一种以水华蓝藻为原料制备生物乙醇的方法与流程

本发明属于生物能源技术和环境保护领域，特别是涉及一种利用水华蓝藻通过再培养后制备生物乙醇的方法。

背景技术：

近几十年来，湖泊富营养化问题日益严重，导致蓝藻大量繁殖，灾害性水华频发，对湖泊功能和生态系统造成严重威胁。打捞是短时间内消除蓝藻水华威胁的应急清除技术，也是目前国内蓝藻水华治理的主要方法，在我国富营养化湖泊，如太湖、滇池、巢湖等，被常态化使用。以太湖为例，2007~2015年太湖周边城市共打捞藻水8.5×10⁶m³（含藻率0.5%）,相当于清除蓝藻干物质4.25×10⁴t。打捞上岸的藻水通过沉降和气浮两道工序后，体积大大缩小，但仍然需要及时、有效地无害化处理，防止因藻类腐败产生严重的二次环境污染。

针对打捞蓝藻最有效的处理手段是资源化或能源化利用,从而变废为宝，发挥社会、资源作用和经济价值，有利于打捞蓝藻工作的持续进行。目前蓝藻资源化综合利用主要有以下几种方式：生产有机肥料,作为农田有机肥料；开发蓝藻添加剂，添加到各类饲料、饵料中；提取藻蓝蛋白、色素、胞外多糖等经济成分，但由于藻毒素的存在，上述资源化方法在实际应用难以推广。在藻类能源化方面，目前国内外已经广泛开展利用微藻制备柴油、乙醇、氢气等生物燃料的研究。然而，绝大多数研究采用人工培养的微藻，培养过程包括生物量增加阶段和脂类/糖类积累阶段，期间需要消耗大量人力、物力和能量，导致成本过高，且能够用于生产生物燃料的微藻种类多集中在绿藻、金藻、藻等，而蓝藻脂类（<10%）和糖类（10%~20%）含量偏低，普遍认为不适合作为生产生物燃料的原料。专利cn102242065a《一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用》构建了cesa基因缺失的蓝藻，其纤维素含量由占细胞壁干重的2%提高至13%，但纤维素仅占蓝藻总糖的很小比例。转基因藻的应用仍然面临问题和挑战，如能进行特定功能基因修饰的微藻种类少，基因工程藻规模化培养仍缺乏应用实例，并且其生物安全性缺乏评价，监管体系尚不完善等。

在我国，富营养湖库发生的水华主要是蓝藻水华。蓝藻水华暴发时生物量十分巨大，直接利用打捞上岸的水华蓝藻生产生物质乙醇能够节省微藻培养过程中生物量增加阶段，从而大幅度削减培养成本。然而，目前该领域相关技术仍然处于空白中，这是由于野外蓝藻脂类和糖类含量较人工培养的蓝藻更低，如从太湖打捞出来的蓝藻脂类含量低于1%，糖类含量低于10%，因此直接将其作为生产生物燃料的原料不具可行性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种采用再培养水华蓝藻，利用管式超滤膜收集高浓度藻液用于水解、发酵制备生物乙醇的方法，该方法直接利用水华蓝藻，显著提升水华蓝藻的糖含量和生物可利用性，从而增加了生物乙醇的产率，同时也大大简化了工艺流程。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种以水华蓝藻为原料制备生物乙醇的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：打捞和收集水华蓝藻，去除肉眼可见的杂质；

步骤2：收集步骤1的水华蓝藻接种至光生物反应器中，调节湖水并补充无机氮和无机磷，调整氮磷比为20-1:1，并添加0.01-0.05‰光合作用促进剂和1-3‰代谢干扰剂；通入空气补充无机碳源，进行再培养；

步骤3：收集经步骤2培养的水华蓝藻，利用管式超滤膜过滤浓缩形成含水率90-98%的浓藻液，低温干燥备用；

步骤4：步骤3的藻粉加入1-3mol/l的盐酸，藻粉浓度20-200g/l，在110-122℃水解20-30min，得到含有还原糖的水解液；

步骤5：步骤4的水解液调节至ph=6-7，按照每1g藻粉加入120-150ml酿酒酵母的接种量，混合均匀，以100-200r/min的速度在35-38℃下发酵48-72h，制得生物乙醇。

所述无机氮为nano3、kno3或nh4cl；无机磷为k2hpo3。

所述的通入空气补充无机碳源为光周期，利用气泵连续供给空气补充co2，流速为2-20l/min。

所述进行再培养条件为：光照3500-8000lx，光暗周期12h-20h:12h-4h，温度28-35℃。

步骤3所述收集经步骤2培养的水华蓝藻为培养至糖含量占其干重的至少50%，方可收集；所述低温干燥为温度20-50℃，时间为24-48h。

所述光合作用促进剂为氯化胆碱、氯化铁或氯化镧；代谢干扰剂为水杨酸、氯化钠、乙烯或氯化锌。

所述的水解液ph值调节采用naoh固体。

具体地，所述的酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号cicc33068。用接种环挑取一环酵母菌体，接入到装有经121℃高温灭菌20min的250mlypg液体培养基的500ml锥形瓶中，放置于恒温摇床，调节温度在30℃，在150r/min条件下震荡培养24-48h。接种到发酵培养基前，取相应体积（45ml）种子液4000r/min离心3min，倒掉上清液，加入纯水摇匀，离心倒掉上清液，重复上述步骤2次。接种菌泥到发酵瓶中。酵母种子培养基ypg：胰蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l。

具体地，所述的发酵在密闭容器内进行，但不需要顶空和脱氧处理。

本发明的有益效果是：

1）水华期间，机械打捞是及时清除蓝藻的有效手段，收集的大量蓝藻急需处理以避免对环境的二次污染，对其资源化利用是最为经济的方式。本发明采用水华蓝藻为原料，一举两得，即解决了生态和环境问题，又解决了能源问题。

2）本发明节省了微藻扩大培养阶段，仅保留糖积累阶段，大大缩短了藻源性糖的生产周期，有效减少了培养成本。

3）再培养阶段通过加光合作用促进剂和代谢干扰剂的方法，调控光合作用和糖代谢过程，可以明显提高糖含量，增加最终产物生物乙醇的产率。

附图说明

图1为本发明流程图。

具体实施方式

下面结合几个具体的实施例，对本发明所述方法做进一步的说明。

实施例1

打捞和收集太湖杨湾区域水华暴发时的蓝藻，其绝对优势种是微囊藻，去除肉眼可见的杂质。将收集的水华蓝藻接种至光生物反应器，添加太湖湖水，使得叶绿素浓度为2-4mg/l，添加nano3和k2hpo3，置于6000lx，28℃下培养。定期测定干重和可溶性总糖产量，计算糖含量；测定藻细胞内含物的化学需氧量（cod）和生化需氧量（bod），计算bod/cod用于表征其可生化性。

氮磷比10:1条件下，加入0.01-0.05‰光合作用促进剂和1-3‰代谢干扰剂，干重由0.527g/l增加至1.758g/l，可溶性总糖由33.7mg/l增加至995.6mg/l。相较于未培养水华蓝藻，再培养水华蓝藻可溶性总糖含量由6.4%增加至56.6%，bod/cod由0.39增加至0.86，从而显著提升水华蓝藻的糖含量和生物可利用性。

实施例2

将1.2g经再培养的藻粉直接溶于40ml2mol/l的盐酸溶液中，制成30g/l的藻液。121℃高温水解30min，水解液经0.45μm滤膜过滤。测定水解前后可溶性总糖和还原糖的变化。经再培养的藻粉水解前可溶性总糖和还原糖分别为17.0g/l和1.9g/l，分别占干重的56.6%和6.4%；水解后分别为17.9g/l和17.3g/l，分别占干重的59.8%和57.5%。水解后，还原糖占总糖的比例由10.9%上升至96.2%。

同时将未经再培养的藻粉置于同样条件下处理，发现其水解前可溶性总糖和还原糖分别为1.9g/l和1.2g/l，分别占干重的6.2%和4%，水解后分别为2.1g/l和2.0g/l，分别占干重的6.9%和6.7%，远低于再培养藻粉。

实施例3

水解液naoh固体调节至ph=6.5。当培养的酵母菌od值约为2时，4000r/min离心3min，倒掉上清液，加入纯水摇匀，离心倒掉上清液，重复2次。按照每1g藻粉加入150ml酿酒酵母（od值约为2）的接种量，即50ml30g/l藻液接种225ml酵母量。水解液加入100ml密闭样品瓶，以150r/min的速度在35℃下发酵48h。将发酵液经0.22μm有机系滤膜过滤，取5ml滤液于20ml顶空进样瓶密闭，采样顶空气相色谱法测定乙醇含量。

30g/l经过再培养的藻粉产生生物乙醇浓度6.52g/l，乙醇产率21.7%，而30g/l未经再培养的藻粉产生生物乙醇浓度仅为0.85g/l，乙醇产率为2.8%。再培养的藻粉的乙醇产率显著提升。

实施例4

采集太湖不同区域（杨湾、沙渚等）水华蓝藻，共计4个采样点，按照实施例1、2、3所述的方法进行再培养、水解和发酵。经再培养的藻粉可溶性总糖分别占干重的48.5%、58.9%、54.2%和55.5%；水解后，可溶性总糖分别占干重的50.8%、61.0%、56.5%和59.8%，还原单糖占可溶性总糖的98.7%、99.2%、96.2%和96.0%。30g/l藻粉发酵后乙醇浓度分别为6.01g/l、6.73g/l、5.79g/l和7.07g/l，乙醇产率分别为20%、22.3%、19.3%和23.5%。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明的保护范围。