多肽、其衍生物及其在制备抗肺纤维化的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽、其衍生物及其在制备抗肺纤维化的药物中的应用。

背景技术：

肺纤维化是肺部最为严重的一种病理状态，其病理改变大多表现为最初的下呼吸道炎症，以及肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，伴有成纤维母细胞和ii型肺泡细胞增殖、细胞因子释放，细胞外基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺部改变。肺纤维化患者肺部肺泡逐渐被纤维性物质取代，导致肺组织变硬变厚，肺脏气体交换能力逐步丧失，导致患者不同程度缺氧而出现呼吸困难，最后因呼吸衰竭而死亡。肺纤维化是呼吸病四大病种之一，病因复杂，发病机制不明，目前已有的治疗肺纤维化的药物和方法十分有限，且疗效差强人意，预后极差，5年生存率仅为50％。

泛素修饰酶a20，也被称为tnfaip3，最早在人脐静脉内皮细胞中被发现，主要通过抑制tnf-α介导的细胞凋亡、阻断nf-κb信号通路等发挥作用，参与体内免疫反应的调节。研究发现，a20作为一种公认的抗炎蛋白，被证实在多种自身免疫性疾病中发挥了重要的负调节作用，例如哮喘、过敏和囊性纤维化等。敲除a20的小鼠出现严重的炎症反应并过早的死亡。在急性炎症刺激下，a20通过下调nf-κb信号通路参与调控巨噬细胞的分化。此外，增加巨噬细胞中a20的表达能够抑制toll样受体引起的炎症反应。gsk-3β则是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。现有技术中已有特异性结合gsk-3β的多肽，例如l803-mts，该多肽目前被应用于预防和治疗中枢神经系统疾病中，目前没有任何特异性结合gsk-3β的多肽可以应用于预防和/或治疗肺纤维化的相关报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏安全有效的预防和/或治疗肺纤维化药物的现状，提供一种多肽、多肽的衍生物和药物组合物及其在制备治疗和/或预防肺纤维化的药物中的应用。本发明的多肽、多肽的衍生物和药物组合物能够阻断gsk-3β与a20蛋白的相互作用，从而应用于预防和/或治疗肺纤维化药物的制备中。利用上述多肽、多肽的衍生物和药物组合物应用于治疗肺纤维化疾病中，能够显著抑制肺纤维化、显著降低肺重指数、明显减少肺肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量、显著降低肺组织羟脯氨酸和胶原含量、显著改善肺功能，具有疗效显著、毒副作用少、使用安全的优点。

本发明人经过深入的研究和反复的试验，发现持续反复的肺损伤促进蛋白激酶gsk-3β的表达，高表达的gsk-3β与a20发挥相互作用，诱导a20磷酸化，抑制a20酶活性，导致肺泡巨噬细胞活化，进而分泌大量的促纤维化因子促进肺成纤维细胞(肺纤维化的主要效应器细胞)的增殖、迁移和活化。从而推断出阻断gsk-3β与a20之间的相互作用是治疗肺纤维化的一个潜在途径。gsk-3β与a20的相互作用与肺纤维化相关的机制为本发明首次发现。继而本发明人通过研究开发获得了靶向gsk-3β与a20蛋白相互作用的多肽，并且发现该多肽能够应用于制备治疗和/或预防肺纤维化的药物中。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一是：一种特异性结合gsk-3β的多肽或所述多肽的衍生物，所述多肽的氨基酸序列来自于与gsk-3β结合的a20序列；所述多肽的氨基酸序列如序列表中seqidno:1(其氨基酸序列为：leu-val-leu-arg-lys-ala-leu-phe-ser-thr-leu-lys)、seqidno:2(其氨基酸序列为：trp-asn-asp-glu-trp-asp-asn-leu-ile-lys-met-ala)或seqidno:3(其序氨基酸列为：ile-his-ile-phe-val-leu-cys-asn-ile)所示；可适当引入氨基酸替换、缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成与gsk-3β特异性结合的多肽且该多肽仍然保持改变前的活性即可。

所述多肽的衍生物包括所述特异性结合gsk-3β的多肽与细胞穿膜肽连接形成的嵌合肽。

较佳地，所述多肽为α螺旋肽。

较佳地，所述细胞穿膜肽连接在所述多肽的n端或者c端，优选连接在所述多肽的n端；更佳地，所述细胞穿膜肽和所述多肽之间以两个谷氨酸连接。

本发明中所述的细胞穿膜肽可为本领域常规的细胞穿膜肽，只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。较佳地，所述细胞穿膜肽选自pep2肽(hlyvspw，其氨基酸序列如序列表中seqidno:4所示)、hiv-1病毒反转录激活因子(trans-activatortranscription，tat)蛋白的tat肽(ygrkkrrqrrr，其氨基酸序列如seqidno:5所示)、果蝇触角同源异型蛋白的转录因子antp肽(rqikiwfqnrrmkwkk，其氨基酸序列如seqidno:6所示)、pep-1肽(ketwwetwwtewsqpkkkrkv，其氨基酸序列如seqidno:7所示)、mpg肽(galflgflgaagstmgawsqpkskrkv，其氨基酸序列如seqid:8所示)和rgd肽(arg-gly-asp，其氨基酸序列如seqidno:9所示)中的任意一种或多种；更佳地，所述细胞穿膜肽为pep2肽。

本发明中，所述的多肽衍生物更佳地是将所述pep2肽连接在如序列表中seqidno:1，seqidno:2和seqidno:3任意一条所示的多肽的n端、或者将所述tat肽连接在如序列表中seqidno:1所示的多肽的n端，或者将所述antp肽连接在如序列表中seqidno:1所示的多肽的n端所形成的嵌合肽，所述嵌合肽的氨基酸序列较佳地如序列表中seqidno:10(其氨基酸序列为：hlyvspwgglvlrkalfstlk)、seqidno:11(其氨基酸序列为：hlyvspwggwndewdnlikma)、seqidno:12(其氨基酸序列为：hlyvspwggihifvlcni)、seqidno:13(其氨基酸序列为：ygrkkrrqrrrgglvlrkalfstlk)和seqidno:14(其氨基酸序列为：rqikiwfqnrrmkwkkgglvlrkalfstlk)中任一条所示。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二是：一种抗肺纤维化的药物组合物，其活性成分含有上述多肽或所述多肽的衍生物。

本发明所述的“活性成分”是指具有预防和/或治疗肺纤维化功能的化合物。

较佳地，所述活性成分为单一活性成分；或者所述活性成分还包括其它具有抗肺纤维化活性的化合物。

较佳地，所述药物组合物还包括一种或多种药用载体。

本发明中所述的药用载体可为本领域常规药用载体，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等。

本发明中，所述药物组合物的剂型没有特别限制，可为本领域常规剂型。所述药物组合物的剂型较佳地是固体、半固体或液体。所述药物组合物的剂型也可以是水溶液、非水溶液或混悬液。该药物组合物的剂型更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂。所述药物组合物的给药途径可为本领域常规的给药途径，所述给药途径较佳地为注射给药或口服给药。其中所述注射给药的方式较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径。

本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用剂量较佳地为0.1～15mg/kg，更佳地为5～10mg/kg，优选5mg/kg，给药次数较佳地为一天一次或数次。在预防和/或治疗肺纤维化时，本发明所述的药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三是：上述多肽或所述多肽的衍生物和/或上述药物组合物在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

本发明中所述的“肺纤维化”可为本领域常规的肺纤维化。所述肺纤维化较佳地是指以特发性肺纤维化病理改变为特征的，由各种不同因素所导致的肺纤维化。较佳地，所述肺纤维化疾病为粉尘、放射线和/或药物引起的肺纤维化疾病，所述药物为，例如博来霉素。

较佳地，本发明所述的肺纤维化较佳地是指人或动物的肺纤维化。

较佳地，所述肺纤维化疾病为原发性(特异性)的肺纤维化(即原因不明的肺纤维化)疾病，或者是继发性的肺纤维化疾病，即是继发于原先疾病的肺纤维化疾病；更佳地，所述肺纤维化疾病包括慢性阻塞性肺病(copd)、特发性肺纤维化、间质性肺炎、结节病、尘肺、过敏性肺炎、胶原血管疾病有关的致纤维化肺部炎症、肺功能退化或肺损伤。

较佳地，所述预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物为降低肺重指数、减少肺泡灌洗液中炎性细胞的数量、降低肺组织的羟脯氨酸含量、降低肺组织的胶原含量、改善肺功能的药物；更佳地，所述炎性细胞包括总白细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四是：gsk-3β和/或a20的抑制剂或拮抗剂在制备防治肺纤维化的药物中的应用。

本发明中，抗肺纤维化是指预防和/或治疗肺纤维化。

本发明所述“预防”是指在可能的肺纤维化因素的存在下，使用后防止或降低肺纤维化的产生。本发明所述“治疗”是指减轻肺纤维化的程度，或者治愈肺纤维化使之正常化，或者减缓肺纤维化的进程。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽、多肽的衍生物和药物组合物能够阻断gsk-3β与a20蛋白的相互作用，从而能够应用于预防和/或治疗肺纤维化药物的制备。利用上述多肽、多肽的衍生物和药物组合物应用于治疗肺纤维化疾病，能够显著抑制肺纤维化、显著降低肺重指数、明显减少肺肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量、显著降低肺组织羟脯氨酸和胶原含量、显著改善肺功能，具有疗效显著、毒副作用少、使用安全的优点。

附图说明

图1为肺纤维化小鼠肺泡巨噬细胞内a20酶活性抑制图谱。

图2为肺纤维小鼠肺组织内gsk-3β与a20相互作用图谱。其中图2(a)显示初始肺泡巨噬细胞裂解液所含gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白含量；图2(b)显示肺泡巨噬细胞裂解液经过a20抗体或对照抗体igg沉淀之后所含gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白量。

图3为肺纤维化小鼠肺泡巨噬细胞内gsk-3β表达增高图谱。

图4为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠死亡率检测结果图。

图5为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺部gsk-3β与a20的相互作用图谱。其中图5(a)显示初始肺组织裂解液所含gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白含量；图5(b)显示肺组织裂解液分别经过pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3处理后，利用a20抗体或对照抗体igg沉淀所得gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白量。

图6为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺重指数结果图。

图7为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞数量结果图。其中：a为总白细胞数量，b为单核细胞数量，c为中性粒细胞数量，d为淋巴细胞数量，e为嗜碱性粒细胞数，f为嗜酸性粒细胞数量。

图8为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素引起肺纤维化的病理学检查(he)图谱。其中：a为假手术组，b为博莱霉素模型组，c为博莱霉素加pep2-pa1组，d为博莱霉素加pep2-pa2组，e为博莱霉素加pep2-pa3组，f为博莱霉素加吡非尼酮组。

图9为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素引起肺纤维化的病理学检查评分结果图。

图10为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素引起肺纤维化的病理学检查(天狼星红)。其中：a为假手术组，b为模型组，c为pep2-pa1组，d为pep2-pa2组，e为pep2-pa3组，f为阳性对照药吡非尼酮组。

图11为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3对肺纤维化小鼠肺组织胶原含量的影响。

图12为肺纤维化小鼠的肺功能检测结果。其中a为深吸气量，b为动态阻力，c为动态弹性，d为动态顺应性。

图13为pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3降低博莱霉素引起肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量结果图。

图14为tat-pa1、antp-pa1降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠死亡率检测结果图。

图15为tat-pa1、antp-pa1降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺重指数结果图。

图16为tat-pa1、antp-pa1降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞数量结果图。其中：a为总白细胞数量，b为单核细胞数量，c为中性粒细胞数量，d为淋巴细胞数量，e为嗜碱性粒细胞数，f为嗜酸性粒细胞数量。

图17为tat-pa1、antp-pa1降低博莱霉素引起肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量结果图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1制备肺纤维化动物模型

1.主要试剂及实验动物

实验所用博莱霉素购自日本化药，批号x81040。

吡菲尼酮，购自大连美仑生物科技有限公司，为原料药，吡非尼酮含量>98.5％。

实验中所使用的其他化合物若无特别说明，均购买自sigma公司。

将如序列表seqidno:1(pa1)、seqidno:2(pa2)和seqidno:3(pa3)所示的氨基酸序列的肽段上分别连接细胞穿膜肽pep2(穿膜肽pep2的氨基酸序列为hlyvspw，如序列表中seqidno:4所示)，组成新的衍生物嵌合肽pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3，上述多肽或嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。pa1、pa2和pa3通过两个谷氨酸链连接到pep2的c端。以上嵌合肽的序列结构如下：

pep2-pa1序列为：

“n”-his-leu-tyr-val-ser-pro-trp-gly-gly-leu-val-leu-arg-lys-ala-leu-phe-ser-thr-leu-lys-“c”(其序列如序列表中seqidno:10所示)。

pep2-pa2序列为：

“n”-his-leu-tyr-val-ser-pro-trp-gly-gly-trp-asn-asp-glu-trp-asp-asn-leu-ile-lys-met-ala-“c”(其序列如序列表中seqidno:11所示)。

pep2-pa3序列为：

“n”-his-leu-tyr-val-ser-pro-trp-gly-gly-ile-his-ile-phe-val-leu-cys-asn-ile-“c”(其序列如序列表中seqidno:12所示)。

实验所用的spf级c57bl/6小鼠(雄性，6～8周龄，16～18g)，购买自中国医学科学院动物所。

2.制备方法

雄性c57bl/6(周龄6-8周)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，气管内注射博莱霉素(5u/kg)。具体方案如下：以尽量小的创伤切开颈部皮肤，在弯头眼科镊的协助下，暴露气管，使用微量进样器穿刺气管，向气管内注入约50μl博莱霉素，迅速地旋转并直立5分钟，以便使博莱霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约60℃左右的手术操作台进行。假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水。

实施例2western-blot检测肺纤维化小鼠肺泡巨噬细胞a20的酶活性取实施例1制备所得动物模型适量的肺泡巨噬细胞，加入裂解缓冲液[含0.1mmedta(乙二胺四乙酸)、0.1mmegta(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、10mmkcl(氯化钾)和10mmhepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)以及50mmnaf(氟化钠)，0.1mna3vo4(钒酸钠)，0.1mna3po4(焦磷酸钠)，蛋白酶抑制剂1μmol/l的aprotinin(抑酞酶)、trypsininhibitor(胰蛋白酶抑制剂)、pmsf(苯甲基磺酰氟化物)、leupeptins(亮肽素)和dtt(二硫苏糖醇)]匀浆后，冰上放置15min，间或振荡。迅速加入10％np-40混匀，4℃、12000rpm，离心5min。取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，调节假手术组和博来霉素组样品的蛋白浓度至相同。加入2μga20抗体(购买自cst，编号为5630)或者与a20抗体种属相同的普通igg抗体(购买自cellsignaling，商品编号为2729)，同时加入10μlproteina/gplus-agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃，3000rpm离心5min，小心吸除上清。加入0.5ml免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃，3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入50μl洗脱液(取自pierce免疫共沉淀试剂盒)，室温静置5min，3000rpm室温离心2min，上清即为a20蛋白样品。使用dub活性检测试剂盒(stressmarqbiosciences)检测a20蛋白的酶活性，结果见图1。图1结果表明，肺纤维化小鼠肺泡巨噬细胞a20蛋白酶活性被显著抑制。

实施例3利用免疫共沉淀的方法验证肺泡巨噬细胞内gsk-3β与蛋白a20的结合

免疫共沉淀试剂如下：

裂解液a液：0.6057gtris碱，1.7532gnacl，0.1017gmgcl2·6h2o，0.0742gedta，10ml甘油，10ml10％np40，加去离子水至150ml，用hcl调ph值至7.6，定容至191ml，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。

裂解液b液：200μl2mβ-磷酸甘油，4ml2.5mnaf，2ml100mmnavo3，2ml100mmpmsf，200μl1mdtt，1mg/ml的leu、pep、apr各200μl，总体积共9ml。母液于-20℃储存。使用前，将b液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入a液中并混匀。

proteina/gplus-agarose购自美国santacruz公司。

具体操作步骤如下：

(1)取小鼠肺泡灌洗液中的肺泡巨噬细胞。

(2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至相同浓度。每组蛋白各取200μg，将各组蛋白取出200μg作为细胞裂解液的输入组，并将所得输入组的细胞裂解液作为对照。

(3)剩余蛋白加入2μga20抗体(购买自cst，编号为5630)或者与a20抗体种属相同的普通igg抗体(购买自cellsignaling，商品编号为2729)，同时加入10μlproteina/gplus-agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃，3000rpm离心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到agarose。加入0.5ml免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃，3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入50μl2×sds凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性5min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所得结果见图2(其中图2(a)显示初始肺泡巨噬细胞裂解液所含gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白含量；其中图2(b)显示肺泡巨噬细胞裂解液经过a20抗体或对照抗体igg沉淀之后所含gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白量)，由图2结果可见肺泡巨噬细胞内gsk-3β蛋白与a20蛋白存在相互结合的现象。其中输入的细胞裂解液制备方法如上文所示，输入代表初始肺泡巨噬细胞裂解液中gsk-3β与a20的蛋白含量，即蛋白原液在经过a20抗体或对照抗体igg(由于a20抗体为igg型抗体，故选择igg抗体作为对照)沉淀之前的gsk-3β和a20蛋白含量，结果表明，输入组细胞裂解液中的gsk-3β蛋白及a20蛋白的含量一致。

其中输出代表蛋白原液经过a20抗体或对照抗体igg沉淀之后所含蛋白量，由于igg抗体作为a20抗体的对照抗体，不能将a20蛋白沉淀下来，因此igg抗体处理的细胞裂解液中a20蛋白印迹泳道显示为空白，而a20抗体作为实验组抗体，能与a20蛋白结合并且将其沉淀下来，因此a20抗体处理后的细胞裂解液结果为a20蛋白印迹泳道显示为黑色。正是因为a20蛋白与gsk-3β蛋白之间存在相互作用，因此使用a20抗体沉淀a20蛋白时也能将gsk-3β蛋白沉淀下来，故a20抗体处理后的细胞裂解液的gsk-3β蛋白印迹泳道显示为黑色。由于igg抗体不能将a20蛋白沉淀下来，因此也无法将a20相互作用蛋白gsk-3β沉淀下来，故igg抗体处理的后的细胞裂解液的gsk-3β蛋白印迹泳道为空白。上述实验结果充分证明，gsk-3β蛋白与a20蛋白能够直接发生相互作用。

实施例4westernblot方法检测肺纤维化小鼠肺泡巨噬细胞中gsk-3β蛋白的表达。

取实施例1制备所得动物模型适量的肺泡巨噬细胞，加入裂解缓冲液[含0.1mmedta(乙二胺四乙酸)、0.1mmegta(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、10mmkcl(氯化钾)和10mmhepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)以及50mmnaf(氟化钠)，0.1mna3vo4(钒酸钠)，0.1mna3po4(焦磷酸钠)，蛋白酶抑制剂1μmol/l的aprotinin(抑酞酶)、trypsininhibitor(胰蛋白酶抑制剂)、pmsf(苯甲基磺酰氟化物)、leupeptins(亮肽素)和dtt(二硫苏糖醇)]匀浆后，冰上放置15min，间或振荡。迅速加入10％np-40混匀，4℃、12000rpm，离心5min。取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，调节蛋白浓度至相同用于westernblot分析，检测gsk-3β。使用amersham显色液(华美公司nbt/bcip染色试剂盒ik5030)显色，经western-blot分析软件(gelpro32)测出各条带的光密度值分析，结果见图3。图3结果表明，肺纤维化小鼠肺部组织内gsk-3β蛋白呈高表达状态。

实施例5利用肺纤维化动物模型验证pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3抗肺纤维化作用。

将实施例1制备的动物模型在造模10天后分组给药，分组和给药情况如表1所示(i.p.为腹腔注射给药，i.g.为灌胃给药)：

表1.肺纤维化动物模型在造模后的分组给药情况

1、测定小鼠死亡率

从造模后第10天计算，每天统计各组实验动物死亡情况并进行计算，某组动物未出现死亡的生存率计算为100％，某组动物全部死亡的生存率为0％，结果从图4可见。与假手术组对比，模型组生存率显著降低。经过药物治疗后，pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3给药组均能显著提高纤维化小鼠生存率，阳性对照药吡非尼酮给药组可以减少实验动物死亡，但无统计学差异。##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。上述实验结果表明本发明所述多肽及其衍生物能够有效降低肺纤维化模型小鼠的死亡率，具有毒副作用少，使用更安全的优点。

2、免疫共沉淀法检测博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺部gsk-3β蛋白与a20蛋白的相互作用

具体操作方法同实施例3。结果见图5(其中a显示初始肺组织肺泡巨噬细胞裂解液所含gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白含量；其中b显示肺泡巨噬细胞裂解液分别经过pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3处理后，利用a20抗体或对照抗体igg沉淀所得gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白量)，从图5可见肺纤维化组织内gsk-3β蛋白与a20蛋白存在相互结合。经过药物治疗后，pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3均能降低gsk-3β蛋白与a20蛋白的相互结合。其中输入代表初始肺泡巨噬细胞裂解液中gsk-3β蛋白与a20蛋白的蛋白含量，即蛋白原液在经过a20抗体或对照抗体igg(由于a20抗体为igg型抗体，故选择igg抗体作为对照)沉淀之前，其中含有gsk-3β蛋白及a20蛋白的蛋白量一致。输出代表蛋白原液经过a20抗体或对照抗体igg沉淀之后所含蛋白量。加入pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3后，由于上述三种多肽均能影响gsk-3β与a20之间进行相互作用，故其gsk-3β蛋白印迹泳道颜色变浅。igg抗体作为对照抗体不能将a20蛋白沉淀下来，相应也无法将a20相互作用蛋白gsk-3β沉淀下来，其gsk-3β蛋白印迹泳道为空白。上述实验结果充分证明，本发明所述多肽及其衍生物能够阻碍gsk-3β蛋白与a20蛋白之间的相互结合。

3、检测小鼠的肺重指数

精细剥离小鼠肺脏并称取湿重，将肺重(mg)除以小鼠体重(g)得到肺重指数，结果见图6。从图6可见，与假手术组相比，给予博莱霉素后小鼠肺重指数显著升高。pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3给药后均能显著降低纤维化小鼠肺重指数，阳性对照药吡非尼酮可以轻微降低实验动物肺重指数，但无统计学差异。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

4、检测小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量

小鼠进行颈部解剖，暴露器官进行插管。pbs灌洗量0.8ml，灌洗次数3-5次。回收的灌洗液4℃，1500rpm离心10分钟，回收上清置于-20℃等待进行细胞因子检测；用1ml含有1％bsa的pbs重悬细胞沉淀，取10μl重悬液进行细胞计数。应用血细胞分析仪进行分析。结果见图7。由图7可见，与假手术组相比，给予博莱霉素后小鼠肺泡灌洗液中总白细胞数量、单核细胞数量、嗜碱性粒细胞数量、嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量极其显著性升高。pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3给药后及阳性对照药吡非尼酮均能不同程度的减少肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中上述炎症细胞数量。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

实施例6肺纤维化病理评价

1、博莱霉素所致肺纤维化病理形态学分析

he染色法，即苏木素-伊红染色法。苏木素染液为碱性染液，重要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。一般的组织变化和组织产物都可以通过这一染色法显示出来，是形态学最常用的染色方法。

取实验动物右侧下叶肺组织，4％多聚甲醛固定后石蜡包埋。在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片，he染色观察基本病理改变，结果见图8。其中，a为假手术组，b为模型组，c为pep2-pa1组，d为pep2-pa2组，e为pep2-pa3组，f为阳性对照药吡非尼酮组。从图8可见，假手术小鼠肺部he染色组织清晰可见，肺泡结构完整，未见炎症和纤维化病理改变。pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3给药后均能减轻博莱霉素所引起的肺部炎症，并有效改善肺损伤，恢复肺部正常结构。特别是pep2-pa1组，肺部炎症基本消失，肺组织结构较为清晰。

根据he染色的结果进行炎性分级观察，标准如下(0-5级)：0级：正常组织。1级：极小的炎症改变。2级：轻微到中等的炎症改变，没有明显的肺组织结构的破坏。3级：中等程度的炎症损伤(肺泡膈膜增厚)。4级：中等程度要重度的炎症损伤，形成组织团块，或者局限性肺炎区域破坏肺组织正常结构。5：严重的炎症损伤，局部区域肺组织结构严重破坏引起管腔闭合等。图9为病例分析炎性分级结果，从图9可见，与假手术组相比，给予博莱霉素后小鼠肺部出现显著炎症。给予pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3以及阳性对照药吡非尼酮可以显著降低博莱霉素所引起的肺部炎症。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

2、天狼星红特殊染色病理影像学分析

天狼星红可以特异性的对纤维化胶原进行染色，是常用的组织切片的特殊染色方法。

取动物右侧下叶肺组织，4％多聚甲醛固定后石蜡包埋。在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片，天狼星红染色观察纤维化状况。应用高清晰素彩色病理图文分析系统spotadvanced3.0获得高清晰的天狼星红特殊染色的病理图片(200倍)。使用image-proplus5.1测量出每个视野天狼星红染色后的胶原的着色面积、视野下肺组织面积。以着色面积、着色面积与视野肺组织面积比表示该胶原的相对含量。博莱霉素所致肺纤维化实验中每组分析10个标本，每个标本随机取6个视野，取均值代表一个动物胶原组织在肺组织内的相对含量和表达强度。通过参数方差分析比较各组“视野下胶原绝对面积”。结果见图10和图11，a为假手术组，b为模型组，c为pep2-pa1组，d为pep2-pa2组，e为pep2-pa3组，f为阳性对照药吡非尼酮组。从图10和11可见，假手术小鼠肺部天狼星红染色未见明显胶原着色。给予博莱霉素后小鼠肺脏出现明显胶原堆积，大量纤维化组织形成。给予pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3可以减轻博莱霉素所引起的肺部胶原堆积，改善肺纤维化。##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

实施例7肺纤维化小鼠的肺功能评价

肺功能是临床检测患者肺纤维化的金指标。肺功能的下降往往伴随着纤维化的加剧，而肺功能的改善往往也代表了肺部组织结构的恢复。

将实施例1所得肺纤维化模型小鼠通过戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，通过flexivent小动物肺功能仪进行肺功能检测，检测方法为tlc，snapshots，(检测方法请参见：lvx,wangx,lik,etal.rupatadineprotectsagainstpulmonaryfibrosisbyattenuatingpaf-mediatedsenescenceinrodents[j].plosone,2013,8(7):e68631.)。

检测结果见图12，其中a为深吸气量，b为动态阻力，c为动态弹性，d为动态顺应性。从图12可见，与假手术组相比，博莱霉素所诱导肺纤维化小鼠深吸气量明显降低，肺部动态阻力及动态弹性上升，顺应性显著降低。经过pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3治疗后肺功能显著恢复。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

实施例8肺纤维化小鼠羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此通过羟脯氨酸检测胶原蛋白的含量。检测动物左肺全叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。具体方法如下：取实施例1制备所得模型动物的左侧全部肺叶，记录湿重，生理盐水超声匀浆制备成10％的组织匀浆，取约150μl的匀浆上清液，加500μl碱水解液，涡旋混匀后，120度0.1kpa条件下碱水解法处理40min(方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书，略有改动)，调ph值后定容，活性炭处理后取上清。按照说明书(氯胺t法)进行羟脯氨酸测定。结果见图13，从图13可见，与假手术组相比，模型组羟脯氨酸含量及其显著性增高，说明纤维化病理改变严重。pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3给药后可以显著降低纤维化小鼠肺部羟脯氨酸的含量。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

本实验中，通过病理学检查、病理影像学以及其他手段分析结果发现，pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化；显著降低肺纤维化小鼠的死亡率；显著降低肺纤维化小鼠的肺重指数；明显减少肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量；显著降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、胶原含量；显著改善肺纤维化小鼠肺功能。上述实验结果证明，pep2-pa1、pep2-pa2、pep2-pa3在肺纤维化方面具有极好的治疗前景。

实施例9制备tat-pa1、antp-pa1药效学评价肺纤维化动物模型

1.主要试剂及实验动物

实验所用博莱霉素购自日本化药，批号x90147。

吡菲尼酮，购自大连美仑生物科技有限公司，为原料药，吡非尼酮含量>98.5％。

实验中所使用的化合物若无特别说明，均购买自sigma公司。

将序列表seqidno:1(pa1)所示的氨基酸序列的肽段上分别连接细胞穿膜肽hiv-1病毒反转录激活因子(trans-activatortranscription，tat)蛋白的tat肽(ygrkkrrqrrr，其氨基酸序列如seqidno:5所示)、果蝇触角同源异型蛋白的转录因子antp肽(rqikiwfqnrrmkwkk，其氨基酸序列如seqidno:6所示)，组成新的衍生物tat-pa1、antp-pa1，上述多肽或嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。pa1通过两个谷氨酸链连接到tat和antp的c端。以上嵌合肽的序列结构如下：

tat-pa1序列为：

“n”-tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-gly-gly-leu-val-leu-arg-lys-ala-leu-phe-ser-thr-leu-lys-“c”(其序列如序列表中seqidno:13所示)；

antp-pa1序列为：

“n”-arg-gln-ile-lys-ile-trp-phe-gln-asn-arg-arg-met-lys-trp-lys-lys-gly-gly-leu-val-leu-arg-lys-ala-leu-phe-ser-thr-leu-lys-“c”(其序列如序列表中seqidno:14所示)。

实验所用的spf级c57bl/6小鼠(雄性，6～8周龄，16～18g)，购买自中国医学科学院动物所。

2.制备方法同实施例1

将实施例1制备的动物模型在造模10天后分组给药，分组和给药情况如表2所示(i.p.为腹腔注射给药，i.g.为灌胃给药)：

表2.tat-pa1、antp-pa1药效学试验肺纤维化动物模型在造模后的分组给药情况

1、测定小鼠死亡率

从造模后第10天计算，每天统计各组实验动物死亡情况并进行计算，某组动物未出现死亡的生存率计算为100％，某组动物全部死亡的生存率为0％，结果从图14可见。与假手术组对比，模型组生存率显著降低。经过药物治疗后，tat-pa1、antp-pa1给药组均能显著提高纤维化小鼠生存率。##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05。上述实验结果表明本发明所述多肽pa1与公知细胞穿膜肽相连接能够有效降低肺纤维化模型小鼠的死亡率。

2、检测小鼠的肺重指数

精细剥离小鼠肺脏并称取湿重，将肺重(mg)除以小鼠体重(g)得到肺重指数，结果见图15。从图15可见，与假手术组相比，给予博莱霉素后小鼠肺重指数显著升高。tat-pa1、antp-pa1给药后均能显著降低纤维化小鼠肺重指数。其中##为与假手术组相比p<0.01，**为与模型组相比p<0.01。

3、检测小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量

小鼠进行颈部解剖，暴露器官进行插管。pbs灌洗量0.8ml，灌洗次数3-5次。回收的灌洗液4℃，1500rpm离心10分钟，回收上清置于-20℃等待进行细胞因子检测；用1ml含有1％bsa的pbs重悬细胞沉淀，取10μl重悬液进行细胞计数。应用血细胞分析仪进行分析。结果见图16。由图16可见，与假手术组相比，给予博莱霉素后小鼠肺泡灌洗液中总白细胞数量、单核细胞数量、嗜碱性粒细胞数量、嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量极其显著性升高。tat-pa1、antp-pa1给药后能不同程度的减少肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中上述炎症细胞数量。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

4、小鼠肺组织羟脯氨酸检测

取动物的左侧全部肺叶，记录湿重，生理盐水超声匀浆制备成10％的组织匀浆，取约150μl的匀浆上清液，加500μl碱水解液，涡旋混匀后，120度0.1kpa条件下碱水解法处理40min(方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书，略有改动)，调ph值后定容，活性炭处理后取上清。按照说明书(氯胺t法)进行羟脯氨酸测定。结果见图17，从图17可见，与假手术组相比，模型组羟脯氨酸含量及其显著性增高，说明纤维化病理改变严重。tat-pa1、antp-pa1给药后可以显著降低纤维化小鼠肺部羟脯氨酸的含量。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

本实验中，通过实验分析结果发现，tat-pa1、antp-pa1能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化；显著降低肺纤维化小鼠的死亡率；显著降低肺纤维化小鼠的肺重指数；明显减少肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量；显著降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量。上述实验结果证明，tat-pa1、antp-pa1在肺纤维化方面同样具有极好的治疗前景。

实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。病理学分级资料的统计使用卡方检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。

本发明实施例中所用的pbs，即磷酸盐缓冲液，浓度为0.1m，ph值为7.2。

上述实施例结果表明，本发明的多肽或所述多肽的衍生物具有显著的抗肺脏纤维化疾病的作用，可作为活性成份用于制备抗肺纤维化的药物。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

sequencelisting

<110>北京伟峰益民科技有限公司

<120>多肽、其衍生物及其在制备抗肺纤维化的药物中的应用

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<223>果蝇触角同源异型蛋白的转录因子antp肽

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