一种从章鱼肝脏中提取牛磺酸的方法与流程

本发明属于章鱼加工副产物的利用技术领域，具体涉及一种从章鱼肝脏中提取牛磺酸的方法。

背景技术：

牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在人体内以游离状态存在，具有多种生理功能，牛磺酸能够促进蛋白质、脂类物质、氨基酸和糖类的代谢，以及能够促进cu、fe、zn、mn等其他矿物元素的吸收并且间接调节脂类代谢。牛磺酸具有保护淋巴细胞的作用，还与血液中白细胞总数密切相关，缺少牛磺酸甚至会导致细胞形态、功能出现异常。研究还发现，牛磺酸对不同年龄免疫抑制小鼠的免疫调节作用和抗氧化能力均有改善，对某些禽类的生殖性能、免疫系统发育及抗氧化能力都有明显的影响作用。在章鱼加工过程中，章鱼肝脏作为废弃物，其内含有的牛磺酸一直被忽视。

利用海洋产品加工副产物提取牛磺酸近年来已成为研究热点，不仅减少了环境污染，还可提高海洋资源的利用率。目前天然牛磺酸的提取主要有水煮法、乙醇提取法、酶解法、超声波辅助提取法等。水煮法具有试剂无毒，工艺流程简单，提取设备要求低，成本低和污染小等优点，被广泛应用于动植物体内牛磺酸的提取，但得率很低。乙醇提取法制备牛磺酸，得到的天然牛磺酸成分相对单一，有利于牛磺酸的分离分析，便于后续研究，弊端为对乙醇消耗量巨大，并且天然牛磺酸得率和纯度相对较低。酶解法的原理是利用蛋白酶破坏细胞膜的结构，促使组织细胞内的牛磺酸溶解于溶剂中，以达到产物的提取分离。此方法的优点是提取条件温和，提取过程中副反应比较少，但对温度和酶的添加量要求较高，并且蛋白酶价格较高，提高了生产成本。

牛磺酸粗提液中还含有大量的蛋白质、多糖、脂类、色素及金属离子等杂质，分离纯化的目的是将牛磺酸与各种杂质分离，得到比较纯的天然牛磺酸制品。目前常用的去除蛋白质和多糖的方法包括等电点法或添加有机试剂使蛋白或多糖等杂质沉淀后离心去除。氨基酸的分离提纯大部分使用离子交换树脂分离。离子交换法是指改变溶液的ph值，从而改变氨基酸的带电形式，使其在离子交换树脂上的吸附能力发生变化，进而进行氨基酸的分离提纯。陈骋等使用732强酸性阳离子交换树脂提取纯化牦牛心脏、肝脏、肾脏和肺脏中牛磺酸，并对其含量进行了比较分析，结果表明肝脏中牛磺酸含量最高为(7.02±0.50)mg/g，其次为肾脏(5.59±0.25)mg/g、肺脏(4.46±0.17)mg/g和心脏(2.50±0.30)mg/g，钱俊青以珍珠贝母为原料，使用离子交换树脂提取纯化牛磺酸，结果表明纯化可使牛磺酸占氨基酸总量的80％左右，回收率为87.5％。李和生采用强酸性钠型阳离子交换树脂柱，蒸馏水洗脱，速度为0.8ml/min，在此条件下蛤蜊中牛磺酸的提取得率约为0.49％。尚没有章鱼肝脏中提取纯化牛磺酸的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从章鱼肝脏中提取牛磺酸的方法。

一种从章鱼肝脏中提取牛磺酸的方法，按照如下步骤进行：

(1)将新鲜的章鱼洗净后，取出肝脏，加入蒸馏水，放置于组织捣碎机中组织匀浆，至糜状；

(2)将匀浆液放在45-55℃水浴锅内，瓶口塞上棉花，自溶18-30h；

(3)将溶液ph调至4.2-4.8，放在70-90℃水浴锅内继续提取40-60min后，冷却，用纱布过滤，收集滤液；

(4)将滤液ph调至3.0-3.5，即有酸性蛋白沉淀析出，4000-6000r/min，离心15-25min，除去沉淀，收集上清液，将上清液ph调至8.5-9.0，即有碱性蛋白沉淀析出，4000-6000r/min，离心15-25min，除去沉淀，收集上清液；

(5)在上清液中加入少量活性炭，当溶液颜色脱去至澄清后过滤，将上清液旋转蒸发至原体积的1/8-1/3，用盐酸调溶液ph至4.2-4.8待上柱；

(6)采用732na⁺型阳离子交换树脂柱，以去离子水洗脱，收集牛磺酸高流洗脱液；

(7)收集牛磺酸洗脱液，浓缩，加入无水乙醇，放于4℃冰箱内，即有白色牛磺酸针状结晶析出，离心收集。

所述蒸馏水添加量为章鱼肝脏质量的3-6倍。

步骤(3)所述过滤采用六层细纱布过滤。

步骤(5)所述活性炭的加入量为每100ml上清液加入2.5-3g。

步骤(7)为了出去溶液中还存在的其他杂质，采用重结晶法，即可获得高纯度牛磺酸结晶。

上述从章鱼肝脏中提取的牛磺酸在制备食品，保健食品及药品中的应用。

上述从章鱼肝脏中提取的牛磺酸在制备保健饮料中的应用。

上述从章鱼肝脏中提取的牛磺酸在制备化妆品中的应用。

本发明的有益效果：本发明以牛磺酸提取得率为指标，采用水煮法从章鱼肝脏中提取牛磺酸，研究了料液比、提取温度、提取时间、自溶时间四个因素对牛磺酸提取得率的影响，并通过正交试验优化了最佳提取工艺。最佳提取条件是：提取温度80℃，料液比1：4g/ml，自溶时间22h，提取时间40min。在最优工艺条件下章鱼肝脏牛磺酸提取得率为4.65mg/g。采用732na⁺型离子交换树脂分离纯化牛磺酸，最佳工艺条件为：上样ph值4.5，进样量6ml，洗脱速度2ml/min。收集牛磺酸电导率下降至稳定期间流出液，经hplc分析为牛磺酸溶液。最佳无水乙醇添加量为三倍体积，结晶，再反复重结晶2-3次，即得纯度达99％以上的天然牛磺酸样品。制备过程无污染，工艺简单易操作，成本较低，树脂可再生，并且得到的产品纯度高，具有很好的实际意义和应用前景。

附图说明

图1为料液比对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

图2为提取时间对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

图3为提取温度对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

图4为自溶时间对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

图5为牛磺酸样品红外光谱图。

图6为牛磺酸标准品红外光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1牛磺酸提取的单因素试验

(1)料液比对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响：

将5组25.0g左右章鱼肝脏匀浆液，分别在自溶时间为24h，提取温度为70℃，提取时间为40min的条件下，研究料液比分别为1∶3g/ml，1∶4g/ml，1∶5g/ml，1∶6g/ml，1∶7g/ml时对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

单因素试验中料液比对牛磺酸提取得率的影响如图1所示。随着料液比的不断提高，章鱼肝脏牛磺酸的提取得率呈现先上升后逐渐下降的趋势，在料液比为1∶4时，其提取得率最高，为3.63mg/g，显著高于其他料液比的牛磺酸提取得率。此后料液比再增加，提取得率呈现极显著下降(p<0.01)趋势，因此将料液比选为1∶4效果较佳。

(2)提取时间对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响

将5组25.0g章鱼肝脏匀浆液，分别在自溶时间为24h，提取温度为70℃，料液比为1∶4g/ml的条件下，研究提取时间分别为30min，40min，50min，60min，70min时对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

实验结果见图2，在提取时间为30-50min范围内，当提取时间不断延长，牛磺酸的提取得率也极显著提高(p<0.01)，且在50min时，牛磺酸的提取得率最大，为3.46mg/g，此后尽管提取时间再延长，其提取得率变化不大，处于基本稳定状态，故选择50min为较佳提取时间。

(3)提取温度对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响

将5组25.0g章鱼肝脏匀浆液，分别在自溶时间为24h，提取时间为40min，料液比为1∶4g/ml的条件下，研究提取温度分别为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃时对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

由图3可知，当温度在50℃-80℃之间时，其得率随着温度的上升呈现极显著上升(p<0.01)的趋势，当温度升至80℃时，牛磺酸的提取得率最大，为4.49mg/g。超过80℃时提取得率极显著下降(p<0.01)，这可能是因为过高的温度使章鱼肝脏内的某些酶失活，降低其牛磺酸提取得率，因此将80℃作为较佳提取温度。

(4)自溶时间对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响

将5组25g章鱼肝脏匀浆液，研究在自溶时间分别为8h，12h，16h，20h，24h时对章鱼肝脏牛磺酸提取得率的影响。

如图4所示，由于章鱼肝脏内有一些酶的存在，并且在这些酶的最适条件下，它们可能会使章鱼肝脏自身的蛋白水解，影响牛磺酸的溶出，从而影响牛磺酸的提取得率。在8-20h内，随着自溶时间的延长牛磺酸提取得率也随之极显著上升(p<0.01)，当自溶时间为20h时，牛磺酸的提取得率达到最高，且极显著高于8-16h时所对应的牛磺酸提取得率(p<0.01)，自溶时间超过20h后，牛磺酸提取得率有所降低，故选20h为较佳自溶时间。

实施例2牛磺酸提取的正交试验

根据单因素试验结果，筛选本实验的主要因素及水平，通过l9(3⁴)正交试验表，来确定章鱼肝脏牛磺酸提取的最佳工艺条件组合，正交因素水平如表1所示。试验结果采用office2007整理，采用spss19.0统计软件对数据进行方差分析，构造f统计量，进行f检验，判断因素作用的显著性。

表1正交试验因素水平表

根据单因素试验结果，选择料液比、提取时间、提取温度、自溶时间4个影响因素及其水平，将章鱼肝脏牛磺酸提取得率作为指标，通过l9(3⁴)正交试验表，来确定牛磺酸提取的最佳工艺条件，试验结果及方差分析如表2，表3。

表2正交试验l9(3⁴)结果

表3正交设计试验方差分析

注：f0.05(2,2)＝19；f0.01(2,2)＝99；f0.10(2,2)＝9；*-影响显著；**-影响极显著；ns-无显著影响。

从表2中可得出，根据级差的大小顺序，确定影响章鱼肝脏牛磺酸提取的主次因素顺序为：提取温度(b)>料液比(d)>自溶时间(a)>提取时间(c)。因此，牛磺酸提取最优工艺为b2d2a2c1，即提取温度80℃，料液比1∶4，自溶时间22h，提取时间40min。对牛磺酸提取得率进行方差分析见表3，结果表明：因素b(提取温度)和因素d(料液比)对牛磺酸提取得率有极显著影响，因素a自溶时间对提取得率影响显著，提取时间对章鱼肝脏牛磺酸提取得率影响不显著。方差分析结果表明提取温度和料液比的变化极大影响试验结果。

实施例3章鱼肝脏牛磺酸的提取及检测

1)实验材料与试剂

章鱼肝脏：唐山丰瑞水产食品有限公司；

牛磺酸标准样品(99.9％)：上海绿源科技有限公司；

732na⁺型阳离子交换树脂：北京索莱宝科技有限公司；

活性炭：天津天力有限公司；

其他试剂为实验室常用试剂。

2)提取步骤

(1)样品前处理：将新鲜的章鱼洗净后，取出肝脏25.0g左右，按肝脏和蒸馏水(g/ml)比例1:4，放置于组织捣碎机中组织匀浆，至糜状；

(2)自溶：将匀浆液放在50℃水浴锅内，瓶口塞上棉花，自溶22h；

(3)提取：将溶液ph调至4.5，放在80℃水浴锅内继续提取50min后，冷却，用六层细纱布过滤，收集滤液；

(4)除酸性蛋白：将溶液ph调至3.0-3.5，即有酸性蛋白沉淀析出，5000r/min，离心20min，除去沉淀，收集上清液；除碱性蛋白：将上清液ph调至8.5-9.0，即有碱性蛋白沉淀析出，5000r/min，离心20min，除去沉淀，收集上清液；

(5)脱色浓缩：在上清液中加入少量活性炭(每100ml加入2.5g-3.0g左右)，当溶液颜色脱去至澄清后过滤，将上清液旋转蒸发至原体积的1/5，用盐酸调溶液ph至4.5待上柱；

(6)牛磺酸纯化及收集：除蛋白及色素后的提取液中仍存在许多可溶性蛋白质，并含有多种氨基酸和无机盐类，干扰牛磺酸的测定，实验采用732na⁺型阳离子交换树脂柱，以去离子水洗脱，收集牛磺酸高流洗脱液；

(7)结晶与重结晶：收集牛磺酸洗脱液，浓缩，加入无水乙醇，放于4℃冰箱内，即有白色牛磺酸针状结晶析出，可通过离心收集。为了出去溶液中还存在的其他杂质，采用重结晶法，即可获得高纯度牛磺酸结晶。

将纯化后得到的牛磺酸晶体和标准品用红外扫描仪在4000cm^-1到400cm^-1波数范围内分别扫描，所得红外图谱结果如图5，图6所示。通过与牛磺酸标准品ftir图谱比较分析表明，牛磺酸样品n-h伸缩振动特征峰位置在3049cm^-1和3214cm^-1处，c-h伸缩振动特征峰在2969cm^-1处，1183cm^-1，1215cm^-1，1513cm^-1，1587cm^-1和1617cm^-1分别为c-s和s＝o的特征峰，证明样品物质结构中含有nh2、ch2、s＝o、以及c-s-o等结构基团。实验所得样品牛磺酸的特征峰均与文献报道标准品的出峰位置相吻合，证明本实验所得牛磺酸样品为纯度高的天然牛磺酸。