：将取出的牙齿放入牙齿保存液，并牙齿清洁液浸泡1-3min，清除牙龈组织及血块；

分离牙髓干细胞：用牙髓组织消化液消化粉碎的牙髓组织，加入牙髓组织消化液激活液，37℃下，振荡30-40min后，加入牙髓组织消化终止液，重悬牙髓干细胞液；

培养扩增牙髓干细胞：将牙髓干细胞液离心分离牙髓干细胞，加入牙髓干细胞原代培养液，在37℃，5％co2环境中培养；当牙髓干细胞融合80-90％时，将牙髓干细胞传代至p1代，用生理盐水洗涤牙髓干细胞2次，用牙髓干细胞消化液消化牙髓干细胞后，离心分离牙髓干细胞，用牙髓干细胞传代培养液重悬，继续培养至牙髓干细胞融合90％时，按照6000-8000个/cm2的密度传代至p2代牙髓干细胞；

保存牙髓干细胞：将p2代牙髓干细胞清洗2次，牙髓干细胞消化液处理后，离心分离牙髓干细胞，用牙髓干细胞保存液保存。

优选的，所述牙髓干细胞按照1-3×106个/ml的密度保存于液氮中。

本发明的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系具有如下优点：

本发明实施例用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系囊括了牙髓干细胞从牙齿保存运输到牙髓干细胞冻存的所有过程，牙髓干细胞储存操作简便，能获得大量、高纯度的牙髓干细胞，本发明实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养体系减少了多配试剂造成的资源浪费，又降低了与其他样本交叉污染的风险，为后期牙髓干细胞在临床治疗疾病以及再生医学领域研究提供可靠保证。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1a-图1i为本发明实施例提供的利用本发明实施例提供的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系获得的p2代细胞进行流式细胞检测仪器的检测结果图；

其中，图1a表示牙髓干细胞流式结果散点图分布，圈住的区域为牙髓干细胞，细胞纯度较高；图1b表示采用fitc染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，cd45阳性值为0.011％，cd45表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1c表示采用percp染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，cd34阳性细胞值为0％，cd34表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1d表示采用pe染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，hla-dr阳性值为0.011％，hla-dr表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1e表示采用pe染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，cd19阳性值为0.016％，cd19表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1f表示采用fitc染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，cd11b阳性值为0.016％，cd11b表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1g表示采用apc染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域完全分离，cd105阳性值为97.5％，cd11b表达阳性，符合间充质干细胞表达要求；图1h表示采用pe染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域完全分离，cd90阳性值为98.0％，cd90表达阳性，符合间充质干细胞表达要求；图1i采用apc染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本发明实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域完全分离，cd73阳性值为99.9％，cd73表达阳性，符合间充质干细胞表达要求。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，该培养冻存体系包括牙髓干细胞提取试剂、牙髓干细胞培养试剂以及牙髓干细胞保存试剂，其中，培养试剂包括牙髓干细胞原代培养液、牙髓干细胞传代培养液以及牙髓干细胞消化液。其中，牙髓干细胞原代培养液包括α-mem培养基、体积分数为20％的胎牛血清、摩尔浓度为2mm/l的l-谷氨酰胺、0.25mg/ml的两性霉素b、0.1mm/l的l-抗坏血酸-2磷酸钠、100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素。牙髓干细胞传代培养液为无血清培养基，100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素。本于体外扩增牙髓干细胞的培养体系囊括了牙髓干细胞从牙齿运输开始到牙髓干细胞冻存的所有环节，牙髓干细胞储存操作简便，能获得大量、高纯度的牙髓干细胞，并且专盒专用，既减避免了资源浪费，又降低了交叉污染的风险，为后期牙髓干细胞在临床治疗疾病以及再生医学领域研究提供保证。

牙髓干细胞提取试剂包括牙髓组织消化液、牙髓组织消化液激活液以及牙髓组织消化液终止液；其中，牙髓组织消化液包括3mg/ml胶原酶i、4mg/ml中性蛋白酶；牙髓组织消化液激活液包括cacl2，mgso4溶液；牙髓组织消化终止液为α-mem培养基，该α-mem培养基包括l-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷、以及体积分数为5％的胎牛血清。

牙髓干细胞保存试剂包括：牙髓干细胞保存原液和牙髓干细胞保存稀释液；其中，牙髓干细胞保存原液包括dmso溶液；牙髓干细胞保存稀释液包括完全无血清培养基(lonza12-725f)，该完全无血清培养基包括重组人胰岛素、牛转铁蛋白、纯化的牛血清蛋白，其中，蛋白含量约为3mg/ml，并且添加有100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素。

本发明实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养体系还包括牙齿储存清洁试剂，牙齿储存清洁试剂包括牙齿保存液、牙齿清洁液；其中，牙齿保存液为α-mem培养基；牙齿清洁液为0.9％生理盐水。

本发明实施例中，无血清培养基还包含体积分数2％的血清替代品，该血清替代品包括含粘附因子，结合蛋白，生长因子，微量矿物元素，荷尔蒙，维生素等，2mm/l的l-谷氨酰胺。

本发明实施例还提供一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存试剂盒，其包括用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系。具体的，该试剂盒中包括10ml牙齿保存液、1ml牙髓组织消化液、100ul牙髓组织消化液激活液、10ml牙髓组织消化终止液、20ml牙髓干细胞原代培养液、150ml牙髓干细胞传代培养液、15ml牙髓干细胞消化液、1.5ml牙髓干细胞保存原液、20ml牙髓干细胞保存稀释液。装上述液体试剂瓶可采用一次性无菌、物热源的西林瓶或无菌、无热源的储液瓶或者为一次性灭菌无热源的ep管。试剂瓶的大小可根据试剂量进行选择。本发明实施例中，将用于体外扩增牙髓干细胞的培养体系集成在一个试剂盒中，可以使用更加方便、高效、有利于随时开展对牙髓干细胞的培养和保存，适应了市场上强大的需求，具有巨大经济价值。

本发明实施例提供一种体外扩增牙髓干细胞的培养方法，其包括以下步骤：

拔掉牙齿：在专业的牙科医疗机构对将脱落乳牙或成人智齿进行拔牙；

清洁牙齿：将取出的牙齿放入牙齿保存液，4℃储存，48h内对其进行清洁处理，在生物清洁柜中，将牙齿转移到无菌平皿内，用牙齿清洁液浸泡1-3min，并清除牙龈组织及血块，连续清洗2-3次；

分离牙髓干细胞：用无菌酒精纱布将清洁后的牙齿包裹住，使用台钳将牙齿进行破碎，然后，在生物安全柜内用无菌镊子将牙髓取出，并将牙髓组织并将其剪碎成碎块，碎块的大小为1mm左右，将牙髓组织碎块用消化液消化后，加入牙髓组织消化液激活液，37℃下，振荡30-40min，转速为180rpm/min，加入牙髓组织消化终止液，重悬牙髓干细胞液；

培养扩增牙髓干细胞：将牙髓干细胞液1200rpm/min转速下离心5min，获得牙髓干细胞，在上述牙髓干细胞中加入牙髓干细胞原代培养液，在37℃，5％co2环境中培养，原代牙髓干细胞培养每3天换一次液，当牙髓干细胞融合80-90％时，将牙髓干细胞传代至p1代，弃去培养基，用无菌生理盐水洗涤牙髓干细胞2次，用牙髓干细胞消化液消化干细胞后，离心收集的牙髓干细胞，用牙髓干细胞传代培养液重悬，继续培养至细胞融合90％时，按照6000-8000个/cm²的密度传代至p2代牙髓干细胞；

保存牙髓干细胞：将p2代牙髓干细胞清洗2次，牙髓干细胞消化液处理后，离心收集牙髓干细胞，用牙髓干细胞稀释液和牙髓干细胞保存原液稀释配制牙髓干细胞保存液浓度为5-10％，将牙髓干细胞保存在牙髓干细胞保存液中，然后将牙髓干细胞按照1-3×10⁶个/ml的密度保存于液氮中。

实施例本发明实施例用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系培养冻存牙髓干细胞

步骤a：拔牙及清洁牙齿

a1、在专门的牙科医疗机构对将脱落乳牙进行拔牙处理；

a2、将拔下的牙齿用无菌镊子放入牙齿保存液中，4℃储存，24h内对其清洁处理；

a3、无菌条件下，在生物安全柜中，将牙齿转移到无菌平皿内，使用牙齿清洁液浸泡1-2min，同时用无菌镊子清洁牙齿表面的牙龈组织及血块，共清洁3次；

步骤b：分离牙髓干细胞

b1、用无菌酒精纱布将牙齿包裹，使用台钳将牙齿进行破碎，然后在生物安全柜内用无菌镊子将牙髓取出；

b2、使用眼科剪及眼科镊将牙髓组织剪碎成1mm大小碎块；

b3、用镊子将剪碎后的牙髓组织转移15ml离心管中，加入牙髓组织消化液消化，添加20ul牙髓组织消化液激活液，在37℃条件下，震荡消化20min，转速180rpm/min；

b4、向消化后的细胞、组织悬液中加入牙髓组织消化终止液，重悬干细胞，在1200rpm/min转速下，离心5min；

步骤c：培养扩增牙髓干细胞

c1、弃去离心后的上清液，用1.5mlf瓶中的原代培养基重悬牙髓干细胞及组织，然后将牙髓干细胞组织、细胞种植到25cm²培养瓶中，一个牙髓一个培养瓶，在37℃，5％co2培养箱中培养；

c2、原代牙髓干细胞，每3天换液一次进行培养；

c3、培养到第16天，细胞融合80-90％时，牙髓干细胞传代至p1代，弃去培养基，使用无菌生理盐水清洗细胞2次，使用牙髓干细胞消化液消化细胞，离心，获取牙髓干细胞后，用牙髓干细胞传代培养液重悬细胞，按照6000-8000个/cm²的密度传代，继续培养牙髓干细胞，融合达90％时，收获牙髓干细胞，按照6000-8000个/cm²的密度传代至p2代；

步骤d：保存牙髓干细胞

d1、配置冻存液，用牙髓干细胞稀释液对牙髓干细胞保存液进行稀释，获得牙髓干细胞保存液的浓度为10％，然后放入4℃冰箱保存；

d2、收获p2代牙髓干细胞，弃去培养基，使用无菌生理盐水清洗细胞2次，使用牙髓干细胞消化液消化牙髓干细胞，离心牙髓干细胞后，弃去上清，使用牙髓干细胞保存液重悬牙髓干细胞，按照1-3×10⁶个/ml的密度冻存牙髓干细胞，梯度降温后，转入液氮保存。

如图1a-图1i所示，对培养的p2代细胞进行流式细胞分析，牙髓间充质干细胞作为间充质干细胞的一种，具有间充质干细胞的共性，具有间充质干细胞免疫表型：表达cd73，cd90，cd105，不表达cd45，cd34，cd19，cd11b，hla-dr。通过本发明实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养体系培养的牙髓干细胞，该牙髓干细胞流式细胞仪检测结果如图1所示，cd73-apc表达99.9％，cd90-pe表达98％，cd105-apc表达97.5％，均大于95％，而cd45-fit表达0.011％，cd34-percp表达0％，cd19-pe表达0.016％，cd11b-fitc表达0.016％，hla-dr-pe表达0.011％，数值均小于2％，符合间充质干细胞表型要求，通过本发明实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系可培养冻存数量多、高纯度的牙髓间充质干细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。