耐高温糙皮侧耳菌及其筛选方法和应用与流程

本发明属于糙皮侧耳技术领域，具体来说涉及一种耐高温糙皮侧耳菌及其筛选方法和应用。

背景技术：

糙皮侧耳菌(pleurotusostreatus)，属担子菌亚门，侧耳科侧耳属，在我国广泛分布于河北、山东、山西、湖南、湖北、黑龙江、辽宁、四川、贵州等地区，是一种食用菌。糙皮侧耳菌子实体肉质肥嫩，味道鲜美，营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪的食品。糙皮侧耳菌不仅营养价值高，而且具有一定的食疗价值，糙皮侧耳菌子实体能够降低血脂和胆固醇，其多糖不仅有抗肿瘤活性，还可以清除自由基，起到抗氧化作用。目前，一些地区(如湖南、四川等)由于夏季温度过高，缺乏优良的高温型糙皮侧耳菌菌种，导致夏季市场上糙皮侧耳菌数量紧缺，且品质不好，因此，高温型糙皮侧耳菌株的筛选具有一定的研究价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种耐高温糙皮侧耳菌。

本发明的另一目的是提供一种耐高温糙皮侧耳菌的筛选方法。

本发明的另一目的是提供一种耐高温糙皮侧耳菌的出菇方法。

本发明的另一目的是提供一种耐高温糙皮侧耳菌的发酵方法。

本发明的另一目的是提供一种耐高温糙皮侧耳菌获得胞外粗多糖的方法。

本发明的另一目的是提供一种耐高温糙皮侧耳菌获得的胞外粗多糖在清除o2^-.自由基中的应用。

本发明的另一目的是提供一种耐高温糙皮侧耳菌获得的胞外粗多糖在清除.oh自由基中的应用。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种耐高温糙皮侧耳菌，该耐高温糙皮侧耳菌于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc：16378，分类命名为糙皮侧耳pleurotusostreatus。

在上述技术方案中，将耐高温糙皮侧耳菌的1片菌丝体放置在pda培养基上，于30-35℃黑暗条件下生长10-15天，形成的菌落直径为78～82mm，菌丝呈白色，气生菌丝背面呈浅褐色。

上述耐高温糙皮侧耳菌的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1之前，将平菇切成小块组织，得到多块蘑菇组织；

所述蘑菇组织的体积为0.3-0.6cm³。

在将平菇切成小块组织之前，对所述平菇进行表面消毒，所述表面消毒的方法为：用体积浓度为70-75％的乙醇水溶液浸泡90-120s，再用无菌水冲洗4-5遍。

步骤1，将平菇的蘑菇组织放置于筛选培养基上，再将所述筛选培养基于25-28℃恒温培养5-8天，使蘑菇组织长出菌丝，当形成直径1-1.5cm的菌落时，从所述菌落的边缘挑取菌丝，用液态的pda培养基进行倍比稀释，得到第一稀释液，取所述第一稀释液涂布在筛选培养基上，25-28℃恒温培养至形成直径0.5-1cm的菌落，再进行纯培养，纯培养后获得纯化后菌株的菌落；

在所述步骤1中，所述筛选培养基为pda培养基。

在所述步骤1中，当蘑菇组织放置于筛选培养基上时，所述蘑菇组织的切面面向所述筛选培养基。

在所述步骤1中，所述纯培养的方法为重复以下步骤4～5次：从菌落的边缘挑取菌丝，用液态的pda培养基倍比稀释2、4、8和16倍，得到第二稀释液，取0.5-1ml第二稀释液涂布在筛选培养基上，25-28℃恒温培养至形成直径0.5-1cm的菌落。

步骤2，耐高温菌株的初筛

对每株纯化后菌株的菌落进行如下操作：从所述纯化后菌株的菌落中取菌块并接种到培养基上，25-28℃恒温培养10-15天形成第一菌落，在所述第一菌落上取多个菌块，将从所述第一菌落上取到的菌块各接种到1个筛选培养基上并分别置于32℃以上、38℃以下的温度恒温培养，挑选在培养14天后菌落直径超过4cm的菌株作为初筛菌株；

在所述步骤2中，在所述第一菌落上取多个菌块的方法为：以所述第一菌落的接种点为中心，在半径为2cm的圆周上取4～8个菌块；

步骤3，耐高温菌株的复筛

对每株初筛菌株进行以下操作：在该株初筛菌株上取菌块后接种到培养基上，25-28℃恒温培养10-15天形成第二菌落，在所述第二菌落上取菌块；将第二菌落取得的菌块接种至培养基并在40℃培养6小时；再置于25-28℃恢复培养7-10天，测量菌落直径，当菌落仍生长时该菌株为耐高温糙皮侧耳菌。

在上述技术方案中，所述筛选培养基为pda培养基，所述培养基为pda培养基。

在上述技术方案中，所述pda培养基制备方法为：将180-220质量份数的马铃薯块与950-980体积份数的水混合，加热至沸腾并维持沸腾20-30min，趁热过滤，滤渣弃取，获得滤液，在滤液中加入15-25质量份数的葡萄糖和20-25质量份数的琼脂，加热融化后定容至1000体积份数，ph值自然。

在上述技术方案中，当体积份数的单位为ml时，质量份数的单位为g。

上述耐高温糙皮侧耳菌的出菇方法，包括以下步骤：将耐高温糙皮侧耳菌接种至出菇培养基上，于30-35℃培养20-28天。

在上述技术方案中，所述出菇培养基的制备方法为：将玉米芯、棉籽壳、木屑、麦麸、豆饼粉和水混拌均匀后发酵10-15天，得到所述出菇培养基，灭菌后使用，其中，每100g出菇培养基由30-60g玉米芯、15-25g棉籽壳、15-25g木屑、5-15g麦麸、2-8g豆饼粉和65-70g水配制而成。

上述耐高温糙皮侧耳菌的发酵方法，包括以下步骤：

a)无菌条件下，取耐高温糙皮侧耳菌的菌丝体接种至种子培养基上，于30-35℃恒温且湿度自然的摇床中培养96-120h，得到种液；

b)无菌条件下，按2-7％的接种量将步骤a)所得种液接种到发酵培养基上，于28-32℃恒温且湿度自然的摇床中培养10-15天，得到发酵液。

在上述技术方案中，所述摇床的转速为150-190rpm/min，所述湿度自然为相对湿度30-60％。

在上述技术方案中，所述种子培养基的制备方法：将5-15质量份数的麸皮和10-30质量份数的豆饼粉混合，用定容溶液定容至1000体积份数，灭菌后使用，其中，所述定容溶液为水、磷酸二氢钾和七水硫酸镁的混合溶液，所述定容溶液中磷酸二氢钾的浓度为1.5-4.5g/l，七水硫酸镁的浓度为0.5-2.5g/l，当体积份数的单位为ml时，质量份数的单位为g。

在上述技术方案中，所述发酵培养基的制备方法：将25-60质量份数的麦芽糊精、10-25质量份数的甘油、40-60质量份数的酵母蛋白胨、1.5-4.5质量份数的磷酸二氢钾、0.5-2.5质量份数的七水硫酸镁、1-3质量份数的磷酸二氢铵、0.3-1.5质量份数的半胱氨酸、1.5-3.5质量份数的蛋氨酸和0.00005-0.001质量份数的维生素b1混匀，用去离子水定容至1000体积份数，灭菌后使用。

在上述技术方案中，所述发酵液中胞外粗多糖的含量为3g/l，总糖含量为2.4g/l。

所述耐高温糙皮侧耳菌获得胞外粗多糖的方法，包括以下步骤：将所述发酵液离心10-20min，弃沉淀，将上层清液加入等体积无水乙醇，在22-27℃下醇析16-24h，过滤收集沉淀为胞外粗多糖。

在上述技术方案中，离心速度为3000-6000rmp/min。

由所述耐高温糙皮侧耳菌获得的胞外粗多糖在清除o2^-.自由基中的应用。

在上述技术方案中，将所述胞外粗多糖与水混合，配置成多糖水溶液，当多糖水溶液中胞外粗多糖质量浓度达到0.45mg/ml时，o2^-.清除率为(31.53±1.89)％。

由所述耐高温糙皮侧耳菌获得的胞外粗多糖在清除.oh自由基中的应用。

在上述技术方案中，将所述胞外粗多糖与水混合，配置成多糖水溶液，当多糖水溶液中胞外粗多糖质量浓度达到0.45mg/ml时，.oh清除率为(22.81±1.27)％。

本发明的有益效果如下：该糙皮侧耳菌具有较好的耐高温能力，在32℃下培养生长良好，为夏季市场提供优良品种。该糙皮侧耳菌发酵液中含有丰富的胞外粗多糖，这些胞外粗多糖具有较强的抗氧化能力，其发酵液在抗氧化应用中也具有良好的前景。

附图说明

图1为rsl-hm2菌株的菌落形态特征；

图2为rsl-hm2菌株的菌丝体的显微图像；

图3为rsl-hm2菌株的出菇后照片；

图4为葡萄糖标准曲线；

图5为rsl-hm2菌株发酵液的多糖清除自由基能力。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，从生物化学及相关书籍中所记载的方法中可查阅。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，试剂为化学纯级别，不指定生产厂家。

磷酸缓冲液中，甲液为磷酸氢二钠，乙液为磷酸二氢钠。

下述实施例中使用的生化培养箱为上海跃进spx-150-ii，摇床为天津欧诺hny-2102，分光光度计为普析紫外分光光度计，tu-1901。

pda培养基制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块(马铃薯块)放入锅中，加水980ml，在加热器上加热至沸腾并维持沸腾30min，倒入量杯中，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，获得滤液。在滤液中加入葡萄糖20g和琼脂25g，加热融化后定容至1000ml，ph值自然，121±1℃高温高压灭菌30min后倒平板备用。

在下述实施例中，高温高压灭菌的压力约为0.1mpa。湿度自然时的湿度为30％左右。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

本发明的耐高温糙皮侧耳菌于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc：16378，分类命名为糙皮侧耳pleurotusostreatus，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述耐高温糙皮侧耳菌的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，将采自四川省成都市的10株野生健康、色泽良好的平菇在流水下冲洗干净，再进行表面消毒，表面消毒的方法为：用体积浓度为75％的乙醇水溶液浸泡90s，再用无菌水冲洗4-5遍。在无菌的培养皿上将平菇切成0.3-0.6cm³的小块组织，切后每株平菇获得5块蘑菇组织，10株平菇共获得50块蘑菇组织。

步骤1，准备10个放置有筛选培养基的培养皿，将蘑菇组织用无菌镊子放置于筛选培养基的表面且蘑菇组织的切面面向筛选培养基，其中，每个培养皿的筛选培养基上放5块蘑菇组织。将筛选培养基置于26℃恒温培养，经过5-8d，观察每块蘑菇组织长出菌丝的情况，当形成直径1cm的菌落时，从菌落的边缘挑取菌丝，用灭菌的液态pda培养基倍比稀释2、4、8和16倍，得到第一稀释液，取0.5ml第一稀释液涂布在筛选培养基上，26℃恒温培养至形成直径0.5cm的菌落，再重复以下步骤5次进行纯培养：从菌落的边缘挑取菌丝，用灭菌的液态pda培养基倍比稀释2、4、8和16倍，得到第二稀释液，取0.5ml第二稀释液涂布在筛选培养基上，26℃恒温培养至形成直径0.5cm的菌落。纯培养后获得35株纯化后菌株的菌落保存在茄型瓶中，其中，筛选培养基为pda培养基。

步骤2，耐高温菌株的初筛

对每株纯化后菌株的菌落进行如下操作：用无菌铲从茄型瓶纯化后菌株的菌落中取0.5-1cm³的菌块接种到pda培养基上，26℃恒温培养14天形成铺满pda培养基的第一菌落，在第一菌落上以接种点为中心，在半径为2cm的圆周上取6个0.5-1cm³的菌块，将从第一菌落上取到的6个菌块各接种到1个筛选培养基上并分别置于不同的温度恒温培养，6个筛选培养基恒温培养的温度依次为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃和38℃(28℃和30℃的情况用于对比)，每天观察菌块上菌丝的生长情况，测量并记录菌落直径，挑选在32℃以上培养14天后菌落直径超过4cm的菌株作为初筛菌株，得到5株初筛菌株，如表1所示，将5株初筛菌株依次命名为rsl-hm1、rsl-hm2、rsl-hm3、rsl-hm4和rsl-hm5。其中，筛选培养基为pda培养基。

表1

注：“++++”菌落整齐，菌丝浓密；“+++”菌落整齐，菌丝较密；“++”菌丝稀疏；“+”有生长；“-”无生长。

步骤3，耐高温菌株的复筛

对每株初筛菌株进行以下操作：用无菌铲在该株初筛菌株的菌落上取0.5-1cm³的菌块后接种到pda培养基上，26℃恒温培养15天形成铺满pda培养基的第二菌落，在第二菌落上以接种点为中心，在半径为2cm的圆周上取6个0.5-1cm³的菌块；将第二菌落取得的6个菌块各接种至1个培养基并置于不同的培养环境下培养，培养环境依次为：在38℃培养2小时、在38℃培养4小时、在38℃培养6小时、在40℃培养2小时、在40℃培养4小时和在40℃培养6小时；置于不同的培养环境下培养后再置于26℃恢复培养7天，测量菌落直径，如表2所示，选取在培养环境为40℃培养6小时后再置于26℃恢复培养7天，菌落仍能生长的菌株为耐高温糙皮侧耳菌，在本实施例中，rsl-hm2菌株在40℃培养6小时后再置于26℃恢复培养7天仍有生长，其它条件处理后的生长状态也优于其它菌株，说明该菌株具有很强的耐热性。

表2

rsl-hm2的培养与形态鉴定

1.耐高温rsl-hm2的培养

试管传代：无菌条件下，从pda培养基上取出1片rsl-hm2菌株的菌丝体置于1支试管的斜面培养基上，置于32℃培养箱中培养15天，待菌丝长满整个斜面培养基的表面后，置于冰箱中于4℃保藏备用。

茄形瓶传代：无菌条件下，从试管的斜面培养基上取出1片菌丝体置于1支茄形瓶的斜面培养基上，置于32℃培养箱中，培养15天待菌丝长满整个斜面培养基的表面后，置于4℃冰箱中保藏备用。

斜面培养基的制备方法为：取200g去皮马铃薯，切成小块放入锅中，加980ml水，在加热器上加热至沸腾，维持20min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液中加入20g葡萄糖和25g琼脂，加热融化后定容至1000ml，ph值自然，以相应的7ml/试管或70ml/茄瓶装量分装于试管或茄瓶中，塞上胶塞，121±1℃高温高压灭菌30分钟后铺斜面备用。

rsl-hm2菌株在pda培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上生长较快，1片菌丝体于32℃黑暗条件下生长10天，菌落直径在80mm左右，菌丝呈白色，气生菌丝茂盛且背面呈浅褐色，其菌落形态如图1所示。显微镜下观察菌丝呈中心密实团状，分支菌丝短、粗壮，去甲基蓝染色照片参见图2。

2.耐高温rsl-hm2的出菇试验

出菇培养：无菌条件下，将rsl-hm2菌株接种至蓝盖瓶中的出菇培养基上，置于32℃培养箱中，培养25天。rsl-hm2菌株在蓝盖瓶内长出菌丝后出菌菇，菌株出菇形态参见图3。

出菇培养基：每100g出菇培养基由50g玉米芯、20g棉籽壳、20g木屑、10g麦麸、6g豆饼粉和70g水配制而成，配置方法为：按照上述比例，将玉米芯、棉籽壳、木屑、麦麸、豆饼粉和水混拌均匀后发酵10天(每天24小时)，得到出菇培养基，取60g出菇培养基分装于100ml容量瓶中，于121±1℃高温高压灭菌60分钟，冷却后待用。

rsl-hm2多糖的提取及抗氧化性

1.耐高温糙皮侧耳菌(rsl-hm2菌株)的发酵方法，包括以下步骤：

a)种子瓶的培养：无菌条件下，使用无菌接种铲取rsl-hm2菌株的3个菌丝体(0.5-1cm²)接种至种子培养基上，于32℃恒温且湿度自然(湿度为30％)的摇床中培养96h，得到种液，其中，摇床转速为150rpm/min。

种子培养基的制备方法：将10g麸皮和20g豆饼粉分别称至1000ml三角瓶中，用定容溶液定容至1000ml，用量筒精确量取300ml分装于1l摇瓶中，盖上4层本白布，121±1℃高温高压灭菌30分钟，冷却后待用，其中，定容溶液为水、磷酸二氢钾和七水硫酸镁的混合溶液，定容溶液中磷酸二氢钾的浓度为3.5g/l，七水硫酸镁的浓度为2g/l。

b)发酵培养：无菌条件下，用移液管按5％接种量将种液接种到发酵瓶中的发酵培养基上，于30℃恒温且湿度自然摇床中培养14d，得到发酵液，其中，摇床转速为150rpm/min。

发酵培养基的制备方法：将45g麦芽糊精、20g甘油、50g酵母蛋白胨、4g磷酸二氢钾、2g七水硫酸镁、1g磷酸二氢铵、1g半胱氨酸、1g蛋氨酸和1mg维生素b1混匀，用去离子水定容至1000ml，用量筒精确量取150ml分装于500ml三角瓶中，盖上四层本白布，121±1℃高温高压灭菌30分钟，冷却后待用。

2.获得发酵液的粗多糖

取发酵液，在4000rmp/min离心10min，弃沉淀，上层清液加入等体积无水乙醇，在25℃下醇析18h，过滤收集沉淀为胞外粗多糖，将胞外粗多糖于-10℃真空干燥，称重，获得胞外粗多糖干重。按下式计算胞外粗多糖产量：

胞外粗多糖产量(g/l)＝胞外粗多糖干重(g)/发酵液的体积(l)×1000

经计算，rsl-hm2菌株的发酵液中胞外粗多糖的含量为3g/l。

3.rsl-hm2发酵液总糖含量的测定

(1)标准曲线绘制

分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的葡萄糖标准溶液(溶剂为水，葡萄糖浓度为1g/l)至25ml具塞比色管中，加蒸馏水补至1.0ml,再加入1.0ml苯酚水溶液(苯酚体积浓度为5％)，然后快速加入5.0ml浓硫酸(与液面垂直加入，避免贴壁，以便与具塞比色管中的液体充分反应)，静置10min。充分混合后于30℃水浴反应20min,490nm下测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定葡萄糖标准曲线，如图4所示，由葡萄糖标准曲线获得线性回归方程为y＝0.0111x-0.0098，r²＝0.9971。

(2)样品测定

准备作为样品的发酵液，用水将样品稀释至不同倍数(20-200倍之间)，得到样品溶液，吸取1.0ml样品溶液于25ml具塞试管中，再加入1.0ml的苯酚水溶液(苯酚体积浓度为5％)，然后快速加入5.0ml浓硫酸，静置10min。充分混合后于30℃水浴反应20min,490nm下测定吸光度。

空白对照：吸取1.0ml纯水于25ml具塞试管中，向纯水中加入1.0ml的苯酚水溶液(苯酚体积浓度为5％)，然后快速加入5.0ml浓硫酸，静置10min。充分混合后于30℃水浴反应20min,490nm下测定吸光度。

将样品溶液的吸光度代入葡萄糖标准曲线的线性回归方程中，计算得到该样品溶液中葡萄糖量。

总糖含量以葡萄糖量计，按下式计算：

稀释倍数为样品稀释倍数

式中：c—样品溶液中总糖含量，mg/l；

m—样品溶液测得的葡萄糖量，μg；

v—样品溶液的体积，ml

求得稀释不同倍数的样品溶液的总糖含量，求平均值。

经计算，rsl-hm2菌株发酵液中总糖含量为2.4g/l，胞外粗多糖中总糖含量约为80％。

4.rsl-hm2菌株多糖的抗氧化实验

(1)rsl-hm2多糖清除o2^-.自由基的测定

准备不同胞外粗多糖浓度的待测样品：将rsl-hm2菌株的胞外粗多糖分别配制成0.15mg/ml、0.20mg/ml、0.25mg/ml、0.30mg/ml、0.35mg/ml、0.40mg/ml和0.45mg/ml不同质量浓度的多糖水溶液。针对每个浓度的多糖水溶液进行如下操作：吸取2.4ml62.5mmol/l磷酸钠缓冲液(ph7.8)(溶剂为水)，加入0.20ml0.06mmol/l核黄素水溶液、0.20ml30mmol/l蛋氨酸水溶液、0.10ml0.003mmol/l乙二胺四乙酸(edta)水溶液、0.050ml多糖水溶液和0.20ml1.125mmol/lnbt(氯化硝基四氮唑蓝)水溶液(现配现用)。

空白样：用磷酸钠缓冲液代替待测样品中的多糖水溶液做空白样，用于对照。

将待测样品和空白样在4000lx日光下各自反应25min，于560nm下测定吸光值，重复3次，求平均值。以清除百分率(％)表示：

o2^-.清除率＝[a(空白样)-a(待测样品)]/a(空白样)×100％

a(空白样)为空白样的吸光度的平均值，a(待测样品)为待测样品的吸光度的平均值。

经分离后的0.15-0.45mg/ml的rsl-hm2菌株的胞外粗多糖对o2^-.有较好的清除效果(耐高温糙皮侧耳菌的胞外粗多糖能够提高o2^-.自由基的清除率)，且随着多糖水溶液中胞外粗多糖质量浓度的升高，清除率逐渐加大，结果参见图5，当多糖水溶液中胞外粗多糖浓度达到0.45mg/ml时，o2^-.清除率为(31.53±1.89)％。

(2)rsl-hm2多糖清除.oh自由基的测定

将rsl-hm2菌株的胞外粗多糖分别配制成0.15mg/ml、0.20mg/ml、0.25mg/ml、0.30mg/ml、0.35mg/ml、0.40mg/ml和0.45mg/ml不同质量浓度的多糖水溶液。取0.20ml的feso4-edta混合水溶液(feso4和edta的摩尔比为1:1，feso4的浓度为10mmol/l)于试管中，加入0.50ml的α-脱氧核糖水溶液(10mmol/l)，然后再加入0.05ml多糖水溶液，并用磷酸缓冲液(ph7.4，0.1mol/l)定容至1.8ml，最后加入0.20ml的h2o2水溶液(10mmol/l)，混匀后于37℃水浴中恒温保持1h，然后再加入1.00ml2.8％(w/w)三氯乙酸(tca)水溶液、1.00ml1.0％(w/w)硫代巴比妥酸(tba)水溶液，混匀后沸水浴中加热15min，冷却至室温20～25℃后用分光光度计在波长532nm处测其吸光值as，不加多糖水溶液时吸光值ac，空白样品以磷酸缓冲液(ph7.4，0.1mol/l)代替多糖水溶液且其测得的吸光值以ao表示，则多糖水溶液自由基清除能力(scavengingactivitysa)可表示为：

sa(％)＝[1-(as-ao)/(ac-ao)]×100

经分离后的rsl-hm2菌株的胞外粗多糖对.oh有较好的清除效果(耐高温糙皮侧耳菌的胞外粗多糖能够提高.oh自由基的清除率)，且随着多糖水溶液中胞外粗多糖质量浓度的升高，由0.15-0.45mg/ml，清除率逐渐加大，结果参见图5，当多糖水溶液中胞外粗多糖质量浓度达到0.45mg/ml时，.oh清除率为(22.81±1.27)％。

综上所述，由本发明rsl-hm2菌株的获得的胞外粗多糖具有较高的清除自由基能力。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。