一种提高蛋白表达的融合标签蛋白及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种提高蛋白表达的融合标签蛋白及其应用。

背景技术：

功能型蛋白质在生物医药领域发挥重要作用，占有重要地位，是科研和工业生产的重要材料。但自然条件下大部分蛋白质的表达量较小，异源基因在大肠杆菌中的表达难以获得足够量和高活性的蛋白以满足大规模生产的需求，且容易产生蛋白表达后容易降解，表达的外源蛋白对宿主细胞有毒性，形成大量包涵体等问题。

有许多方法可以提高蛋白可溶性，其中重组蛋白表达技术不仅可以快捷方便的生产及获取蛋白质而且可以大大降低生产蛋白质的成本。多个用于表达重组蛋白的系统中，大肠杆菌表达系统因其遗传背景清晰、繁殖周期短、操作便捷、成本低、产量高的优点，成为了当今使用最为广泛的一个表达系统。但在大肠杆菌表达系统表达某些真核生物的蛋白时，存在可溶蛋白不表达或者表达量低的问题，极大的限制了科学研究的推进。因此，使用融合标签表达重组蛋白的技术应时而生，它的应用不仅便于重组蛋白的分离纯化，而且具有促进蛋白表达，介导蛋白正确折叠、增加蛋白稳定性等作用。目前已开发出的一系列常见的融合标签，有小分子泛素样修饰蛋白(sumo)、谷胱甘肽转移酶(gst)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、转录终止抗终止因子(nusa)等，但是其各有所长的同时，也都具有其局限性，没有一种通用的融合标签能解决所有蛋白的可溶性问题。综上所述，本领域迫切需要寻找更佳的助溶蛋白标签和融合蛋白表达载体，实现目的蛋白的大量表达和溶解。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服现有技术手段的不足，而提供一种提高蛋白表达的融合标签蛋白及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种提高蛋白表达的融合标签蛋白，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

蛋白质(a)：由seqidno.1所示氨基酸序列组成的蛋白质，称之为fj1；

蛋白质(b)：seqidno.1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与seqidno.1所示氨基酸序列具有80％以上的同源性，且能够与目的蛋白融合同时还能够提高目的蛋白表达的由蛋白质(a)衍生的蛋白质。

所述融合标签蛋白来自于gramellaforsetii。

本发明提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述融合标签蛋白。

进一步，提供一种提高蛋白表达的融合标签蛋白基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。称之为fj1基因。所述fj1基因编码fj1蛋白。

本发明公开了来源于gramellaforsetii的编码fj1蛋白的基因作为异源基因在大肠杆菌中进行蛋白表达的融合标签的用途。

本发明提供一种提高蛋白表达的融合蛋白，包括目的蛋白与所述融合标签蛋白。

进一步地，所述融合蛋白还可包括不同于所述融合标签蛋白的其他融合标签蛋白。

所述其他融合标签蛋白包括小分子泛素样修饰蛋白(sumo)、谷胱甘肽转移酶(gst)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、转录终止抗终止因子(nusa)等。

所述目的蛋白没有特殊限定，本发明实施例中以lysyl-trnasynthetase(mycobacteriumtuberculosis)蛋白作为目的蛋白进行试验论证。

本发明提供一种重组载体，包括表达载体，所述表达载体上插入有fj1基因，所述fj1基因核苷酸序列如seqidno.2所示，所述表达载体优选为pet22b(+)。

本发明提供一种所述重组载体的合成方法，将fj1基因克隆到表达载体的ndeⅰ与xhoⅰ酶切位点之间，构成重组载体；所述fj1基因核苷酸序列如seqidno.2所示，所述表达载体优选为pet22b(+)。

本发明提供一种利用融合标签蛋白促进目的蛋白可溶性表达的方法，包括以下步骤：构建上述重组载体，将目的蛋白的基因片段克隆到上述重组载体上，然后将带有目的蛋白基因片段的重组载体转化到表达宿主中，再在异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导下进行诱导表达，实现促进目的蛋白可溶性表达的目的。

优选地，所述表达载体为pet22b(+)。

优选地，所用克隆菌为大肠杆菌dh5α，所述表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)plyss菌株。

本发明实施例中选择的待表达基因(目的蛋白基因)是来源于结核分枝杆菌的赖氨酰trna合成酶的基因，这个基因单独表达时不可溶蛋白占总蛋白的比例极大，几乎全部不溶，而应用本发明中的标签蛋白fj1后，可溶性大大提高。

蛋白表达应用领域宽广，前景广阔，本发明所述融合标签蛋白可广泛运用于目的基因的表达和目的蛋白的可溶性研究，以及应用于工业化生产蛋白质药物以及分子生物学、生物化学和遗传学等基础研究领域。

附图说明

图1为构建载体pet22b(+)-fj1的示意图。

图2为本发明中pet22b(+)-fj1转化子的菌落pcr验证，其中泳道1是dnamarker，大小如图；泳道2是选取的转化子。

图3为19℃诱导下lysyl-trnasynthetase(mycobacteriumtuberculosis)蛋白的表达情况，其中，泳道1、2为对照。泳道1为未加本发明中融合标签的全菌液；泳道2为未加本发明中融合标签的菌液上清；泳道3为添加本融合标签后的全菌液；泳道4指添加本融合标签后的菌液上清。

图4为37℃温度诱导下lysyl-trnasynthetase(mycobacteriumtuberculosis)蛋白的表达情况，其中，泳道1、2为对照。泳道1为未加本发明中融合标签的全菌液；泳道2未加本发明中融合标签的菌液上清；泳道3为添加本融合标签后的全菌液；泳道4为添加本融合标签后的菌液上清。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中所用到的材料和试剂：

菌株：大肠杆菌e.colidh5α基因克隆宿主菌、e.colibl21(de3)plyss蛋白表达宿主菌购自novagen公司。

限制性内切酶ndeⅰ、xhoⅰ、hindⅲ购自neb公司。

质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、pcr清洁回收试剂盒购自axygen公司。

lb液体培养基、lb固体培养基，购自上海生工生物工程有限公司。

34mg/ml氯霉素：称取0.34g氯霉素，溶于无水乙醇，定容至10ml，而后用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，氯霉素购自bbi公司。

100mg/ml氨苄青霉素，称取1g氨苄青霉素，用超纯水溶解定容至10ml，而后用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存。氨苄青霉素购自bbi公司。

0.22μm滤膜购自millipore公司。

1m异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)：称取2.31giptg，用6ml超纯水溶解，定容至10ml，而后用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存。iptg购自calbiochem公司。

1mdtt：称取1.543gdtt，用6mlddh2o溶解，定容至10ml，-20℃保存。dtt购自bbi公司。

2×sds-page上样缓冲液：量取1mtris-hcl缓冲液(ph6.8)10ml、50％甘油40ml，称取4gsds、0.2g溴酚蓝，用ddh2o溶解，定容至80ml，4℃冰箱保存。每次使用时，按照4:1的比例，取以上溶液2ml、1mdtt0.5ml，充分混匀后使用，4℃冰箱保存。

5×tris-gly电泳缓冲液：称取15.1tris碱、94g甘氨酸、5gsds，用约800mlddh20搅拌溶解，而后定容至1l，室温保存。

sds-page染色液：按照无水乙醇：ddh2o：冰乙酸＝4.5:4.5:1的比例配置溶液，其中，每100ml溶液需加入0.25g考马斯亮蓝r250，充分溶解，室温保存。

脱色液ⅰ：按照无水乙醇：ddh2o:冰乙酸＝25:65:8的比例配置溶液，室温保存。

脱色液ⅱ：按无水乙醇：ddh2o：冰乙酸＝10:75:15的比例配置溶液，室温保存。

实施例

1、载体pet22b(+)-fj1、实验组表达载体以及对照组载体的构建

本实施例中，提高蛋白表达的融合标签蛋白基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示，称之为fj1基因，由金唯智公司通过基因合成的方法制得。

提高蛋白表达的融合标签蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

小分子泛素样修饰蛋白(sumo)对应的sumo基因核苷酸序列如seqidno.4所示。

本实施例中，赖氨酰trna合成酶(lysyl-trnasynthetase，简写为lysrs)，其核苷酸序列见seqidno.5所示，基因片段由金唯智公司合成。

1.1、载体pet22b(+)-fj1的构建

将fj1基因通过如seqidno.3所示序列方式基因合成后克隆到pet22b(+)的ndeⅰ和xhoⅰ酶切位点之间，构成载体pet22b(+)-fj1质粒，质粒图谱如图1所示。

seqidno.3：

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1.2、实验组表达载体的构建

将sumo基因与赖氨酰trna合成酶(lysyl-trnasynthetase，简写为lysrs)基因合成构成sumo-赖氨酰trna合成酶的编辑基因，所述基因序列如seqidno.6所示，其中，sumo基因、赖氨酰trna合成酶基因为已知基因，其核苷酸序列见seqidno.4、seqidno.5所示。

如seqidno.6所示，第1-6位的核苷酸片段catatg是ndeⅰ酶切位点，第49-54位的核苷酸片段aagctt是hindⅲ酶切位点，第1876-1881位的核苷酸片段ctcgag是xhoⅰ酶切位点。

将sumo-赖氨酰trna合成酶基因片段，通过hindⅲ与xhoⅰ酶切位点克隆到载体pet22b(+)-fj1中构成实验组的表达载体。

1.3、对照组载体的构建

将sumo基因与赖氨酰trna合成酶(lysyl-trnasynthetase，简写为lysrs)基因合成构成sumo-赖氨酰trna合成酶的编辑基因，所述基因序列如seqidno.6所示。

将sumo-赖氨酰trna合成酶的编辑基因，克隆到pet22b(+)的ndeⅰ和xhoⅰ酶切位点之间，即，将sumo-赖氨酰trna合成酶基因克隆在pet22b(+)上，形成对照组质粒。

2、转化子的筛选

将实验组表达载体与对照组载体，转化至e.colidh5α，将转化的e.colidh5α涂布至含有氨苄青霉素的lb固体平板上，37℃过夜培养，次日挑取单克隆进行菌落pcr鉴定，图2为实验组菌落pcr鉴定结果，后送测序公司测序鉴定，选出正确的转化子，鉴定正确的转化子进行扩大培养，抽提质粒，转化至e.colibl21(de3)plyss，然后将转化后的e.colibl21(de3)plyss涂布至含有氨苄青霉素及氯霉素的lb固体培养平板，37℃过夜培养，次日刮板取菌600μl，加入50％甘油400μl，-20℃保存菌种。

3、诱导表达

取10μl菌液加入1.5mllb培养基中，加入1.5μlcm+、1.5μlamp+37℃200rpm振荡培养至菌液od600≈0.8时，加入终浓度0.5mm/liptg，分别于19℃16h，37℃8h的条件下进行诱导，5000rpm5min收菌，弃去上清，收集菌体沉淀，用500μllysisbuffer(50mmtris，200trisnacl，10mm咪唑，5％甘油)重悬，冰浴超声破碎菌体，13300rpm20min离心收集上清。

进行诱导表达时，也是分别对实验组与对照组分别进行同等条件的诱导表达。

4、sds-page检测

sds-page分析表达产物，lysyl-trnasynthetase(mycobacteriumtuberculosis)本身的蛋白大小约为61.2kda，与预期相符，与仅带有sumo标签的表达载体相比，带有本发明标签的表达载体的目的蛋白表达量及可溶性比例大大提高，sds-page的结果见图3、图4。

从实施例可见，本发明融合标签蛋白fj1可以作为一个非常好的标签来进行融合蛋白的表达使用。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>复旦大学

<120>一种提高蛋白表达的融合标签蛋白及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>71

<212>prt

<213>gramellaforsetii

<400>1

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