针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，具体涉及针对中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)的全人源中和抗体、高活性mers-cov抑制多肽的双特异性高效免疫治疗剂，及其应用。

背景技术：

中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus，mers-cov)是2012年6月由病毒学家alim.zaki发现的一种新型冠状病毒[1]。mers感染患者在临床上表现出与sars非常相似的症状，多会出现严重的呼吸系统综合征，并伴有较高比率的急性肾衰竭，其致死率目前约36％，远高于sars流行期间约10％的致死率[2,3]。2012年起至今mers已波及26个国家，其中2015年在韩国爆发的疫情发展十分迅速，对世界公共健康造成了重大且持续的威胁。目前国际上尚无针对mers-cov的疫苗或特效药物，因此开发出有效的抗病毒治疗和预防药品迫在眉睫。

研究表明，单克隆抗体药物以其高特异性、有效性和安全性已经发展为生物医药的最重要组成部分之一，在多个种类重大疾病的治疗领域都有广泛的应用。在sars爆发期间，针对sars-cov的单克隆抗体已被证明在体外及动物模型中具有极好的抗病毒效果，说明单克隆抗体具有作为冠状病毒防治药物的巨大潜力。与sars类似，研究人员在mers病人或者康复患者的血清内检测到了高水平的抗mers-cov的抗体[4,5]。有报道，从噬菌体展示的超大型全人源抗体库中筛选到一系列具有与病毒蛋白极高亲和力的抗体，其中单抗m336与mers-cov表面s蛋白受体结合区(receptorbindingdomain,rbd)的结合亲和力常数达到99pm，并发现m336针对mers-cov假病毒的中和活性(ic50)达到0.005g/ml，针对mers-cov活病毒的中和活性达到0.07g/ml，系目前国际上已报道的活性最强的抗mers-cov抗体之一[6]。进一步的动物实验证明m336抗体在狨猴、兔子和转基因小鼠模型中效果显著，说明单抗m336有望用于临床，作为挽救病人生命的特效候选药物。

同时，除了单克隆抗体药物外，一系列多肽类病毒融合抑制剂也是目前抗病毒药物研究的热点之一。这类多肽衍生于病毒本身的包膜蛋白，可以与病毒的包膜蛋白结合，从而阻止病毒与宿主细胞融合所必需的活性六螺旋结构的形成，达到阻止病毒入侵的目的。有研究发现了一种衍生于mers-covs2蛋白的多肽hr2p，能够与s2蛋白的hr1区(heptadrepeat1domain)相互作用，并产生螺旋状的6-hb复合物，具有竞争病毒s2蛋白形成6-hb的能力，从而抑制病毒复制。进一步发现，hr2p能够有效抑制s蛋白介导的细胞与细胞融合以及mers-cov对vero细胞的感染[7,8]。hr2p多肽正在被进一步优化并改善其抑制活性，这些hr2p类似物也很有可能进一步发展为有效预防或治疗mers-cov的病毒融合抑制剂。

然而，多肽药物需要化学合成，存在着代谢不稳定、体内半衰期短、生物利用度低及靶向性不够强等缺点，严重阻碍了多肽药物在临床治疗中的广泛应用。另一方面，单克隆抗体药物分子量过大(150kda)，从而导致其在临床应用时存在组织渗透性较差、难以达到一些具有空间位阻的靶点，及生产成本高、价格昂贵的缺点，使得单克隆抗体药物虽在癌症、免疫性疾病治疗领域获得巨大成功，但在抗病毒治疗等领域的应用还相对有限。此外，单克隆抗体作用靶点单一，有可能会引起病毒的逃逸。因此，探索一种新的免疫治疗剂，使其能兼具抗体与多肽类药物的优势且弥补它们的缺陷，意义重大。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供新的针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂.

与本发明相关的现有技术有：

[1]a.m.zaki,s.vanboheemen,t.m.bestebroer,a.d.osterhaus,r.a.fouchier,isolationofanovelcoronavirusfromamanwithpneumoniainsaudiarabia,thenewenglandjournalofmedicine,367(2012)1814-1820.

[2]j.f.chan,s.k.lau,k.k.to,v.c.cheng,p.c.woo,k.y.yuen,middleeastrespiratorysyndromecoronavirus:anotherzoonoticbetacoronaviruscausingsars-likedisease,clinicalmicrobiologyreviews,28(2015)465-522.

[3]j.f.chan,k.s.li,k.k.to,v.c.cheng,h.chen,k.y.yuen,isthediscoveryofthenovelhumanbetacoronavirus2cemc/2012(hcov-emc)thebeginningofanothersars-likepandemic？,thejournalofinfection,65(2012)477-489.

[4]u.buchholz,m.a.muller,a.nitsche,a.sanewski,n.wevering,t.bauer-balci,f.bonin,c.drosten,b.schweiger,t.wolff,d.muth,b.meyer,s.buda,g.krause,l.schaade,w.haas,contactinvestigationofacaseofhumannovelcoronavirusinfectiontreatedinagermanhospital,october-november2012,eurosurveillance:bulletineuropeensurlesmaladiestransmissibles＝europeancommunicablediseasebulletin,18(2013).

[5]d.s.hui,m.peiris,middleeastrespiratorysyndrome,americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine,(2015).

[6]t.ying,l.du,t.w.ju,p.prabakaran,c.c.lau,l.lu,q.liu,l.wang,y.feng,y.wang,b.j.zheng,k.y.yuen,s.jiang,d.s.dimitrov,exceptionallypotentneutralizationofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusbyhumanmonoclonalantibodies,journalofvirology,88(2014)7796-7805.

[7]l.lu,q.liu,y.zhu,k.h.chan,l.qin,y.li,q.wang,j.f.chan,l.du,f.yu,c.ma,s.ye,k.y.yuen,r.zhang,s.jiang,structure-baseddiscoveryofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusfusioninhibitor,naturecommunications,5(2014)3067.

[8]j.gao,g.lu,j.qi,y.li,y.wu,y.deng,h.geng,h.li,q.wang,h.xiao,w.tan,j.yan,g.f.gao,structureofthefusioncoreandinhibitionoffusionbyaheptadrepeatpeptidederivedfromthesproteinofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirus,journalofvirology,87(2013)13134-13140.。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供新的针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂.尤其涉及一种抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，其中抗体为高活性mers-cov全人源中和抗体，多肽为高活性mers-cov抑制多肽；该双特异性免疫治疗剂同时具有抗体与多肽的抗病毒活性，可进一步开发为一类强效抗病毒药物。

具体的，本发明公开了全人源单克隆抗体m336单链抗体(m336scfv)，或m336单链二聚体(m336diabody)与一个抗病毒多肽hr2p的双特异性融合蛋白；本发明涉及的双特异性融合蛋白包括m336单链抗体m336scfv，单链二聚体m336diabody以及抗病毒多肽hr2p；本发明还公开了这些双特异性融合蛋白的抗原结合片段，双特异性抗体，及与效应分子的偶联物；所述的双特异性融合蛋白和组合物可以用于临床上检测、预防或治疗中东呼吸系统综合征。

更具体的，本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白由m336抗体的单链可变片段scfv通过一个连接肽(gly4ser)3与抗病毒多肽hr2p相连构成的，其中，所述的m336抗体scfv的氨基酸序列如seqidno:1所示，所述的hr2p的氨基酸序列如seqidno:3所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:4所示；

本发明中，所述的融合蛋白由m336抗体的单链二聚体diabody通过一个连接肽(gly4ser)3与抗病毒多肽hr2p相连构成的，其中，所述的m336抗体diabody的氨基酸序列如seqidno:2所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:5所示；

本发明中，所述的融合蛋白，其中的m336抗体片段是全人源的。

本发明中，所述的融合蛋白，其中的m336单链抗体为igg。

本发明中，项所述的抗原结合片段，是scfv,fv,fab或f(ab)2。

本发明提供了一种双特异性抗体，含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段；所述的单克隆抗体或抗原结合片段，或所述的双特异性抗体，与一种效应分子偶联。

本发明中，所述的偶联物，其中的效应分子是可检测标记：如荧光标记，放射性标记，亲和素，生物素，或酶；毒素或化疗剂；其中的毒素可选自绿脓杆菌外毒素。

本发明提供了一种核酸分子，其编码所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，或所述的偶联物；所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。

本发明提供了一种质粒，含有所述的核酸分子，所述的质粒可以是一种病毒质粒。

本发明提供了一种宿主细胞，含有所述的质粒。

本发明提供了一种在生物样品中检测mers-cov表面糖蛋白的方法，包含：

含有生物样品，及所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，或所述的偶联物，在足以形成免疫复合物的条件下，检测免疫复合物的存在与否，其中免疫复合物的存在表示生物样品中存在mers-cov表面糖蛋白；

所述的方法中，样品来源于人类或骆驼。

本发明提供了一种检测受试者是否患有mers的方法，包含：

含有来源于疑似感染mers的受试者的生物样品，及有效剂量的所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，或所述的偶联物，并检测单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合，其中单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合相比阴性对照增加表示受试者患有mers；所述的方法中，阴性对照是一个参比标准，或单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物与来源于健康受试者的样品的结合；其中样品是血液，血清，血浆，痰液，或活检样品。

本发明提供了一种药用组合物，含有有效预防剂量的所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的偶联物，所述的核酸，或所述的质粒，和一种药学可接受载体。

本发明提供了新的针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂.所述治疗机是一种抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，经实验证实，该双特异性免疫治疗剂同时具有抗体与多肽的抗病毒活性，可进一步制备为一类强效抗病毒药物。

附图说明

图1：双特异性融合蛋白(m336scfv-pep，m336diabody-pep)的设计(a)及sds-page电泳图(b)。

图2：双特异性融合蛋白与mers冠状病毒s蛋白的结合能力的检测。

图3：双特异性融合蛋白能够有效的中和mers-cov活性，其中，m336scfv、m336scfv-pep、m336diabody-pep为双特异性融合蛋白，ch3-pep为无关抗体对照，图中显示了双特异性融合蛋白与scfv能够有效的中和mers冠状病毒。

图4：双特异性融合蛋白能够有效的抑制mers-cov介导的细胞融合，其中，以表达dpp4的huh-7细胞为靶细胞，同时表达mers-covs蛋白、增强绿色荧光蛋白(egfp)的293t细胞为效应细胞进行融合，结果显示，相比较m336scfv，两种融合蛋白抑制病毒的能力在不同方面得到了提升。

具体实施方式

实施例1抗体的制备、表达与纯化

设计两段基因，其中一段用连接子(g4s)3将单链抗体(m336scfv)与一个抗病毒多肽hr2p的基因连接，构建融合蛋白m336scfv-pep，另一段以二价的单链二聚体diabody与多肽相连，构建融合蛋白m336diabody-pep，由公司合成基因并经sfii酶切后，通过dna连接酶插入到pcomb3x表达载体中，并送公司测序验证构建成功；

融合蛋白的制备、表达、纯化方法参考文献报道的方法进行；将含有克隆m336scfv、融合蛋白m336scfv-pep、m336diabody-pep以及作为对照的融合蛋白ch3-pep的质粒转入hb2151感受态细胞，从过夜生长的氨苄平皿中挑取单个菌落，接种sb细菌培养液，在30度iptg诱导条件下表达10-12小时，收获细菌并从中提取纯化，使用ni-nta树脂进行纯化。

实施例2双特异性融合蛋白与mers冠状病毒s蛋白的结合能力的检测

将s蛋白作为配体，固定在金属芯片表面，再将一定浓度梯度的四种蛋白m336scfv、m336scfv-pep、m336diabody-pep、ch3-pep以一定的流速通过芯片，测定折射光的变化，得出待测物与底物的反应曲线，并计算亲和力常数(如图2所示)，融合蛋白具有极强的s蛋白结合能力。

实施例3双特异性融合蛋白能够有效的中和mers-cov

将mers冠状病毒s蛋白基因和表达荧光素酶作为报告基因缺陷的hiv-1基因，共同转染293t细胞，包装mers-cov假病毒，加入按比例稀释的m336scfv、scfv-peptide以及diabody-peptide和无关抗体融合蛋白ch3-peptide、，与假病毒一起感染huh-7细胞，测量荧光素酶活性，结果如图1所示，m336scfv、m336scfv-pep、m336diabody-pep的ic50(μg/ml)分别为0.011，0.008和0.010，均能有效的中和mers冠状病毒，其中中和活性最高的是m336scfv-pep。

实施例4

双特异性融合蛋白能够有效的抑制mers-cov介导的细胞融合(cell-cellfusion)

以表达dpp4的huh-7细胞为靶细胞，同时表达mers-covs蛋白、增强绿色荧光蛋白(egfp)的293t细胞为效应细胞，将两者共同培养，在荧光显微镜下可见形状圆形规则、荧光亮度高、体积小的huh-7细胞，以及发生细胞融合后，形状不规则、荧光亮度低、体积大的融合细胞；以一定的浓度梯度，将m336scfv、m336scfv-pep、m336diabody-pep以及无关抗体融合蛋白ch3-pep与效应细胞混合后，加入靶细胞中培养，48小时后计数融合细胞的比例，与不加药的阴性对照组作比较，得到药物的抑制率曲线，结果显示，细胞融合抑制率最高的是m336diabody-pep，结果显示，相比较m336scfv，两种融合蛋白抑制病毒的能力在不同方面得到了提升。

序列表

<110>复旦大学

<120>针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>247

<212>prt

<213>m336scfv

<400>1

aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp

202530

leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleuasnsertyrproleu

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysglyglyglyglyser

100105110

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglnvalglnleuvalgln

115120125

serglyalagluvallyslysproglyserservallysvalsercys

130135140

lysalaserglyglythrphesersertyralailesertrpvalarg

145150155160

glnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyglyileileproile

165170175

pheglythralasertyralaglnlyspheglnglyargvalthrile

180185190

thralaasplysserthrserthralatyrmetgluleuserserleu

195200205

argsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargvalglytyrcys

210215220

serserthrsercysasnargglyalapheaspiletrpglyglngly

225230235240

thrmetvalthrvalserser

245

<210>2

<211>237

<212>prt

<213>m336diabody

<400>2

aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp

202530

leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleuasnsertyrproleu

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysglyglyglyglyser

100105110

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser

115120125

servallysvalsercyslysalaserglyglythrphesersertyr

130135140

alailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

145150155160

glyglyileileproilepheglythralasertyralaglnlysphe

165170175

glnglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr

180185190

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

195200205

alaargvalglytyrcysserserthrsercysasnargglyalaphe

210215220

aspiletrpglyglnglythrmetvalthrvalserser

225230235

<210>3

<211>35

<212>prt

<213>hr2p

<400>3

leuthrglnileasnthrthrleuleuaspleuthrtyrglumetleu

151015

serleuglnglnvalvallysalaleuasnglusertyrileaspleu

202530

lysgluleu

35

<210>4

<211>297

<212>prt

<213>m336scfv-pep

<400>4

aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp

202530

leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleuasnsertyrproleu

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysglyglyglyglyser

100105110

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglnvalglnleuvalgln

115120125

serglyalagluvallyslysproglyserservallysvalsercys

130135140

lysalaserglyglythrphesersertyralailesertrpvalarg

145150155160

glnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyglyileileproile

165170175

pheglythralasertyralaglnlyspheglnglyargvalthrile

180185190

thralaasplysserthrserthralatyrmetgluleuserserleu

195200205

argsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargvalglytyrcys

210215220

serserthrsercysasnargglyalapheaspiletrpglyglngly

225230235240

thrmetvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

245250255

serglyglyglyglyserleuthrglnileasnthrthrleuleuasp

260265270

leuthrtyrglumetleuserleuglnglnvalvallysalaleuasn

275280285

glusertyrileaspleulysgluleu

290295

<210>5

<211>287

<212>prt

<213>m336diabody-pep

<400>5

aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp

202530

leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleuasnsertyrproleu

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysglyglyglyglyser

100105110

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser

115120125

servallysvalsercyslysalaserglyglythrphesersertyr

130135140

alailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

145150155160

glyglyileileproilepheglythralasertyralaglnlysphe

165170175

glnglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr

180185190

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

195200205

alaargvalglytyrcysserserthrsercysasnargglyalaphe

210215220

aspiletrpglyglnglythrmetvalthrvalserserglyglygly

225230235240

glyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserleuthrglnile

245250255

asnthrthrleuleuaspleuthrtyrglumetleuserleuglngln

260265270

valvallysalaleuasnglusertyrileaspleulysgluleu

275280285