多肽变体及其用途的制作方法

发明领域本发明涉及包含结合区的含有fc区的多肽(如抗体)，其与亲本多肽或抗体相比在fc区中具有至少两个氨基酸取代。发明背景单克隆抗体的fc介导的效应器功能，如补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)有助于由功效和毒性定义的治疗窗。cdc由c1q与抗体fc区的结合来启动。c1q是一种多聚体蛋白质，其由6个附着到茎的球状结合头组成。已经显示了通过fc区中的点突变增强细胞表面上靶物结合后的igg六聚化。六聚化通过分子间非共价fc-fc相互作用介导，并且fc-fc相互作用可以通过ch3域中的点突变来增强，所述点突变包括e345r和e430g。wo2013/004842公开了包含具有一个或多个氨基酸修饰的变体fc区的抗体或多肽，所述氨基酸修饰导致经修饰的效应器功能，如补体依赖性细胞毒性(cdc)。wo2014/108198公开了包含具有一个或多个氨基酸修饰的变体fc区的多肽如抗体，所述氨基酸修饰导致增加的补体依赖性细胞毒性(cdc)。wo2016/164480公开了具有激动活性的抗原结合复合物。可以使用抗体之间增强的fc-fc相互作用来放大抗体对其在细胞表面上的靶物的结合的效应。然而，仅增强fc区之间的fc-fc相互作用并不总是足以创建足够强的信号以活化由例如与受体结合引起的信号传导途径。因此，本发明的一个目的是提供包含人igg的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，所述多肽当与亲本多肽比较时具有增加的fc-fc相互作用和激动活性，如在结合后增加的靶受体活化，其中亲本多肽是相同同种型的人igg并且具有相同的抗原结合区，但是在fc区中没有任何突变，即亲本多肽或亲本抗体。本发明的另一个目的是提供与亲本多肽相比当多肽(例如多肽)的抗原结合区域与相应的抗原结合时活化信号传导，任选地诱导增强的信号传导的多肽，其中亲本多肽在fc区中没有任何突变。本发明的另一个目的是提供具有增强的fc-fc相互作用性质和增强的效应器功能如cdc的多肽。本发明的另一个目的是提供当与fc区中没有任何突变的亲本多肽相比时具有增强的fc-fc相互作用和增强的c1q结合特性的多肽。发明概述如本文所述，本发明涉及具有fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区具有fc-fc增强突变和c1q结合突变，所述c1q结合突变提供具有增加的cdc活性和/或激动活性的多肽或抗体。不受理论的限制，认为本发明的多肽或抗体在与细胞表面上的靶物结合时能够在两个多肽或抗体分子的fc区之间发生稳定的结合相互作用，这导致增强的寡聚化，如六聚体形成，从而提供亲合的表面。与fc区中没有任何突变的亲本多肽或亲本抗体，即相同同种型的亲本多肽或抗体相比，本发明的多肽或抗体进一步具有增加的fc效应器响应。在一个方面，本发明提供了包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自e430，e345的位置处的至少一个fc-fc增强取代或s440y或s440w取代，和b)至少一个c1q结合取代，其中位置对应于根据eu编号(edelmanetal.,procnatlacadsciusa.1969may；63(1):78-85；kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版1991nihpublicationno.91-3242)的人igg1。在本发明的一个方面，提供了包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，和b)在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。认为在对应于e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代是根据本发明的fc-fc增强取代。认为在选自下组的一个或多个位置处的取代是根据本发明的c1q结合取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396。也就是说，在本发明的第一方面中，本发明的发明人发现，引入增强fc-fc相互作用的第一突变以及增强c1q结合的第二突变提供具有激动活性和/或增强的cdc的多肽或抗体。在一个方面，本发明提供了包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，和b)在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。也就是说，发明人发现，fc-fc增强突变以及选自下组的一个或多个位置处的一个或多个c1q结合取代可以提供激动活性：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。本发明人进一步发现fc-fc增强突变以及选自下组的一个或多个位置处的一个或多个c1q结合取代可以提供增强的fc介导的效应器功能，如增强的cdc：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。当与亲本多肽或亲本抗体相比时，多肽或抗体中fc-fc增强突变和c1q结合取代的组合进一步具有产生具有激动性质的多肽或抗体的令人惊讶的效果。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含至少一个取代基，所述取代基选自：e430g、e345k、e430s、e430f、e430t、e345q、e345r、e345y、s440w和s440y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含至少一个选自下组的取代：e430g、e430s、e430f和e430t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含至少一个选自下组的取代：e345k、e345q、e345r和e345y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少包含取代e430g。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少包含取代e345k。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少包含取代s440y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个位置处的取代，如两个或三个位置处的取代：k326a、k326w、e333s、e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个位置处的取代，例如两个或三个位置处的取代：k326a、k326w、e333s、e333a、e333t和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333s。在另一方面，本发明涉及增加包含人igg的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的激动活性的方法，该方法包括a)引入选自e430、e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，和b)引入选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。在另一方面，本发明涉及增加包含人igg的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的cdc活性的方法，该方法包括a)引入在选自e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，和b)引入选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。另一方面，本发明涉及包含至少一种如本文所述的多肽或抗体的组合物。另一方面，本发明涉及如本文所述的多肽、抗体或组合物，其用作药物。另一方面，本发明涉及如本文所述的多肽、抗体或组合物，其用于治疗癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或传染病。另一方面，本发明涉及治疗患有疾病的个体的方法，包括对所述个体施用有效量的如本文所述的多肽、抗体或组合物。在下文更为详细描述了本发明的这些和其他方面，特别是多肽或抗体的各种用途和治疗应用。附图简述图1显示了e430g、k326a/e333a/p396l和k326a/e333a/p396l/e430g对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t(a)、igg1-hdr-05(b)和抗体组合(c)对粘附人bxpc-3胰腺癌细胞的功效的影响，如在3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。显示了两个实验的代表性实例。图2显示了具有k326a/e333a/p396l/e430g的单价抗dr5抗体对粘附人bxpc-3胰腺癌(a)和colo205结肠癌(b)细胞的功效，如在3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。作为单价抗dr5抗体，通过受控的fab臂交换产生具有一个源自igg1-hdr5-01-g56t的dr5特异性臂和一个源自igg1-b12的针对hiv蛋白gp120的非特异性臂的双特异性抗体。显示了三个实验的代表性实例。图3显示了与k326a/e333a/p396l或这些取代中的两个e333a/p396l、k326a/e333a或k326a/p396l组合的e430g对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t对粘附人bxpc-3胰腺癌(a)和colo205结肠癌(b)癌细胞的功效的影响，如3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定，以及对c1q结合的影响，如在elisa测定法(c)中测定。显示了三个实验的代表性实例。图4显示了与k326a/e333a或k326w/e333s组合的e430g对c1q与抗dr5抗体igg1-cona-c49w的结合的影响，如elisa测定法(a)中测定以及对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t对粘附人bxpc-3胰腺癌(b)和colo205结肠癌(c)癌细胞的功效的影响，如3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。显示了三个实验的代表性实例。图5显示了与c1q结合取代s267e/h268f/s324t或igg1/igg3嵌合同种型igg1变体113f组合的e430g对c1q与抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t的结合的影响，如elisa测定法(a)中测定，以及对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t对粘附人bxpc-3胰腺癌(b)和colo205结肠癌(c)细胞的效力的影响，如在3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。显示了三个实验的代表性实例。图6显示了用含有指定突变的10μg/mligg1-hdr5-01-g56t变体对粘附人bxpc-3胰腺癌细胞的3天存活力测定法(celltiter-glo)的汇总。通过相对于wtigg1-hdr5-01-g56t(其设定为100％)的活细胞百分比对效果进行表示和排序。与wt相比对细胞存活力的显著影响表示为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(单因素anova与dunnett氏多重比较检验)。图7显示抗dr5抗体igg1-cona-c49w-k326a/e333a/p396l/e430g(a)和igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g(b)对存在或不存在2.5μg/ml纯化的人c1q的情况下无血清培养基中wil2-ssf悬浮细胞的激动效果，如24小时存活力测定法中测定。活细胞百分比由to-pro-3阴性细胞百分比表示。图8显示了2.5μg/ml具有e430g(fc-fc增强取代)与c1q结合取代的组合的igg1-hdr5-01-g56t的抗dr5抗体变体(a)和抗体组合igg1-hdr5-01-g56t-e430g+igg1-hdr5-05-e430g(b)对存在或不存在纯化的人c1q的浓度系列的情况下无血清培养基中的wil2-ssf悬浮细胞的激动效应，如24小时存活力测定法中测定。通过to-pro-3阴性细胞百分比表示活细胞百分比。四个不同实验的数据用指示标准偏差的误差棒表示。图9显示了2.5μg/ml激动性抗dr5igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g(a)和抗体组合igg1-hdr5-01-g56t-e430g+igg1-hdr5-05-e430g(b)对含有或不含纯化的人c1q和抗c1q中和抗体的无血清培养基中的wil2-ssf悬浮细胞的效力，如24小时存活力测定法中测定。通过to-pro-3阴性细胞百分比表示活细胞百分比。图10显示了对于igg1-hdr5-01-g56t抗体变体当在nhs中温育抗体样品时如通过c4d沉积的量化测量的溶液相补体活化，所述igg1-hdr5-01-g56t抗体变体含有430qfc-fc增强取代与c1q结合取代k326w/e333s、k326a/e333a或k326a/e333a/p396l的组合。测试hagg(热聚集γ球蛋白)和igg1-cona-rgy作为溶液相补体活化的阳性对照。图11显示了在igg-cona-c49w和igg1-cona-c49w-e430g中引入k326w、e333s或k326w/e333s取代对c1q结合的影响，如elisa测定法中测定(a,b)，对c1q结合与dr5阳性wil2-ssf细胞结合的抗体的影响，如通过流式细胞术测定(c,d)，以及对wil2-ssf悬浮细胞的细胞存活力的降低的影响，如3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定(e,f,g)。从两次独立实验计算标准偏差。图12显示了将k326w、e333s或k326w/e333s取代引入igg-cona-c49w和igg1-cona-c49w-e430g(2.5μg/ml)对在存在纯化的人c1q的浓度系列的情况下无血清培养基中的wil2-ssf悬浮细胞的存活力的影响，如24小时存活力测定法中测定。在celltiter-glo测定法中测定活细胞百分比。图13显示了添加抗c1q抗体对具有c1q结合增强突变和/或fc-fc相互作用增强突变的抗dr5igg1-cona-c49w抗体变体在24小时存活力测定法中对补充有纯化的人c1q的无血清培养基中的wil2-ssf悬浮细胞的效力的影响。在celltiter-glo测定法中测定活细胞百分比。图14显示了24小时存活力测定法中针对补充有纯化的人c1q的无血清培养基中温育的wil2-ssf悬浮细胞调理的抗dr5igg1-cona-c49w抗体变体之间添加抑制fc-fc相互作用的肽的效果。在celltiter-glo测定法中测定活细胞百分比。使用乱序肽wcdlegvtwhacl作为非特异性对照肽。图15显示了组合c1q结合取代k326w/e333s与fc-fc增强突变e345k、e345r或s440y对抗dr5抗体igg1-cona-c49w对粘附人bxpc-3胰腺癌细胞的激动活性的影响，如3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。图16显示了对抗dr5抗体igg1-cona-c49w引入的与c1q结合增强突变s267e/h268f/s324t或igg1/igg3嵌合同种型igg1变体113f组合的突变e430g对粘附人bxpc-3胰腺癌细胞存活力的影响，如3天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。图17显示了具有k326w/e333s/e430g突变的功能单价抗dr5抗体对wil2-ssf悬浮细胞存活力的影响，如1天存活力测定法(celltiter-glo)中测定。通过igg1-cona-c49w-f405l-k326w/e333s/e430g(dr5特异性臂)和igg1-b12-k409r-k326w/e333s/e430g(非特异性臂，针对hiv蛋白gp120)的受控fab臂交换以双特异性抗体生成功能单价抗dr5抗体。rlu：相对发光单位。图18显示了引入k326w/e333s/e430g取代对抗dr5抗体的igg1和igg3同种型变体(igg1-cona-c49w和igg3-cona-c49w-r345h)的激动剂活性的影响，如对wil2-ssf细胞的1天存活力测定(a)和对bxpc-3(b)、hpaf-ii(c)和ht-29细胞(d)的3天存活力测定法中测定。使用celltiter-glo试剂盒测定存活力。图19显示了在抗dr5抗体igg1-cona-c49w中引入e430g六聚化增强突变和c1q结合增强突变k326w/e333t或k326w/e333s两者对wil2-s悬浮细胞的影响，如24小时存活力测定法(celltiterglo)中测定。图20显示了scid小鼠中450μgi.v.施用的抗体的清除率。(a)通过elisa测定血清样品中的总人igg，并在浓度对时间曲线中绘制。每个数据点代表一式三份样品的平均值+/-标准偏差。(b)遵循公式d*1.000/auc测定到抗体施用后第21天的清除，其中d为注射剂量和auc为浓度-时间曲线的曲线下面积。显示了两个独立elisa实验的代表性实例。图21显示了e430gfc-fc增强突变与c1q结合增强突变的组合(k326a/e333a或k326w/e333s)对igg1-7d8抗体变体与人fcrn结合的影响，如通过于ph6.0和7.4用包被的fcrnecdhis-b2m-bio进行的elisa测定。igg1-7d8-i235a/h310a/h435a于ph6.0用作fcrn结合的阴性对照(fcrn敲除)；igg1-7d8-m252y/s254t/t256e于ph7.4用作增强的fcrn结合的对照。图22显示了添加和不添加纯化的人c1q的无血清培养基中使用wil2-ssf作为靶细胞和人pbmc(3个供体)作为效应细胞(e:t比率100:1)的铬释放adcc测定法。在不存在和存在c1q的情况下，将经铬标记的wil2-ssf细胞与抗体浓度系列一起温育，以比较igg1-7d8-f405l-k326w/e333s/e430g的adcc活性与igg1-7d8-e430g和wtigg1-7d8的adcc活性。非特异性抗体igg1-b12用作阴性对照。图23显示了k326w/e333s/e430g对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-05对wil2-ssf悬浮细胞的激动活性的影响，如24小时存活力测定法(celltiterglo)中测定。图24显示了互补fc突变对k439e；s440k对抗dr5双表位靶向抗体组合igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g+igg1-hdr5-05-k326w/e333s/e430g对wil2-ssf悬浮细胞的激动活性的影响，如24小时存活力测定法(celltiterglo)中测定。图25显示了测试具有六聚化增强突变e430g或k248e/t437r，以及与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的六聚化增强突变k248e/t437r的igg1-campath抗体变体的对wien133细胞的cdc测定法结果。在20％合并的正常人血清(nhs)存在下，将wien133细胞与浓度系列的抗体变体一起温育。图26显示了组合六聚化增强突变e430g和c1q结合增强突变k326w/e333s对抗dr4抗体igg1-dr4-chctb007对粘附人bxpc-3胰腺癌细胞的功效的影响，如3天存活力测定法(celltiterglo)中测定。图27显示了在存在20％正常人血清的情况下用抗fas抗体变体igg1-fas-e09(a)、igg1-cd95-apo1(b)和igg1-cd95-hfe7a(c)的使用wil2ssf人b淋巴细胞的cdc测定法。在20％合并的正常人血清(nhs)存在下，将wil2-ssf细胞与浓度系列的抗体变体一起温育45分钟。igg1-b12用作非结合对照抗体。图28显示了在没有c1q的无血清培养基中使用与抗fas抗体变体igg1-fas-e09(a)、igg1-cd95-apo1(b)和igg1-cd95-hfe7a(c)一起温育的wil2-ssf细胞的45分钟存活力测定法(celltiter-glo)。图29显示了在具有c1q作为交联剂的无血清培养基中用抗fas抗体变体igg1-fas-e09(a)、igg1-cd95-apo1(b)和igg1-cd95-hfe7a(c)的使用wil2-ssf细胞的24小时存活力测定法(celltiter-glo)。图30显示了使用在不具有c1q的无血清培养基中与抗fas抗体变体igg1-fas-e09(a)、igg1-cd95-apo1(b)和igg1-cd95-hfe7a(c)一起温育的wil2-ssf细胞的24小时存活力测定法(celltiter-glo)。图31显示了ox40jurkat报告物测定法中igg1-cd134-sf2(wt)、igg1-cd134-sf2-e345r、igg1-cd134-sf2-e430g和igg1-cd134-sf2-k326w/e333s/e430g抗体的活性。在8％胎牛血清存在下将thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2/ox40jurkat与一定浓度范围的抗体一起温育5小时。通过诱导萤光素酶报告物基因表达的抗ox40抗体刺激ox40后检测到的发光记录ox40测定法响应。rlu：相对发光单位。图32显示了与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的fc-fc增强突变e430g对igg1-cd40-sgn40和igg1-cd40-cp870893的cd40响应的影响。在8％胎牛血清存在下将thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2/cd40jurkat细胞与一定浓度范围的抗体一起温育5小时。通过诱导萤光素酶报告物基因表达的抗cd40抗体或cd40配体刺激cd40后检测到的发光记录cd40测定法响应。rlu：相对发光单位。图33显示了与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的fc-fc增强突变e430g对igg1-cd137-mor7480和igg1-bms-663513的4-1bb响应的影响。在1％胎牛血清存在下将thaw-and-usegloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞与一定浓度范围的抗体一起温育5小时。通过诱导萤光素酶报告物基因表达的抗4-1bb抗体或具有抗his抗体的4-1bb配体刺激4-1bb后检测到的发光记录4-1bb测定法响应。igg-b12-k326w/e333s/e430g用作阴性对照。rlu：相对发光单位。图34显示了与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的fc-fc增强突变e430g对igg1-gitr-incagn01876的gitr响应的影响。在1％胎儿牛血清存在下将thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2/gitrjurkat细胞与一定浓度范围的抗体一起温育6小时。通过诱导萤光素酶报告物基因表达的抗gitr抗体刺激gitr后检测到的发光记录gitr测定法响应。rlu：相对发光单位。图35显示了与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的fc-fc增强突变e430g对igg1、igg2、igg3和igg4亚类中抗体gitr-36e5的gitr响应的影响。在1％胎牛血清存在下将thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2/gitrjurkat细胞与终浓度111ng/ml抗体一起温育6小时。通过诱导萤光素酶报告物基因表达的抗gitr抗体刺激gitr后检测到的发光记录gitr测定法响应。抗体igg1-b12用作非结合对照。rlu：相对发光单位。发明详述在描述本发明的实施方案时，为了清楚起见将采用特定术语。然而，本发明不意图限于如此选择的特定术语，并且应当理解，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的所有技术等同方案。定义术语“亲本多肽”或“亲本抗体”应当理解为下述多肽或抗体，其与根据本发明的多肽或抗体相同，但是其中亲本多肽或亲本抗体不具有fc-fc增强突变和根据本发明的c1q结合突变。术语“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽”在本发明的背景中指包含免疫球蛋白的fc区和能够结合例如存在于细胞、细菌或病毒体上的任何分子如多肽的结合区的多肽。免疫球蛋白的fc区定义为通常在用木瓜蛋白酶(其为本领域技术人员已知)消化抗体后产生的抗体片段，其包括免疫球蛋白的两个ch2-ch3区和连接区，例如铰链区。抗体重链的恒定域定义抗体同种型，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd、或ige。fc区凭借称为fc受体的细胞表面受体和补体系统的蛋白质介导抗体的效应器功能。结合区可以是能够结合细胞、细菌或病毒体的多肽序列，如蛋白质、蛋白质配体、受体、抗原结合区、或配体结合区。若结合区是例如受体，则“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽”可以制备为免疫球蛋白的fc区和所述结合区的融合蛋白。若结合区是抗原结合区，则“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽可以是抗体，如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或仅重链抗体或scfv-fc融合物。包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽通常可以包含连接区，例如铰链区和免疫球蛋白重链的两个ch2-ch3区，因此“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽”可以是“至少包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽”。术语“免疫球蛋白的fc区”在本发明的背景中意指根据抗体亚型的连接区，例如铰链区，并且存在免疫球蛋白的ch2和ch3区，例如，人igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga1、igga2、igm或ige。多肽不限于人起源，但是可以是任何起源的，例如小鼠或猕猴起源。术语“野生型fc区”在本发明的背景中指具有天然存在的氨基酸序列的免疫球蛋白fc区。如本文所用，术语“铰链区”意指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，根据eu编号，人igg1抗体的铰链区对应于氨基酸216-230。如本文所用，术语“ch2区”或“ch2域”意指免疫球蛋白重链的ch2区。因此，例如，根据eu编号，人igg1抗体的ch2区对应于氨基酸231-340。然而，ch2区也可以是如本文所述的任何其他亚型。如本文所用，术语“ch3区”或“ch3域”意指免疫球蛋白重链的ch3区。因此，例如，根据eu编号，人igg1抗体的ch3区对应于氨基酸341-447。然而，ch3区也可以是如本文所述的任何其他亚型。术语“免疫球蛋白”是指由两对多肽链，即一对轻(l)低分子量链和一对重(h)链组成的一类结构相关的糖蛋白，所有四条链潜在通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的结构是已经完善建立的。参见例如fundamentalimmunology第7章(paul,w.编,第2章ravenpress,n.y.(1989))。简而言之，每条重链通常包含重链可变区(本文中简写为vh)和重链恒定区。重链恒定区通常包含三个域：ch1、ch2和ch3。重链经由二硫键在所谓的“铰链区”中互相连接。每条轻链通常包含轻链可变区(本文中简写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个域cl。vh和vl区可以进一步再分成高可变区(或超变区，其在序列上和/或结构上限定的环的形式中高度可变)，也称作互补决定区(cdr)，散布有称作框架区(fr)的更保守的区域。每个vh和vl通常由三个cdr和四个fr构成，以如下的次序从氨基端向羧基端排列：fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4(亦见chothiaandleskj.mol.biol.196,901917(1987))。除非另外叙述或与背景相冲突，使用domaingapalign(lefrancmp.,nucleicacidsresearch1999；27:209-212和ehrenmannf.,kaasq.andlefrancm.-p.nucleicacidsres.,38,d301-307(2010)；还可见因特网http地址www.imgt.org/)根据imgt规则鉴定本文中的cdr序列。除非另外叙述或与背景相冲突，根据eu-numbering(edelmanetal.,procnatlacadsciusa.1969may；63(1):78-85；kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.5thedition-1991nihpublicationno.91-3242)提及本发明中的fc区/fc域中的氨基酸位置。术语“抗体”(ab)在本发明的背景中指具有特异性结合抗原的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其任一者的衍生物。本发明的抗体包含免疫球蛋白的fc域和抗原结合区。抗体通常含有两个ch2-ch3区和连接区，例如铰链区，例如至少fc域。因此，本发明的抗体可以包含fc区和抗原结合区。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区或“fc”区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应器细胞)和补体系统的组分如c1q(补体活化的经典途径中的第一组分)。抗体还可以是多特异性抗体，如双特异性抗体或类似的分子。术语“双特异性抗体”指对至少两种不同的、通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这类表位可以在相同或不同的靶物上。若表位在不同的靶物上，这类靶物可以在相同细胞或不同细胞或细胞类型中。如上文指示的，除非另外说明或与背景清楚地冲突，术语抗体在本文中包括抗体的片段，其至少包含fc区的一部分且保留特异性结合抗原的能力。这类片段可以通过任何已知的技术提供，如酶促切割、肽合成和重组表达技术。已经显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实施。涵盖在术语“ab”或“抗体”内的结合片段的实例包括但不限于单价抗体(由genmab在wo2007059782中描述)；重链抗体，其仅由两条重链组成并且在例如骆驼中天然存在(例如，hamers-casterman(1993)nature363:446)；thiomabs(roche,wo2011069104)，链交换工程化域(seed或seed-body)，其是不对称的且双特异性抗体样的分子(merck,wo2007110205)；triomab(pharma/freseniusbiotech,lindhoferetal.1995jimmunol155:219；wo2002020039)；fcδadp(regeneron,wo2010151792)，azymetricscaffold(zymeworks/merck,wo2012/058768)，mab-fv(xencor,wo2011/028952)，xmab(xencor)，双重可变域免疫球蛋白(abbott,dvd-ig,美国专利no.7,612,181)；双重域双头抗体(unilever；sanofiaventis,wo20100226923)，双二抗体(di-diabody)(imclone/elililly)，突出-入-空穴(knobs-into-holes)抗体形式(genentech,wo9850431)；duobody(genmab,wo2011/131746)；双特异性igg1和igg2(pfizer/rinat,wo11143545)，duetmab(medimmune,us2014/0348839)，静电转向(electrostaticsteering)抗体形式(amgen,ep1870459和wo2009089004；chugai,us201000155133；oncomed,wo2010129304a2)；双特异性igg1和igg2(rinatneurosciencescorporation,wo11143545)，crossmabs(roche,wo2011117329)，luz-y(genentech)，biclonic(merus,wo2013157953)，双重靶向域抗体(gsk/domantis)，识别两种靶物的二合一抗体或双重作用fab(genentech,novimmune,adimab)，交联的mab(karmanoscancercenter)，共价融合的单抗(aimm)，covx-body(covx/pfizer)，fynomab(covagen/janssenilag)，dutamab(dutalys/roche)，imab(medimmune)，igg样双特异性(imclone/elililly,shen,j.,etal.jimmunolmethods,2007.318(1-2):p.65-74)，tig-body，dig-body和pig-body(pharmabcine)，双重亲和力再靶向分子(fc-dart或ig-dart,macrogenics,wo/2008/157379,wo/2010/080538)，beat(glenmark)，zybodies(zyngenia)，用共同轻链的方法(crucell/merus,us7262028)或用共同重链的方法(kλbodies，novimmune,wo2012023053)，以及包含与含有fc区的抗体片段融合的多肽序列的融合蛋白，如scfv融合物，如zymogenetics/bms的bsab，biogenidec的hercules(us007951918)，emergentbiosolutions/trubion和zymogenetics/bms的scorpions，ts2ab(medimmune/az(dimasi,n.,etal.jmolbiol,2009.393(3):p.672-92)，genetech/roche的scfv融合物，novartis的scfv融合物，immunomedics的scfv融合物，changzhouadambiotechinc的scfv融合物(cn102250246)，roche的tvab(wo2012025525,wo2012025530)，f-star的mab2(wo2008/003116)和双重scfv融合物。还应当理解，除非另有规定，术语抗体也包括多克隆抗体、单克隆抗体(如人单克隆抗体)、抗体混合物(重组多克隆)例如通过symphogen和merus(oligoclonics)开发的技术生成的，如wo2015/158867中描述的多聚体fc蛋白，如wo2014/031646中描述的融合蛋白和抗体样多肽，如嵌合抗体和人源化抗体。所生成的抗体可潜在地拥有任何同种型。在本文中使用时，术语“全长抗体”指含有与在该同种型的野生型抗体中通常找到的那些重链和轻链恒定域和可变域对应的全部重链和轻链恒定域和可变域的抗体(例如亲本抗体)。如本文中所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。然而，如本文中所用，术语“人抗体”不意图包括如下的抗体，其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的cdr序列被嫁接到人框架序列上。如本文所用，术语“嵌合抗体”指其中的两种链类型(即重链和轻链)由于抗体工程而是嵌合的抗体。嵌合链是含有与人起源恒定区连接的外来可变域(源自非人物种，或合成的或从包括人的任何物种工程化改造而来)的链。如本文所用，术语“人源化抗体”指其中的两种链类型由于抗体工程而人源化的抗体。人源化链通常是其中的可变域的互补决定区(cdr)为外来的(源自除人以外的物种或合成的)，而链的剩余部分是人起源的链。人源化评估基于所得的氨基酸序列，而不是基于方法本身，这允许使用除植入之外的方案。如本文所用，术语“单克隆抗体”、“单克隆ab”、“单克隆抗体组合物”、“单抗”等指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单抗可以通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因或转染色体非人动物(例如转基因小鼠)获得的b细胞，该b细胞具有包含人重链转基因全集和轻链转基因全集的基因组(经重排以产生功能性人抗体)，并与永生化细胞融合。如本文中所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga1、igga2、ige、或igm或其任何同种异型如igg1m(za)和igg1m(f))。此外，每个重链同种型可与kappa(k)或lambda(λ)轻链组合。本文使用的术语“混合同种型”指通过将一种同种型的结构特征与来自另一同种型的类似区域组合，从而产生杂合同种型而产生的免疫球蛋白的fc区。混合同种型可以包含fc区，所述fc区具有包含两种或更多种同种型的序列，所述同种型选自以下igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga1、igga2、ige、或igm，从而产生组合，诸如例如igg1/igg3、igg1/igg4、igg2/igg3、igg2/igg4或igg1/iga。如本文所用，术语“抗原结合区”、“抗原结合区”，“结合区”或抗原结合域指能够结合抗原的抗体区域。此结合区通常由抗体的vh和vl域定义，它们可以进一步细分为高变性区(或高变区，其可以是序列和/或结构上定义的环形式上高变的)，也称为互补决定区(cdr)，散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。抗原可以是任何分子，如多肽，例如存在于细胞、细菌或病毒体上。如本文所用，术语“靶物”指与抗体的抗原结合区结合的分子。靶物包括制备的抗体所针对的任何抗原。就抗体而言，术语“抗原”和“靶物”可以互换使用，并且就本发明的任何方面或实施方案而言构成相同的含义和目的。术语“表位”指能够特异性结合抗体可变域的蛋白质决定簇。表位通常由分子，如氨基酸、糖侧链或其组合的表面分组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合而非后者的结合丧失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和其他不直接参与结合的氨基酸残基。本发明的“抗体”或“抗体变体”或“亲本抗体的变体”是与“亲本抗体”相比包含一个或多个突变的抗体分子。不同的术语可以互换使用，并就本发明的任何方面或实施方案而言构成相同的含义和目的。示例性亲本抗体形式包括但不限于野生型抗体、全长抗体或含fc的抗体片段、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其任何组合。类似地，本发明的“多肽”或“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽的变体”或“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的亲本多肽的变体”是“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的多肽”，其与“包含免疫球蛋白的fc区和结合区的亲本多肽”相比包含一个或多个突变。不同的术语可以互换使用，并且就本发明的任何方面或实施方案而言构成相同的含义和目的。氨基酸取代可以将天然氨基酸交换为另一种天然存在的氨基酸，或者非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在本发明的背景中，保守取代可以通过以下三个表中的一个或多个中反映的氨基酸类别内的取代来定义：用于保守取代的氨基酸残基类别备选的保守氨基酸残基取代类别1ast2de3nq4rk5ilm6fyw氨基酸残基的备选物理和功能分类在本发明的背景中，变体中的取代表示为：初始氨基酸-位置-取代的氨基酸使用三字母码或单字母码，包括代码xaa和x来表示氨基酸残基。因此，标记“e345r”或“glu345arg”意为在对应于亲本抗体中的345位氨基酸的变体氨基酸位置中包含以精氨酸取代谷氨酸的取代的变体。当位置本身不存在于抗体中，但变体包含氨基酸插入时，例如：位置-取代的氨基酸；使用标记，例如“448e”。此类符号就一系列同源多肽或抗体中的修饰而言特别相关。类似地，当取代氨基酸残基的身份不重要时：初始氨基酸-位置；或“e345”。对于初始氨基酸和/或取代的氨基酸可以包含超过1个但非全部氨基酸的修饰，345位处谷氨酸取代为精氨酸、赖氨酸或色氨酸：可以在本发明的背景中互换使用“glu345arg,lys,trp”或“e345r,k,w”或“e345r/k/w”或“e345至r、k或w”。此外，术语“取代”涵盖取代为其他19种天然氨基酸的任一种，或取代为其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如，345位氨基酸e的取代包括下列取代的每种：345a、345c、345d、345g、345h、345f、345i、345k、345l、345m、345n、345p、345q、345r、345s、345t、345v、345w和345y。这相当于名称345x，其中x指任意氨基酸。这些取代也可以被称为e345a、e345c等，或e345a,c等，或e345a/c/等。这类似适用于本发明中提及的每一个位置，以在本文中明确包括此类取代的任一个。如本文所用，术语“效应细胞”指与免疫应答的识别和活化阶段相反参与免疫应答的效应器阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包括髓样或淋巴样起源的细胞，例如淋巴细胞(如b细胞和t细胞，包括溶细胞t细胞(ctl))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜曙红细胞、多形核细胞，例如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达fc受体(fcr)或补体受体并发挥特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞诸如例如天然杀伤细胞能够诱导adcc。例如，表达fcr的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞和kupffer细胞参与靶细胞的特异性杀伤并将抗原呈递给免疫系统的其他组分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，adcc可以通过抗体驱动的经典补体活化进一步增强，导致活化的c3片段沉积在靶细胞上。c3切割产物是在髓样细胞上表达的补体受体(cr)(例如cr3)的配体。效应细胞上cr对补体片段的识别可以促进增强的fc受体介导的adcc。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体活化导致靶细胞上的c3片段。这些c3切割产物可以促进直接补体依赖性细胞性细胞毒性(cdcc)。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原、靶颗粒或靶细胞。效应细胞上特定fcr或补体受体的表达可以通过体液因子如细胞因子调节。例如，已经发现fcγri的表达被干扰素γ(ifnγ)和/或g-csf上调。此种增强的表达增加携带fcγri的细胞对靶物的细胞毒性活性。效应细胞可以吞噬靶抗原或吞噬或裂解靶细胞。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体活化导致靶细胞上的c3片段。这些c3切割产物可以通过效应细胞促进直接吞噬作用或通过增强抗体介导的吞噬作用间接促进。如本文所用，术语“fc效应器功能”意指作为使多肽或抗体与其在细胞膜上靶物(如抗原)结合的结果的功能，其中fc效应器功能可归因于多肽或抗体的fc区。fc效应器功能的实例包括(i)c1q结合，(ii)补体活化，(iii)补体依赖性细胞毒性(cdc)，(iv)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，(v)fc-γ受体结合，(vi)抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，(vii)补体依赖性细胞性细胞毒性(cdcc)，(viii)补体增强的细胞毒性，(ix)由抗体介导的调理抗体对补体受体的结合，(x)调理作用，和(xi)(i)至(x)中任一项的组合。如本文所用，术语“聚簇依赖性功能”意指在多肽或抗体与其抗原结合，任选地在细胞上，细胞膜上，在病毒体上寡聚化后形成抗原复合物的结果的功能。，或在另一个粒子上。聚类依赖性效应器功能的实例包括(i)抗体寡聚体形成，(ii)抗体寡聚体稳定性，(iii)抗原寡聚体形成，(iv)抗原寡聚体稳定性，(v)细胞凋亡诱导，(vi)增殖调节，例如作为增殖减少，抑制或刺激，和(vii)(i)至(vi)中任一项的组合。如本文所用，术语“聚簇依赖性功能”意指作为与其抗原(任选在细胞上、在细胞膜上、在病毒体上、或在另一种颗粒上)结合的多肽或抗体的寡聚化后抗原复合物形成的结果的功能。聚簇依赖性效应器功能的实例包括(i)抗体寡聚体形成，(ii)抗体寡聚体稳定性，(iii)抗原寡聚体形成，(iv)抗原寡聚体稳定性，(v)凋亡诱导，(vi)增殖调节，如增殖减少、抑制或刺激，和(vii)(i)至(vi)中任一项的组合。如本文所用，术语“激动性”理解为细胞膜上受体的刺激或活化，导致生物应答，如胞内信号传导。此类激动效应可以导致凋亡(程序性细胞死亡)的诱导或免疫细胞活化，或细胞内途径的活化。如实施例2中所述，使用以下步骤，可以在针对表达胞内死亡域的靶物的抗体的存活力测定法中测定激动活性或增加的激动活性：i)在聚苯乙烯96孔平底板中接种表达响应抗体的靶物(例如dr5)的细胞系，37℃过夜，ii)添加一定范围(0.0003至20,000ng/ml)内的抗体(例如抗dr5抗体)的连续稀释，并且37℃温育3天，iii)通过量化atp的存在来测定细胞存活力，例如通过使用celltiler-glo发光细胞存活力测定法进行，iv)使用下式计算活细胞：％活细胞＝[(抗体样品发光-星状孢子素样品发光)/(无抗体样品发光-星状孢子素样品发光)]*100。如实施例29、30、31和32中所述，使用以下步骤，可以在针对活化胞内信号传导途径的靶物的抗体的报告物测定法中测定激动活性或增加的激动活性：i)接种用靶物(例如ox40、4-1bb、cd40或gitr)和nfat响应元件表达下游的萤光素酶报告物基因稳定转染的jurkat细胞，37℃将细胞在96孔平底板中温育，ii)添加范围为例如19.5至5,000ng/ml的抗体(例如抗-ox4，抗-cd1抗体，抗-cd40抗体或抗-gitr抗体)的连续稀释，并温育5小时，iii)对细胞添加萤火虫萤光素酶底物(5’-氟荧光素)并温育5-10分钟，iv)使用envisionmultilable读板仪测定发光。如本文中所用，术语“载体”意指能够诱导连接到载体中的核酸区段的转录的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是一种环形双链dna环的形式。另一种类型的载体是病毒载体，其中核酸区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够它们被导入的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加体型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞内后整合到宿主细胞的基因组中，并且借此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与之可操作连接的基因的表达。这类载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般地，在重组dna技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包含表达载体的这类其它形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥同等的功能。如本文中所用，术语“重组细胞”(或简称作“宿主细胞”)意指其中引入了表达载体的细胞。应当理解，这类术语意图不仅指特定的受试者细胞，还指这类细胞的后代。因为在连续传代过程中由于突变或环境影响可能发生某些修饰，所以这类后代可能实际上与亲本细胞不相同，但是仍然包含如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如转染瘤，例如cho细胞、hek-293细胞、per.c6、ns0细胞和淋巴细胞，以及原核细胞如大肠杆菌(e.coli)和其他真核宿主如植物细胞和真菌。如本文中所用，术语“转染瘤”包括表达抗体或靶抗原的重组真核宿主细胞，例如cho细胞、per.c6、ns0细胞、hek-293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。术语“制剂”指抗体变体的制备物和不同抗体变体的混合物，其在与同细胞(例如，在细胞表面上表达的抗原)、细胞膜、病毒体或其他结构相关的抗原相互作用时具有增加的形成寡聚体的能力，这可导致增强的由抗原进行的信号传导和/或活化。如本文中所用，术语“亲和力”是一个分子(例如抗体)与另一个(例如靶物或抗原)在单个位点处的结合强度，如抗体与抗原的个别抗原结合位点的单价结合。如本文中所用，术语“亲合力”是两个结构之间，如同时与靶物相互作用的抗体的多个抗原结合位点之间，或例如抗体与c1q之间的多个结合位点的组合强度。当存在超过一个结合相互作用时，仅当所有结合位点解离时两个结构才会解离，因此，解离速率会比个别结合位点的解离速率慢，并由此与个别结合位点结合的强度(亲和力)相比提供更大的有效总结合强度(亲合力)。如本文所用，术语“寡聚体”指与至少原则上由无限数目的单体组成的聚合物相反，由超过一个但是有限数目的单体单元(例如抗体)组成的分子。示例性的寡聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。希腊前缀通常用于表示寡聚体中单体单元的数目，例如四聚体由四个单元组成，六聚体由六个单元组成。如本文所用，术语“寡聚化”意指将单体转化为有限的聚合度的过程。在本文中，观察到包含根据本发明的靶结合区的多肽、抗体和/或其他二聚体蛋白可以在靶物结合(例如在细胞表面处)后通过fc-区的非共价结合形成寡聚体，例如六聚体。如本文所用，术语“聚簇”意指通过非共价相互作用使抗体、多肽、抗原或其他蛋白质寡聚化。如本文所用，术语“fc-fc增强”意指增加两个含fc区的抗体或多肽的fc区之间的结合强度或稳定所述fc区之间的相互作用，使得多肽在靶物结合后形成寡聚体。如本文所用，fc-fc增强取代指对应于根据eu编号的人igg1的以下位置中的取代：e430、e345或s440，条件是s440位的取代是s440y或s440w。因此，如本文所用的fc-fc增强取代指以下氨基酸取代e430g、e345k、e430s、e430f、e430t、e345q、e345r、e345y、s440w和s440y。在一个优选的实施方案中，fc-fc增强取代是e430g或e345k。如本文所用，术语“c1q结合”意指c1q与多肽或抗体之间的直接相互作用。直接c1q结合可以例如通过在人工表面上使用固定化抗体来评估(如实施例4、5和6中所述)。当与细胞或病毒体表面上的预先确定的抗原结合时，可以评估导致c1q与抗体寡聚体的高亲合力结合的多价相互作用。可以在elisa测定法中使用以下步骤测定c1q与多肽或抗体的结合：i)于4c用100μlpbs中的1μg/ml多肽或抗体将96孔microlonelisa板包被过夜，ii)37c将该板与100μl/孔的c1q连续稀释系列一起温育1小时，最终c1q浓度范围30-0.01μg/ml，以3倍稀释，iii)于室温将该板与100μl/孔的兔抗人c1q一起温育1小时，iv)于室温将板与100μl/孔猪抗兔igg-hrp一起温育1小时，v)于室温将具有100μl/孔底物的板与1mg/ml2,2'-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)温育15分钟，vi)通过添加100μl2％草酸/孔终止反应。在biotekel808微板阅读器中在405nm处测量吸光度。如本文中所用，术语c1q结合取代意指包含免疫球蛋白fc区和抗原结合区的多肽中增强与c1q的直接相互作用的取代。增强的c1q结合可以例如导致c1q与包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽之间的相互作用的ec50降低，其根据上述测定c1q结合的方法测量。如本文中所用，术语“补体活化”是指经典补体途径的活化，其由称为c1的大型大分子复合物与表面上的抗体-抗原复合物结合而起始。c1是复合物，其由6个识别蛋白c1q和丝氨酸蛋白酶的异四聚体c1r2c1s2组成。c1是涉及一系列切割反应的经典补体级联早期事件中的第一个蛋白质复合物，所述一系列切割反应开始于c4切割成c4a和c4b以及c2切割成c2a和c2b。c4b被沉积并且与c2a一起形成称为c3转化酶的酶促活性转化酶，该转化酶将补体成分c3切割成c3b和c3a，其形成c5转化酶。此种c5转化酶将c5两分为c5a和c5b，并且最后一种成分被沉积在膜上，并且继而触发补体活化的晚期事件，其中末端补体成分c5b、c6、c7、c8和c9组装成膜攻击复合物(mac)。补体级联导致在细胞膜中创建孔，这引起细胞裂解，也称为补体依赖性细胞毒性(cdc)。可以通过使用c1q功效、cdc动力学cdc测定法(如wo2013/004842,wo2014/108198中所述)或通过beurskens等2012年4月1日vol.188no.73532-3541描述的c3b和c4b的细胞沉积方法来评估补体活化。如本文中所用，术语“补体依赖性细胞毒性”(“cdc”)意指抗体介导的补体活化过程，当抗体与其在细胞或病毒体上的靶物结合时由于由mac装配体创建的膜中的孔而导致细胞或病毒体的裂解。如本文中所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(“adcc”)意指通过表达识别结合抗体的恒定区的fc受体的细胞杀死抗体包被的靶细胞或病毒体的机制。如本文中所用，术语“抗体依赖性细胞吞噬”(“adcp”)意指通过吞噬细胞内化消除抗体包被的靶细胞或病毒体的机制。内化的抗体包被的靶细胞或病毒体包含在称为吞噬体的囊泡中，然后该囊泡与一个或多个溶酶体融合以形成吞噬溶酶体。可以通过使用用巨噬细胞作为效应细胞的体外细胞毒性测定法和视频显微术来评估adcp，如由vanbij等，于journalofhepatology第53卷,第4期,2010年10月,第677–685页描述。如本文中所用，术语“补体依赖性细胞性细胞毒性”(“cdcc”)意指由于抗体介导的补体活化由表达识别与靶细胞或病毒体共价结合的补体3(c3)切割产物的补体受体的细胞杀死靶细胞或病毒体的机制。可以以与针对adcc描述的类似方式评估cdcc。如本文中所用，术语“血浆半衰期”指在消除期间(分布阶段后)将血浆中多肽浓度降低至其初始浓度的一半所花费的时间。对于抗体，分布阶段通常为1-3天，在此期间，由于血浆和组织之间的重新分布，血浆浓度降低约50％。血浆半衰期可通过本领域公知的方法测量。如本文中所用，术语“血浆清除率”是在对活生物体施用时多肽从血液中除去的速率的定量测量。血浆清除率可以计算为剂量/auc(ml/天/kg)，其中auc值(曲线下面积)从浓度-时间曲线测定。如本文中所用，术语“抗体-药物缀合物”指对至少一种类型的恶性细胞具有特异性的抗体或含fc的多肽、药物和将药物与例如抗体偶联的接头。接头在存在恶性细胞的情况下是可切割的或不可切割的；其中抗体-药物缀合物杀死恶性细胞。如本文中所用，术语“抗体-药物缀合物摄取”指抗体-药物缀合物与细胞上的靶物结合，然后被细胞膜摄取/吞噬，从而被吸入细胞中的过程。如wo2011/157741中所述，抗体-药物缀合物摄取可以作为“在体外杀伤测定法中通过抗tfadc进行的抗体介导的内化和细胞杀伤”评估。如本文中所用，术语“凋亡”指可在细胞中发生的程序性细胞死亡(pcd)的过程。生化事件导致特征性细胞变化(形态学)和死亡。这些变化包括起泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质浓缩和染色体dna片段化。抗体对某种受体的结合可以诱导凋亡。如本文中所用，术语“程序性细胞死亡”或“pcd”指由胞内程序介导的任何形式的细胞死亡。存在不同形式的pcd，各种类型的pcd的共同之处在于它们通过活性细胞过程来执行，所述活性细胞过程可以通过干扰胞内信号传导而被截获。在一个具体实施方案中，可以通过用缀合的膜联蛋白v染色细胞或组织，与磷脂酰丝氨酸暴露相关来测定细胞或组织中任何形式的pcd的发生。如本文所用，术语“膜联蛋白v”指膜联蛋白组中结合细胞表面上的磷脂酰丝氨酸(ps)的蛋白质。如本文中所用，术语“fcrn”意指为fc受体的新生儿fc受体。它在啮齿类中以独特的受体第一次被发现，所述独特的受体能够将igg从母乳中通过新生啮齿类肠道上皮细胞转运到新生儿血流中。进一步的研究揭示了人中的类似受体。然而，在人中，在胎盘中发现它帮助促进母体igg向生长的胎儿的转运，并且其也已经显示在监测igg周转中发挥作用。fcrn在6.0-6.5的酸性ph，但不在中性或更高的ph结合igg。因此，fcrn可以从微酸性ph的肠腔(肠的内部)中结合igg，并确保向ph中性到碱性(ph7.0-7.5)的基底侧有效单向转运。此受体在igg成人救助中也通过其在内皮细胞内吞途径中的发生起作用。酸性内体中的fcrn受体结合通过胞饮作用内化的igg，将其再循环到细胞表面，于血液的碱性ph将其释放，由此防止其经历溶酶体降解。此机制可以提供了与其他同种型相比更大的血液中igg半衰期的解释。如本文中所用，术语“蛋白a”意指最初在细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的细胞壁中发现的56kdamscramm表面蛋白。它由spa基因编码，并且其调节受dna拓扑结构、细胞渗透压和称为arls-arlr的双组分系统控制。由于其结合免疫球蛋白的能力，它也在生物化学研究中得到应用。它由折叠到三螺旋束中的5个同源ig结合域组成。每个域能结合来自许多哺乳动物物种的蛋白，最显著的是igg。它结合大多数免疫球蛋白的重链fc区(与fcrn受体的保守结合位点重叠)，并也与人vh3家族的fab区域相互作用。通过血清中的这些相互作用，igg分子通过其fc区而不是单纯通过其fab区域结合细菌，由此细菌破坏调理、补体活化和吞噬作用。如本文中所用，术语“蛋白g”意指在组c和g链球菌细菌中表达的免疫球蛋白结合蛋白，其很类似蛋白a但有不同的特异性。它是65kda(g148蛋白g)和58kda(c40蛋白g)细胞表面蛋白，其已经在通过其对fc区的结合纯化抗体中得到应用。本发明的具体实施方案如本文所述，令人惊讶的是，多肽或抗体的fc区中氨基酸的取代给多肽或抗体提供了增强的效应器功能，例如cdc和/或激动活性。本发明人发现，通过引入增强fc-fc相互作用的取代，如选自下组的位置处的取代：e430、e345和s440以及c1q结合取代，可以增强多肽或抗体的fc效应器功能。此外，本发明人还发现fc-fc增强突变和c1q结合取代的组合可以产生具有激动特性或增强的激动特性的多肽，如抗体。在一个方面，本发明提供了包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自下组的位置处的至少一个fc-fc增强取代：e430、e345和s440，条件是s440中的突变是s440y或s440w，和b)至少一个c1q结合取代，其中位置对应于根据eu编号(edelmanetal.,procnatlacadsciusa.1969年5月；63(1):78-85；kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版1991nihpublicationno.91-3242)的人igg1。在本发明的一个方面，提供了包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，和b)在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。认为对应于e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代是根据本发明的fc-fc增强取代。认为选自下组的一个或多个位置处的取代是根据本发明的c1q结合取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。在以下位置e430、e345或s440之一中的突变在多肽或抗体中引入增强的fc-fc相互作用和寡聚化的效应，条件是s440中的突变是s440y或s440w。当多肽或抗体的抗原结合区与相应的靶抗原结合时，发生增强的寡聚化。增强的寡聚化产生寡聚体，例如六聚体。寡聚结构(如六聚体)的产生具有通过增加多肽的c1q结合亲合力增加fc效应器功能，例如cdc的效应。fc-fc增强突变与c1q结合取代(如在选自下组的位置处的一个或多个取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396)的组合产生具有增强的效应器功能的多肽或抗体。fc-fc增强取代和c1q结合取代的组合进一步具有产生具有激动活性的多肽或抗体的效应。在一个实施方案中，当与亲本多肽或亲本抗体相比时，多肽或抗体可以具有增加的激动活性。当通过结合细胞表面受体活化胞内信号传导途径时，根据本发明的多肽或抗体是特别令人感兴趣的。在根据本发明的一个实施方案中，具有fc-fc增强取代和c1q结合取代的多肽或抗体的增加或增强的fc效应器功能或活性应当理解为此时将多肽或抗体与亲本多肽或亲本抗体比较，也就是说，亲本多肽或亲本抗体没有根据本发明的取代，但在其他方面是相同的。本发明允许新的基于多肽或抗体的治疗剂具有增加的特性如cdc，激动活性。也就是说，根据本发明的多肽或抗体具有增加的根据fc区的特性(如cdc)，并且它们也具有增加的根据抗原结合区的特性(如激动活性)。在一个方面，本发明提供了包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自e430，e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，或b)在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含在选自e430，e345的位置处的至少一个取代或s440y或s440w取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含在选自下组的两个或三个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的c1q结合取代：i)k326、e333位处的两个c1q结合取代ii)k326、e333和p396位处的三个c1q结合取代，和iii)s267、h268和s324位处的三个c1q结合取代。在本发明的一个实施方案中，一个或多个c1q结合取代在选自下组的位置处：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396、条件是g236位的取代不是g236f、g236r、g236y。在本发明的一个实施方案中，一个或多个c1q结合取代在选自下组的位置处：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396、条件是s267位处的取代不是s267h、s267i、s267k、s267g。在本发明的一个实施方案中，一个或多个c1q结合取代在选自下组的位置处：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396、条件是h268位处的取代不是h268k、h268d、h268e。在本发明的一个实施方案中，至少一个fc-fc增强取代选自下组：e430g、e345k、e430s、e430f、e430t、e345q、e345r、e345y、s440w和s440y。在本发明的一个实施方案中，至少一个fc-fc增强取代选自下组：e430g、e430s、e430f和e430t。在本发明的一个实施方案中，至少一个fc-fc增强取代选自下组：e345k、e345q、e345r和e345y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e430g取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e345k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e345r取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有s440y取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的至少一个取代：e430g、e430s、e430f和e430t和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的至少一个取代：e430g、e430s、e430f和e430t和选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，fc区包含e430g取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少包含选自下组的取代：e345k、e345q、e345r和e345y，和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少包含选自下组的取代：e345k、e345q、e345r和e345y和选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，fc区包含e345k取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，fc区包含e345r取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，fc区至少包含选自下组的取代：s440y或s440w和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，fc区至少包含选自下组的取代：s440y或s440w和选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，fc区包含s440y取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396。本文提供了实施方案，其允许细胞表面抗原结合后多肽或抗体的增强的c1q结合和/或激动特性。在一个实施方案中，多肽或抗体包含增强的激动特性。在一个实施方案中，多肽或抗体包含fc区，其包含第一重链和第二重链，其中上述取代之一可以存在于第一和/或第二重链中。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个位置处的取代，诸如两个或三个取代:k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含p396和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326、e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和选自下组的一个或多个位置，诸如两个或三个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和k326和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和k326和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和k326、e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和选自下组的一个或多个位置，诸如两个或三个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和k326和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和k326和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和k326、e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和和选自下组的一个或多个位置，诸如两个或三个位置处的取代：k326、e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w处的取代和k326和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w处的取代和k326和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w处的取代，e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w处的取代，k326、e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的k326位处的取代：k326w、k326a、k326d、k326n、k326g、k326f、k326e、k326f,k326y、k326h和k326m。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的e333位处的取代：e333s、e333a、e333t和e333g。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的e396位处的取代：e396l、e396i、e396v、e396q、e396n和e396a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326w、e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326w、e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326w、e333t和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326a、e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326a、e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326w取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333t取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333s。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333s。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a、e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326s、e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w、e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w、e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w、e333t和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的位置处的一个或多个c1q结合取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的位置处的一个或多个取代，诸如两个或三个取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267和h268位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267、h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和s267和h268位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和s267和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和s267、h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和选自下组的一个或多个位置处的取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和s267和h268位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和s267和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含ee345位处的取代和s267、h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和选自下组的一个或多个位置处的取代：ss267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和选自下组的一个或多个位置，诸如两个或三个位置处的取代：s267、h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和s267和h268位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和s267和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s440y或s440w和s267、h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，一个或多个取代选自下组：s267e、h268f和s324t.在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个取代，诸如两个或三个取代：s267e、h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含h268f取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s324t取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e和h268f。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e、h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含a)选自下组的位置处的至少一个取代：e430、e345或s440y或s440w取代和b)至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333tviii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。本文提供了实施方案，其中一个取代在e430位处。在一个实施方案中，e430位处的取代选自下组：e430g、e430s、e430f,e430t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g取代和选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430s、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430s、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430s、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430s、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430f、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430f、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含ane430f、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430f、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430t、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430t、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430t、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430t、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。本文中提供了实施方案，其中一个取代在e345位处。在一个实施方案中，e345位处的取代选自下组：e345k、e345q、e345r、e345y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k取代和至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r取代和至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345q、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345q、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345q、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345q、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345y、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345y、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345y、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345y、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w取代和至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y取代和至少选自下组之一的取代：i.k326a，ii.e333a，iii.e333t，iv.p396l，v.e333s，vi.k326w、e333s，vii.k326w、e333t，viii.k326a、e333a，ix.k326a、k333a、p396l，x.s267e、h268f，xi.s267e、s324t，xii.h268f、s324t，xiii.s267e、h268f、s324t，和xiv.s324、i332。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440w、k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440w、k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440w、k333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440w、k326a、e333a和p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体进一步包含选自下组的一个或多个取代：g236a、i332e、s239d和i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体进一步包含选自下组的至少两个取代：i.g236a、i332e，和ii.s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含a)选自下组的位置处的至少一个取代：e430、e345或s440y或s440w取代和b)选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430位处的取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345位处的取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y或s440w取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y取代和至少选自下组之一的取代：i.h268f、s324t、g236a、i332e，ii.h268f、s324t、s239d、i332e，iii.s267e、h268f、s324t、g236a、i332e，和iv.s267e、h268f、s324t、s239d、i332e。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含一个或多个进一步的取代。也就是说，在本发明的一个实施方案中，根据本文中所述的任何方面或实施方案的多肽或抗体在fc区中包含一个或多个进一步的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含对应于k439位的进一步的取代或者在fc区不包含s440位处的取代的情况下，进一步的取代可以在s440位处。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含对应于k439或s440位的多肽或抗体中的进一步的取代，条件是s440的取代不是s440y或s440w。包含根据本发明的fc-fc增强取代和c1q结合取代和s440位处的进一步取代诸如s440k的多肽或抗体不与包含s440处的取代诸如s440k的多肽或抗体形成寡聚体。包含根据本发明的fc-fc增强取代和c1q结合取代和k439位处的进一步取代诸如k439e的多肽或抗体不与包含k439处的突变诸如k439e的多肽或抗体形成寡聚体。在本发明的一个实施方案中，进一步的取代选自s440k或k439e。在本发明的一个实施方案中，fc区包含进一步的取代，其是对应于人igg1eu编号中的k439e或s440k的六聚化抑制取代。也就是说，在本发明的一个实施方案中，fc区包含fc-fc增强取代诸如e430g和六聚化抑制取代k439e。在本发明的一个实施方案中，fc区包含fc-fc增强取代诸如e345k和六聚化抑制取代k439e。在本发明的另一个实施方案中，fc区包含fc-fc增强取代诸如e430g和六聚化抑制取代s440k。在本发明的一个实施方案中，fc区包含fc-fc增强取代诸如e345k和六聚化抑制取代s440k。本文提供了实施方案，其允许包含k439e取代的抗体和包含s440k取代的抗体的组合之间的专有性六聚化。也就是说，抑制取代k439e和s440k可以视为互补取代。具有两个不同互补六聚化抑制取代的抗体的组合在具有含有不同特异性的两种不同抗体的组合物中可以是特别感兴趣的。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含a)选自下组的位置处的取代：e430、e345和s440,条件是s440的取代不是s440y或s440w和b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396和c)k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含a)选自下组的位置处的取代：e430和e345和b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396和c)s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326w、e333s和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326a、e333a和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326a、e333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326w、e333s和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326a、e333a和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326a、e333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326w、e333s和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326a、e333a和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326a、e333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k326w、e333s和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k326a、e333a和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s440y、k326a、e333a、p396l和k439e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含a)选自下组的位置处的取代：e430和e345，和b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396和c)s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326w、e333s和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326a、e333a和s440s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k333a、p396l和s440s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e430g、k326a、e333a、p396l和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326w、e333s和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326a、e333a和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k333a、p396l和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345k、k326a、e333a、p396l和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326w、e333s和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326a、e333a和s440s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k333a、p396l和s440k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e345r、k326a、e333a、p396l和s440k取代。根据本发明的多肽或抗体至少具有fc-fc增强取代和一个或多个c1q结合取代，但如上所述也可以具有额外的取代以将额外的功能引入多肽或抗体中。在一个实施方案中，多肽或抗体至多包含10个取代，如9个取代，如8个取代，如7个取代，如6个取代，如5个取代，如4个取代，如3个取代或如2个取代。因此，提供了允许本发明的多肽或抗体具有额外的取代的实施方案，所述额外的取代将额外的特征引入多肽或抗体中。此外，额外的取代还允许fc区中在不参与fc-fc相互作用的位置处以及不参与fc效应器功能的位置中的变化。此外，额外的取代也可以是由于等位变异所致。在本发明的一个实施方案中，与亲本多肽或亲本抗体相比，多肽或抗体具有增加至少20％的fc效应器功能，所述亲本多肽或亲本抗体与抗体相同，只是它不包含fc区中的fc-fc增强取代和c1q结合取代。在本发明的一个实施方案中，与亲本多肽或亲本抗体相比，多肽或抗体具有增加至少40％、至少50％或至少60％的fc效应器功能，所述亲本多肽或亲本抗体与抗体相同，只是它不包含fc区中的fc-fc增强取代和c1q结合取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含增加的fc效应器功能。在本发明的一个实施方案中，fc效应器功能选自下组；补体依赖性细胞毒性(cdc)，补体依赖性细胞介导的细胞毒性，补体活化，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，抗体依赖性细胞介导的吞噬，c1q结合和fcγr结合。在一个实施方案中，fc效应器功能是fcγriiia信号传导。也就是说，根据本发明的第二突变能够降低至少一种fc效应器功能。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含激动活性。也就是说，当与亲本多肽或亲本抗体相比时，多肽或抗体包含激动活性。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含增强的激动活性。也就是说，与亲本多肽或亲本抗体相比，多肽或抗体包含增强的激动活性。在本发明的一个实施方案中，当与包含相同fc-fc增强突变但不含c1q结合突变的多肽或抗体相比时，多肽或抗体包含增强的激动活性。tnfr-sf受体的激动活性需要外源交联以实现激动活性。例如，这可以使用含有nf-kb驱动的分泌性报告物基因(例如表达萤光素酶的pmetluc-reportor基因，clontech)的hek293细胞在替代测定法中测量，所述hek293细胞用感兴趣的tnfr-sf受体稳定转染。受体的交联导致启动子活化和例如萤光素酶蛋白在培养基中的分泌。在期望的时间点，可以通过转移培养基样品和添加底物来测量萤光素酶活性。萤光素酶活性可以在发光计中测量，所述发光计是激动活性的量度。ox40的一个例子见zhangetal.jbiolchem.2016dec30；291(53):27134-27146。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含增加的激动活性。也就是说，与亲本多肽或亲本抗体相比，多肽或抗体包含增加的激动活性。在本发明的一个实施方案中，多肽是抗体、单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方案中，多肽是单特异性多肽、双特异性多肽或多特异性多肽。本发明的多肽不限于具有天然的fc域，例如人fc域抗体的抗体，而且它也可以是具有除本发明的突变以外的突变的抗体，诸如例如影响糖基化或使抗体能够成为双特异性抗体的突变。术语“天然抗体”是指不包含任何遗传上引入的突变的任何抗体。包含天然存在的修饰，例如不同同种异型的抗体理解为本发明意义上的“天然抗体”，因此可以理解为亲本抗体。此类抗体可以充当根据本发明的至少两个取代的模板，从而提供本发明的抗体。包含除本发明的取代以外的取代的亲本抗体的实例是如wo2011/131746(genmab)中所述的双特异性抗体，其利用还原条件促进包含igg4样ch3区的两个抗体的半分子交换，从而形成双特异性抗体，不伴随聚集体的形成。亲本抗体的其他实例包括但不限于双特异性抗体，例如异二聚体bispecifics：triomabs(fresenius)；双特异性igg1和igg2(rinatneurosciencescorporation)；fcδadp(regeneron)；突出-进入-空穴(genentech)；静电操纵(amgen,chugai,oncomed)；seedbodies(merck)；azymetric支架(zymeworks)；mab-fv(xencor)；和luz-y(genentech)。其他示例性亲本抗体形式包括但不限于野生型抗体、全长抗体或含fc的抗体片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其任何组合。在一个实施方案中，多肽或抗体包含含有r435h取代的fc区。在一个实施方案中，本发明提供了包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，其中fc区包含a)在选自e430,e345的位置处的取代或s440y或s440w取代，和b)在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324k326、i332、e333和p396，和c)r435h取代，其中这些位置对应于根据eu编号的人igg1。多肽或抗体可以是任何同种型的任何人抗体，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igd、igm、或iga，任选地人全长抗体，例如人全长igg1抗体。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体是人igg1抗体，例如igg1m(za)或igg1m(f)同种异型。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体具有fc区，其是人igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igd、igm、iga同种型或混合同种型。也就是说，根据本发明的多肽或抗体的fc区至少具有引入对应于人igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igd、igm、iga同种型或混合同种型的fc区中的第一和第二突变。在本发明的一个实施方案中，fc区是选自下组的混合同种型：igg1/igg2、igg1/igg3、igg1/igg4、igg2/igg3、igg2/igg4和igg3/igg4。在混合同种型中，fc区由来自超过一种同种型的氨基酸序列构成。在本发明的一个实施方案中，fc区是人igg1、igg2、igg3、igg4同种型或混合同种型。在本发明的一个实施方案中，fc区是人igg。在本发明的一个优选实施方案中，多肽或抗体具有fc区，其是人igg1同种型。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体具有fc区，其是igg1m(f)、igg1m(a)、igg1m(z)、igg1m(x)同种异型或混合同种异型。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含如seqidno:73、74、75、76、89、168、169或170所示的fc区，其中fc区包含选自对应于e430、e345和s440的组的位置中的取代，条件是s440中的取代是s440y或s440w，和在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396，其中所述位置对应于根据eu编号的人igg1。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含如seqidno:77、78或90所示的fc区，其中fc区包含在选自下组的一个或多个位置处的取代：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396，其中所述位置对应于根据eu编号的人igg1。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含seqidno:80、82、83、84、87或88所示的fc区。在本发明的一个实施方案中，多肽是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。多特异性抗体本发明的多肽不限于具有天然的fc域，例如人fc域抗体的抗体，而且它也可以是具有除本发明的突变以外的突变的抗体，诸如例如影响糖基化或使抗体能够成为多特异性抗体或双特异性抗体的突变。术语“天然抗体”是指不包含任何遗传上引入的突变的任何抗体。因此，包含天然存在的修饰，例如不同同种异型的抗体理解为本发明意义上的“天然抗体”，因此可以理解为亲本抗体。此类抗体可以充当根据本发明的至少两个取代的模板，从而提供本发明的抗体。包含除本发明的取代以外的取代的亲本抗体的实例是如wo2011/131746(genmab)中所述的双特异性抗体，其利用还原条件促进包含igg4样ch3区的两个抗体的半分子交换，从而形成双特异性抗体，不伴随聚集体的形成。亲本抗体的其他实例包括但不限于双特异性抗体，例如异二聚体bispecifics：triomabs(fresenius)；双特异性igg1和igg2(rinatneurosciencescorporation)；fcδadp(regeneron)；突出-进入-空穴(genentech)；静电操纵(amgen,chugai,oncomed)；seedbodies(merck)；azymetric支架(zymeworks)；mab-fv(xencor)；和luz-y(genentech)。其他示例性亲本抗体形式包括但不限于野生型抗体、全长抗体或含fc的抗体片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其任何组合。应当理解，本文所述的本发明的任何实施方案可用于下文所述的多特异性抗体方面。因此，在一个实施方案中，本发明的变体是选自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗体。在一个具体实施方案中，双特异性抗体具有wo2011/131746中描述的形式。本发明的双特异性抗体不限于特定的形式，并且它可以是本文所述的那些的任一种。在另一个方面，本发明涉及包含免疫球蛋白的第一重链和第一抗原结合区的作为双特异性多肽或抗体的多肽或抗体和包含免疫球蛋白的第二重链和第二抗原结合区的第二多肽或抗体，其中第一和第二抗原结合区结合相同或不同抗原上的不同表位，并且其中第一和/或第二重链包含：a)选自对应于以下的组的位置中的取代：e430、e345和s440，条件是s440中的取代是s440y或s440w，b)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s267,h268,s324,k326,i332,e333和p396，且c)其中第一重链包含选自下组的位置中的进一步取代：k409,t366,l368,k370,d399,f405和y407；和第二重链包含选自下组的位置中的进一步取代：f405,t366,l368,k370,d399,y407和k409，且其中第一多肽中的进一步突变不同于第二多肽中的进一步突变。在一方面，本发明提供了包含人igg的fc区的多肽或抗体，其包含第一重链和第二抗原结合区，第二重链和第二抗原结合区，其中所述第一和第二重链包含a)选自下组的位置处的取代：e430、e345和s440，条件是s440中的取代是s440y或s440w和b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236,s267,h268,s324,k326,i332,e333p396和c)f405或k409位中的进一步取代；其中进一步取代不同于第一重链和第二重链，从而若第一重链具有f405位中的取代，则第二重链具有k409中的取代且反之亦然。因此，提供了实施方案，其中第一重链和第二重链由于(c)进一步突变不位于第一和第二重链的相同位置中而不相同。应当理解，本文所述的本发明的任何实施方案可用于下文所述的多特异性抗体方面。因此，在一个实施方案中，本发明的变体是选自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗体。在一个具体的实施方案中，双特异性抗体具有wo2011/131746中描述的形式。在本发明的一个具体的实施方案中，第一重链包含对应于k409的进一步取代，诸如k409r；且第二重链包含对应于f405的进一步取代，诸如f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e430位的取代，b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236,s267,h268,s324,k326,i332,e333和p396，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于以下位的取代：e345，b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236,s267,h268,s324,k326,i332,e333和p396，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二fc重链包含a)对应于s440y或s440w的取代，b)选自下组的一个或多个位置处的取代：g236,s267,h268,s324,k326,i332,e333和p396，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二fc重链包含a)对应于e430g的取代，b)对应于k326w,e333s的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r，和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二fc重链包含a)对应于e430g的取代，b)对应于k326w,e333t的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r，和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二fc重链包含a)对应于e430g的取代，b)对应于k326a,e333a的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r，和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e430g的取代，b)对应于k333a,p396l的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r，和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e430g的取代，b)对应于k326a,e333a,p396l的三个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r，和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e430g的取代，b)对应于k326a,e333t,p396l的三个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r，和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345k的取代，b)对应于k326w,e333s的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345k的取代，b)对应于k326w,e333t的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345k的取代，b)对应于k326a,e333a的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345k的取代，b)对应于k333a,p396l的两个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345k的取代，b)对应于k326a,e333a,p396l的三个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345k的取代，b)对应于k326a,e333t,p396l的三个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345r的取代，b)对应于k326w,e333s的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345r的取代，b)对应于k326w,e333t的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345r的取代，b)对应于k326a,e333a的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r,和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345r的取代，b)对应于k333a,p396l的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r,和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于e345r的取代，b)对应于k326a,e333a,p396l的三个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r,和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于s440y的取代，b)对应于k326w,e333s的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r,和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于s440y的取代，b)对应于k326w,e333t的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r,和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于s440y的取代，b)对应于k326a,e333a的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r,和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于s440y的取代，b)对应于k333a,p396l的两个取代,和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二重链包含a)对应于s440y的取代，b)对应于k326a,e333a,p396l的三个取代，和c)其中第一重链包含对应于以下的进一步取代：k409r；和第二重链包含对应于以下的进一步取代：f405l。靶物和使用方法根据本发明的多肽或抗体可以结合活化信号转导途径的靶物。在一个实施方案中，靶物是活化、抑制、调控和/或调节信号转导途径的靶物。可以特别适合作为根据本发明的靶物的靶物实例是细胞表面受体和配体。例如，细胞表面受体包括属于受体家族的受体，例如造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族、tnf受体家族、g蛋白偶联受体家族、gpi锚定受体家族、酪氨酸磷酸酶受体家族、粘附因子家族和激素受体家族。涉及属于这些受体家族的受体及其特征的各种参考文献是可获得的，包括例如cookeba.,kingrjb.,vandermolenhj.ed.newcomprehensivebiochemistryvol.18b"hormonesandtheiractionspartπ"pp.1-46(1988)elseviersciencepublishersbv.,newyork,usa；patthyl.(1990)cell,61:13-14；ullricha.,etal.(1990)cell,61:203-212；massagulj.(1992)cell,69:1067-1070；miyajimaa.,etal.(1992)annu.rev.immunol.,10:295-331；tagat.andkishimotot.(1992)fasebj.,7:3387-3396；fantlwi.,etal.(1993)annu.rev.biochem.,62:453-481；smithca.,etal.(1994)cell,76:959-962；flowerdr.(1999)biochim.biophys.acta,1422:207-234；和m.miyasaka编,celltechnology,增补卷,手册系列,"handbookforadhesionfactors"(1994)(shujunsha,tokyo,japan)。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含抗原结合区，其中抗原结合区结合肿瘤坏死因子受体超家族(tnfr-sf)或g蛋白偶联受体(gpcr)超家族的成员。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体结合细胞表面受体，包括例如激素受体和细胞因子受体。示例性细胞因子受体包括例如造血因子受体、淋巴因子受体、生长因子受体、分化控制因子受体等。细胞因子受体的实例是促红细胞生成素(epo)受体、血小板生成素(tpo)受体、粒细胞集落刺激因子(g-csf)受体、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)受体、粒状巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)受体、肿瘤坏死因子(tnf)受体、白细胞介素-1(il-1)受体、白细胞介素-2(il-2)受体、白细胞介素-3(il-3)受体、白细胞介素-4(il-4)受体、白细胞介素-5(il-5)受体、白细胞介素-6(il-6)受体、白细胞介素-7(il-7)受体、白细胞介素-9(il-9)受体、白细胞介素-10(il-10)受体、白细胞介素-11(il-11)受体、白细胞介素-12(il-12)受体、白细胞介素-13(il-13)受体、白细胞介素-15(il-15)受体、干扰素-α(ifn-α)受体、干扰素-β(ifn-β)受体、干扰素-γ(ifn-γ)受体、生长激素(gh)受体、胰岛素受体、血液干细胞增殖因子(scf)受体、血管表皮生长因子(vegf)受体、表皮细胞生长因子(egf)受体、神经生长因子(ngf)受体、成纤维细胞生长因子(fgf)受体、血小板衍生生长因子(pdgf)受体、转化生长因子-β(tgf-β)受体、白细胞迁移抑制因子(lif)受体、睫状神经营养因子(cntf)受体、制瘤蛋白m(osm)受体和notch家族受体。肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)是以通过富含半胱氨酸的胞外域结合肿瘤坏死因子超家族(tnfsf)的配体的能力为特征的一组受体。tnf受体在质膜中形成三聚体复合物。tnfrsf包括下列29种蛋白质；tnfr1(uniprotp19438),fas(uniprotp25445),dr3(uniprotq93038),dr4(uniproto00220),dr5(uniproto14763),dr6(uniproto75509),ngfr(uniprotp08138),edar(uniprotq9une0),dcr1(uniproto14798),dcr2(uniprotq9ubn6),dcr3(uniproto95407),opg(uniproto00300),troy(uniprotq9ns68),xedar(uniprotq9hav5),ltbr(uniprotp36941),hvem(uniprotq92956),tweakr(uniprotq9np84),cd120b(uniprotp20333),ox40(uniprotp43489),cd40(uniprotp25942),cd27(uniprotp26842),cd30(uniprotp28908),4-1bb(uniprotq07011),rank(uniprotq9y6q6),taci(uniproto14836),blysr(uniprotq96rj3),bcma(uniprotq02223),gitr(uniprotq9y5u5),relt(uniprotq969z4)。一些tnfrsf参与凋亡并且包含胞内死亡域，例如fas、dr4、dr5、tnfr1、dr6、dr3、edar和ngfr。其他tnfrsf参与其他信号转导途径，如增殖、存活和分化，如dcr1、dcr2、dcr3、opg、troy、xedar、ltbr、hvem、tweakr、cd120b、ox40、cd40、cd27、cd30、4-1bb、rank、taci、blysr、bcma、gitr、relt。tnf受体在哺乳动物的极其多种组织中表达，特别是在白细胞中。在本发明的一个实施方案中，抗原结合区结合选自下组的tnfr-sf成员：fas、dr4、dr5、tnfr1、dr6、dr3、edar、ngfr、ox40、cd40、cd30、cd27、4-1bb、rank、taci、blysr、bcma、relt和gitr。在本发明的一个实施方案中，抗原结合区结合tnfr-sf的成员。在本发明的一个实施方案中，抗原结合区结合tnfr-sf的成员，其不包含胞内死亡域。在本发明的一个实施方案中，tnfr-sf选自：ox40、cd40、cd30、cd27、4-1bb、rank、taci、blysr、bcma、relt和gitr。在本发明的一个实施方案中，tnfr-sf选自：fas、dr4、dr4、tnfr1、dr6、dr3、edar、和ngfr。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合ox40的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合cd40的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合cd137的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合gitr的抗原结合区，其中iggfc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合gitr的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合gitr的抗原结合区，其中igg2fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。根据本发明的多肽或抗体可以结合任何靶物，根据本发明的此类靶物或抗原的实例可以是，针对的是：tnfr1,fas,dr3,dr4,dr5,dr6,ngfr,edar,dcr1,dcr2,dcr3,opg,troy,xedar,ltbr,hvem,tweakr,cd120b,ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr,relt。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合fas的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合dr5的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326a和e333a取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合dr5的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326a和e333t取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合dr5的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326a取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合dr5的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.e333a取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合dr5的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗体包含结合cd20的抗原结合区，其中igg1fc区包含a.e430g取代，和b.k326w和e333s取代。在本发明的一个实施方案中，抗原结合区结合肿瘤坏死因子超家族(tnf-sf)的成员：在本发明的一个实施方案中，抗原结合区结合选自下组的tnf-sf成员：淋巴毒素beta(tnf-c),ox40l,cd154,fasl,cd70,cd153,rankl,april和baff。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体结合细胞表面受体，包括例如激素受体和细胞因子受体。示例性细胞因子受体包括例如造血因子受体、淋巴因子受体、生长因子受体、分化控制因子受体等。细胞因子受体的实例是促红细胞生成素(epo)受体、血小板生成素(tpo)受体、粒细胞集落刺激因子(g-csf)受体、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)受体、粒状巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)受体、肿瘤坏死因子(tnf)受体、白细胞介素-1(il-1)受体、白细胞介素-2(il-2)受体、白细胞介素-3(il-3)受体、白细胞介素-4(il-4)受体、白细胞介素-5(il-5)受体、白细胞介素-6(il-6)受体、白细胞介素-7(il-7)受体、白细胞介素-9(il-9)受体、白细胞介素-10(il-10)受体、白细胞介素-11(il-11)受体、白细胞介素-12(il-12)受体、白细胞介素-13(il-13)受体、白细胞介素-15(il-15)受体、干扰素-α(ifn-α)受体、干扰素-β(ifn-β)受体、干扰素-γ(ifn-γ)受体、生长激素(gh)受体、胰岛素受体、血液干细胞增殖因子(scf)受体、血管表皮生长因子(vegf)受体、表皮细胞生长因子(egf)受体、神经生长因子(ngf)受体、成纤维细胞生长因子(fgf)受体、血小板衍生生长因子(pdgf)受体、转化生长因子-β(tgf-β)受体、白细胞迁移抑制因子(lif)受体、睫状神经营养因子(cntf)受体、制瘤蛋白m(osm)受体和notch家族受体。在本发明的一个实施方案中，抗原结合区结合选自下组的细胞表面受体：ctla-4,pd1,tim-3,lag-3,icos,cd28和pdl-1。根据本发明的多肽或抗体可以结合任何靶物，上文描述了此类靶物或抗原的实例。增加多肽或抗体的激动活性的方法应当理解本文提及多肽或抗体描述的实施方案指包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，多肽或抗体也可以是多特异性多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第一fc区和第一抗原结合区，和具有免疫球蛋白的第二fc区和第二抗原结合区的第二多肽或抗体。在一方面，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其通过引入fc-fc增强取代和c1q结合取代进行。在一方面，本发明涉及增加包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的激动活性的方法，所述方法包括a)引入选自下组的位置处的至少一个取代：e430,e345或s440y或s440w取代，和b)引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。引入a)以下位置e430,e345或s440之一中的根据本发明的至少一个取代引入多肽或抗体的增强的fc-fc相互作用的效果。引入b)以下位置g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396之一中的根据本发明的一个或多个取代引入多肽或抗体中的增加的激动活性的效果。在另一个方面，本发明涉及增加包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含a)选自e430,e345的位置处的至少一个取代：或s440y或s440w取代，且所述方法包括b)引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。在一个实施方案中，本发明涉及增加包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含a)选自e430,e345的位置处的至少一个取代或s440y或s440w取代，且所述方法包括b)引入选自下组的位置处的至少两个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。增加根据本发明的多肽或抗体的激动活性应当理解为与亲本多肽或抗体相比增加多肽或抗体的激动活性，或者增加多肽或抗体的激动活性也可以指当将多肽或抗体与包含fc-fc增强突变而非c1q结合突变的多肽或抗体相比时。因此，应当理解多肽或抗体可以与具有相同抗原结合区和没有fc-fc增强取代和c1q结合取代的fc区的亲本多肽或亲本抗体相比，或者多肽或抗体可以与具有相同抗原结合区和具有fc-fc增强取代而非c1q结合取代的fc区的多肽或抗体相比。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，条件是g236位的取代不是g236f,g236r,g236y。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，条件是s267位的取代不是s267h,s267i,s267k,s267g。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，条件是h268位的取代不是h268k,h268d,h268e。在本发明的一个实施方案中，至少一个取代选自下组：e430g,e345k,e430s,e430f,e430t,e345q,e345r,e345y,s440w和s440y.因此，提供了实施方案，其中取代增强fc-fc相互作用。在本发明的一个实施方案中，至少一个取代选自下组：e430g,e430s,e430f,e430t。在本发明的一个实施方案中，至少一个取代选自下组：e345k,e345q,e345r,e345y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e430g取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e345k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e345r取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有s440y取代。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e430g,e430s,e430f和e430t，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e430g,e430s,e430f和e430t，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e430g取代，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e430g取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e430g取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e345k,e345q,e345r和e345y，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e345k,e345q,e345r和e345y，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e345k取代，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e345k取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e345k取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e345r取代，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e345r取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含e345r取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：s440y和s440w，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：s440w和s440w，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含s440y取代，所述方法包括选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含s440y取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的激动活性的方法，其中fc区包含s440y取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。本文提供了实施方案，其允许细胞表面抗原结合后多肽或抗体的增加的激动特性。在一个实施方案中，多肽或抗体包含增加的激动特性。在一个实施方案中，多肽或抗体包含含有第一重链和第二重链的fc区，其中上文提及的取代之一可以存在于第一和/或第二重链中。在本发明的一个实施方案中，一个或多个取代选自下组的位置处：k326,e333和p396。在本发明的一个实施方案中，一个或多个取代，诸如两个或三个取代选自下组的位置处：k326,e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含p396和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326,e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326a,k326w,e333s,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326w取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333s。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333s。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326s,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w,e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，一个或多个取代选自下组的位置处：s267,h268和s324。在本发明的一个实施方案中，一个或多个取代，诸如两个或三个取代选自下组的位置处：s267,h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267和h268位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267,h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，一个或多个取代选自下组的位置处：s267e,h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：s267e,h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含h268f取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s324t取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e和h268f。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267e,h268f和s324t的取代。在一个实施方案中，本发明涉及方法，其中fc区包含一个或多个进一步取代。在一个实施方案中，本发明涉及方法，其中fc区包含根据eu编码的人igg1中的以下位置中的进一步取代：s440或k439。在本发明的一个实施方案中，fc区包含对应于以下位置s440或k439之一的进一步取代：条件是若fc-fc增强取代在s440中，则进一步取代不在s440位中。包含根据本发明的fc-fc增强取代和c1q结合取代和s440位处的进一步取代诸如s440k的多肽或抗体不与包含s440位处的突变诸如s440k的多肽或抗体形成寡聚体。包含根据本发明的fc-fc增强取代和c1q结合取代和k439位处的进一步取代诸如k439e的多肽或抗体不与包含k439位处的突变诸如k439e的多肽或抗体形成寡聚体。本文提供了方法，其允许多肽或抗体之间的寡聚体形成，其中第一多肽或抗体包含k439e取代并且第二多肽或抗体包含s440k取代。以此方式，可以迫使寡聚体诸如例如六聚体以第一和第二多肽的某些模式形成。这在多肽结合不同靶物或表位并且寡聚体应当在这些不同靶物或表位的组合中形成的方法中可以是感兴趣的。在一个实施方案中，本发明涉及方法，其中进一步取代选自s440k或k439e。在一个实施方案中，本发明涉及增加激动活性的方法，其中与同多肽或抗体相同的亲本多肽或亲本抗体或具有相同fc-fc增强取代而非c1q结合取代的多肽或抗体相比，激动活性增加至少20％。在本发明的另一个实施方案中，与亲本多肽或亲本抗体或备选具有相同fc-fc增强取代但没有c1q结合取代的多肽或抗体相比，多肽或抗体具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的增加的激动活性。增加cdc活性的方法在一方面，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其通过引入fc-fc增强取代和c1q结合取代进行。在一方面，本发明涉及增加包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的cdc活性的方法，所述方法包括a)引入选自e430,e345的位置处的至少一个取代或s440y或s440w取代，和b)引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。引入a)根据本发明的至少一个取代引入多肽或抗体的增强的fc-fc相互作用的效果，所述取代在以下位置之一中：e430,e345或s440。引入b)根据本发明的一个或多个取代引入多肽或抗体中增加的cdc活性的效果，所述取代在以下位置之一中：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在另一个方面，本发明涉及增加包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含a)选自e430,e345的位置处的至少一个取代或s440y或s440w取代，且所述方法包括b)引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。在一个实施方案中，本发明涉及增加包含人免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含a)选自e430,e345的位置处的至少一个取代或s440y或s440w取代，且所述方法包括b)引入选自下组的位置处的至少两个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，其中位置对应于根据eu编号的人igg1。增加根据本发明的多肽或抗体的激动活性应当理解为与亲本多肽或抗体相比增加多肽或抗体的cdc活性，或者增加多肽或抗体的激动活性也可以指当将多肽或抗体与包含fc-fc增强突变而无c1q结合突变的多肽或抗体比较时。因此，应当理解多肽或抗体可以与亲本多肽或亲本抗体比较，所述亲本多肽或亲本抗体具有相同的抗原结合区和没有fc-fc增强取代且没有c1q结合取代的fc区，或者多肽或抗体可以与多肽或抗体相比，所述多肽或抗体具有相同的抗原结合区和具有fc-fc增强取代但没有c1q结合取代的fc区。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，条件是g236位的取代不是g236f,g236r,g236y。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，条件是s267位的取代不是s267h,s267i,s267k,s267g。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396，条件是h268位的取代不是h268k,h268d,h268e。在本发明的一个实施方案中，至少一个取代选自下组：e430g,e345k,e430s,e430f,e430t,e345q,e345r,e345y,s440w和s440y.因此，提供了实施方案，其中取代增强fc-fc相互作用。在本发明的一个实施方案中，至少一个取代选自下组：e430g,e430s,e430f,e430t。在本发明的一个实施方案中，至少一个取代选自下组：e345k,e345q,e345r,e345y。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e430g取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e345k取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有e345r取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体至少具有s440y取代。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e430g,e430s,e430f和e430t，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e430g,e430s,e430f和e430t，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e430g取代，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e430g取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e430g取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e345k,e345q,e345r和e345y，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：e345k,e345q,e345r和e345y，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e345k取代，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e345k取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e345k取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e345r取代，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e345r取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含e345r取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：s440y和s440w，所述方法包括引入选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含选自下组的至少一个取代：s440w和s440w，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含s440y取代，所述方法包括选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324k326,i332,e333和p396。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含s440y取代，所述方法包括引入选自下组的一个或多个取代：k326a,k326w,e333a,e333s,e333t,和p396l。在一个实施方案中，本发明涉及增加多肽或抗体的cdc活性的方法，其中fc区包含s440y取代，所述方法包括引入来自下组之一的取代：i)k326w和e333s,ii)k326w和e333t,iii)k326a和e333a,iv)k326a,e333a和p396l,v)k326w,vi)e333s，和vii)e333t。本文提供了实施方案，其允许细胞表面抗原结合后多肽或抗体的增加的cdc活性。在一个实施方案中，多肽或抗体包含增加的cdc活性。在一个实施方案中，多肽或抗体包含含有第一重链和第二重链的fc区，其中上文提及的取代之一可以存在于第一和/或第二重链中。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：k326,e333和p396。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代，诸如两个或三个取代：k326,e333和p396。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含p396和e333位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326,e333和p396位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：k326a,k326w,e333s,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含k326w取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333s取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含e333a取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含p396l取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333s。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和e333a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w和p396l.在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333a。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和e333s。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326a,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326s,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w,e333a和p396l。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代k326w,e333s和p396l。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：s267,h268和s324。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代，诸如两个或三个取代：s267,h268和s324。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267和h268位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267,h268和s324位处的取代。在本发明的一个实施方案中，选自下组的位置处的一个或多个取代：s267e,h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含选自下组的一个或多个，诸如两个或三个取代：s267e,h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267e取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含h268f取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s324t取代。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e和h268f。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代s267e和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含取代h268f和s324t。在本发明的一个实施方案中，多肽或抗体包含s267e,h268f和s324t的取代。组合物应当理解，下文提及多肽或抗体描述的实施方案指包含免疫球蛋白fc区和抗原结合区的多肽或抗体，多肽或抗体也可以是多特异性多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第一fc区和第一抗原结合区和第二多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第二fc区和第二抗原结合区。本发明还涉及组合物，其包含本文中描述的多肽或抗体及其变异。下文将描述具体的方面和实施方案。此外，此类多肽或抗体可以根据本文中描述的任何方法获得。在一方面，本发明涉及包含本文中描述的至少一个多肽或抗体的组合物。在本发明的一个实施方案中，组合物包含本文中描述的任何方面或实施方案的一个或多个多肽或抗体。在本发明的一个实施方案中，组合物包含第一多肽或抗体和第二多肽或抗体，如本文中的任何方面或实施方案中描述。在本发明的一方面中，组合物包含第一和第二多肽或抗体，其中第一和第二多肽或抗体包含fc区，其包含(i)至少一个取代，其是fc-fc增强突变；和(ii)一个或多个取代，其是c1q结合取代；和(iii)进一步突变，其阻止具有相同的进一步突变的fc区之间的寡聚化，其中第一和第二多肽或抗体不包含相同的进一步突变。在本发明的一个实施方案中，组合物包含第一多肽或抗体和第二多肽或抗体，其中第一和第二多肽或抗体包含i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代，和ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396和iii)进一步突变，其中第一和第二多肽或抗体不包含相同的进一步突变。因此，组合物包含含有第一fc区的第一多肽或抗体和包含第二fc区的第二多肽或抗体。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：(i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代；和；(ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396；和(iii)k439或s440位处的进一步取代，条件是若进一步取代在s440处，则根据(i)的取代不在s440处，条件是第一和第二fc区不包含相同氨基酸位置处的根据(iii)的进一步取代，(iv)其中取代对应于根据eu编号的人igg1中的氨基酸位置。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，含有第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含(i)第一突变，(ii)第二突变，(iii)进一步的突变，其中突变对应于根据eu编号的人igg1中的以下氨基酸位置：(i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代；和；(ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396；和(iii)第一fc区中k439位处的进一步取代和第二fc区中s440位处的进一步取代，或反之亦然，条件是若进一步取代在s440位处，则第一取代不在s440处；(iv)其中取代对应于根据eu编号的人igg1中的氨基酸位置。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：(i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代；和(ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396；和(iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，和(iv)其中取代对应于根据eu编号的人igg1中的氨基酸位置。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：(i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代；和(ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396；和(iii)第一fc区中进一步的s440k取代和第二fc区中进一步的k439e取代；(iv)其中取代对应于根据eu编号的人igg1中的氨基酸位置。因此，提供了实施方案，其中第一和第二多肽或抗体两者具有增加的激动活性和/或cdc活性，或者仅第一或第二多肽具有增加的激动活性和/或cdc活性。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：(i)对应于e430的氨基酸位置中的取代，和(i)(ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396；和(ii)(iii)第一fc区中进一步的k439e取代和第二fc区中进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)对应于e345的氨基酸位置中的取代，和ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396；和iii)第一fc区中进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e430g，和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a,p396l,s267e,h268f,s324t,g263a,s324e,i332e和s239d；和iii)第一fc区中进一步的k439e取代和第二fc区中进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e430g，和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l；和(iii)第一fc区中进一步的k439e取代和第二fc区中进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e430g，和ii)选自下组的至少两个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l；和iii)第一fc区中进一步的k439e取代和第二fc区中进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e430g取代，和ii)k326w和e333s取代；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。(ii)。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，含有第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345k，和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a,p396l,s267e,h268f,s324t,g263a,s324e,i332e和s239d；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345k，和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345k，和ii)选自下组的至少两个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345k取代，和ii)k326w和e333s取代；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345r，和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a,p396l,s267e,h268f,s324t,g263a,s324e,i332e和s239d；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345r，和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345r，和ii)选自下组的至少两个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含：i)e345r取代，和ii)k326w和e333s取代；和iii)第一fc区中的进一步的k439e取代和第二fc区中的进一步的s440k取代，或反之亦然。在本发明的另一个实施方案中，组合物包含第一和第二多肽或抗体，其中第一和第二多肽或抗体包含fc区，其包含：(i)至少一个取代，其是fc-fc增强突变；(ii)进一步突变，其阻止具有相同的进一步突变的fc区间的寡聚化，其中第一和第二多肽或抗体不包含相同的进一步突变，(iii)和第一或第二fc区包含一个或多个取代，其是c1q结合取代。因此，在一些实施方案中，仅第一或第二多肽或抗体包含降低fc效应器功能的第二突变。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一和第二fc区包含(i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代，(iii)进一步的k439e或s440k突变，其中第一和第二fc区不包含相同的进一步取代，且其中若至少一个取代是s440y或s440w，则进一步突变不是s440k；(ii)和第一或第二fc区包含选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一fc区包含(i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代，和ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396，和iii)进一步的k439e突变；和第二fc区包含i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代，和进一步的s440k突变。因此，提供了实施方案，其中仅第一多肽或抗体具有增加的激动活性和/或增加的cdc活性。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一fc区包含(i)选自下组的至少一个或多个取代：e430,e345，和ii)选自下组的位置处的一个或多个取代：g236,s239,s267,h268,s324,k326,i332,e333,和p396,和iii)进一步的s440k突变；和第二fc区包含i)选自e430,e345的至少一个或多个取代或s440y或s440w取代，和进一步的k439e突变。因此，提供了实施方案，其中仅第一多肽或抗体具有增加的激动活性和/或增加的cdc活性。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一fc区包含(i)e430g取代和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l和iii)进一步的k439e取代；和第二fc区包含i)e430g取代，和进一步的s440k取代。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一fc区包含(i)e430g取代和ii)选自下组的一个或多个取代：k326w,k326a,e333s,e333a和p396l和iii)进一步的s440k取代；和the第二fc区包含i)ae430g取代,和进一步的k439e取代。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一fc区包含(i)e430g取代和ii)k326w和e333s取代，和iii)进一步的s440k取代；和第二fc区包含i)e430g取代和进一步的k439e取代。在本发明的一个实施方案中，组合物包含含有第一抗原结合区和第一fc区的第一多肽或抗体，包含第二抗原结合区和第二fc区的第二多肽或抗体，其中第一fc区包含(i)e430g取代和ii)ak326w和e333s取代，和iii)进一步的k439e取代；和第二fc区包含i)e430g取代和进一步的s440k取代。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体能够结合肿瘤坏死因子受体超家族(tnfr-sf)或g蛋白偶联受体(gpcr)超家族的成员。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体能够结合选自下组的tnfr-sf成员：tnfr1,fas,dr3,dr4,dr5,dr6,ngfr,edardcr1,dcr2,dcr3,opg,troy,xedar,ltbr,hvem,tweakr,cd120b,ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr和relt。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体能够结合选自下组的具有胞内死亡域的tnfr-sf成员：tnfr1,fas,dr3,dr4,dr5,dr6,ngfr和edar。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体能够结合选自下组的没有胞内死亡域的tnfr-sf成员：dcr1,dcr2,dcr3,opg,troy,xedar,ltbr,hvem,tweakr,cd120b,ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr,relt。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体能够结合tnfr-sf成员，其属于由以下组成的免疫活化物的组：ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr和relt。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体，其中第一多肽和第二多肽结合选自下组的没有胞内死亡域的一个或多个tnfr-sf成员上的不同表位：ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr和relt。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多肽或抗体，其中结合选自下组的没有胞内死亡域的tnfr-sf的一个成员：ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr和relt的第一多肽不阻断所述第二抗体的结合，所述第二抗体结合选自下组的没有胞内死亡域的tnfr-sf的一个成员：ox40,cd40,cd27,cd30,4-1bb,rank,taci,blysr,bcma,gitr和relt。在本发明的一个实施方案中，包含第一多肽或抗体和第二多肽和抗体的组合物以1:49至49:1摩尔比，诸如1:1摩尔比、1:2摩尔比、1:3摩尔比、1:4摩尔比、1:5摩尔比、1:6摩尔比、1:7摩尔比、1:8摩尔比、1:9摩尔比、1:10摩尔比、1:15摩尔比、1:20摩尔比、1:25摩尔比、1:30摩尔比、1:35摩尔比、1:40摩尔比、1:45摩尔比、1:50摩尔比、50:1摩尔比、45:1摩尔比、40:1摩尔比、35:1摩尔比、30:1摩尔比、25:1摩尔比、20:1摩尔比、15:1摩尔比、10:1摩尔比、9:1摩尔比、8:1摩尔比、7:1摩尔比、6:1摩尔比、5:1摩尔比、4:1摩尔比、3:1摩尔比、2:1摩尔比存在于组合物中。在本发明的一个实施方案中，包含第一多肽和第二多肽和/或任何另外的多肽的组合物以等摩尔比存在于组合物中。在本发明的一个实施方案中，根据任何方面或实施方案的组合物是药物组合物。治疗应用根据本发明的任何方面或实施方案的多肽、抗体、双特异性抗体或组合物可以用作药物，即用于治疗应用。在一个方面，本发明提供了根据本文公开的任何方面或实施方案的多肽、抗体或组合物，其用作药物。另一方面，本发明提供了根据本文公开的任何方面或实施方案的多肽、抗体或组合物，其用于治疗癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或传染病。另一方面，本发明涉及治疗患有疾病的个体的方法，包括向个体施用有效量的根据本文公开的任何方面或实施方案的多肽、抗体或组合物。在本发明的一个实施方案中，疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病、炎性疾病和传染病。在本发明的一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的方法涉及进一步施用另外的治疗剂。在本发明的一个实施方案中，另外的治疗剂是一种或多种选自下组的抗癌剂：化学治疗剂(包括但不限于紫杉醇、替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、伊立替康、多柔比星、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、培美曲塞)、激酶抑制剂(包括但不限于索拉非尼、舒尼替尼或依维莫司)、凋亡调节剂(包括但不限于重组人trail或birinapant)、ras抑制剂、蛋白酶体抑制剂(包括但不限于bortezomib)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(包括但不限于伏立诺他)、营养保健品、细胞因子(包括但不限于ifn-γ)、抗体或抗体模拟物(包括但不限于抗egfr、抗igf-1r、抗-vegf、抗cd20、抗cd38、抗her2、抗pd-1、抗pd-l1、抗-ctla4、抗-cd40、抗-cd137、抗-gitr抗体和抗体模拟物)、抗体-药物缀合物。试剂盒应当理解，下文提及多肽或抗体描述的实施方案是指包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，多肽或抗体也可以是多特异性多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第一fc区和第一抗原结合区，以及具有免疫球蛋白的第二fc区和第二抗原结合区的第二多肽或抗体。本发明还涉及用于在疗法中同时、分开或序贯使用的试剂盒，其包含本文所述的多肽或抗体。此外，可以根据本文描述的任何方法获得此类变体。在一个方面，本发明涉及包含根据本文所述任何方面或实施方案的多肽、抗体或组合物的试剂盒，其中所述多肽、抗体或组合物在一个或多个容器如小瓶中。在本发明的一个实施方案中，试剂盒包含根据本文所述任何方面或实施方案的多肽、抗体或组合物，用于在疗法中同时、分开或序贯使用。另一方面，本发明涉及根据本文所述任何实施方案的多肽、抗体、组合物或试剂盒用于诊断方法的用途。另一方面，本发明涉及诊断方法，包括将根据本文所述任何实施方案的多肽、抗体、组合物或试剂盒施用于人或其他哺乳动物的身体的至少一部分。另一方面，本发明涉及根据本文所述任何实施方案的多肽、抗体、组合物或试剂盒在对人或其他哺乳动物的身体的至少一部分进行成像中的用途。另一方面，本发明涉及用于对人或其他哺乳动物的身体的至少一部分进行成像的方法，包括施用根据本文所述任何实施方案的变体、组合物或试剂盒。进一步应用应当理解，下文提及多肽或抗体描述的实施方案是指包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，多肽或抗体也可以是多特异性多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第一fc区和第一抗原结合区，以及具有免疫球蛋白的第二fc区和第二抗原结合区的第二多肽或抗体。另一方面，本发明涉及如上所述的本发明的多肽，抗体，其用作药物，特别是用作治疗疾病或病症的药物。此类疾病和病症的实例包括但不限于癌症、自身免疫疾病、炎性疾病、传染病、细菌性、病毒性或真菌性感染。另一方面，本发明涉及用于治疗疾病如癌症的本文所述的多肽、抗体、双特异性抗体、组合物和试剂盒。另一方面，本发明涉及治疗人疾病的方法，包括施用本文所述的变体、组合物或试剂盒。另一方面，本发明涉及治疗人癌症的方法，包括施用变体、组合物或试剂盒。“治疗”是指以缓解、改善、阻止或根除(治愈)症状或疾病状态为目的施用有效量的本发明的治疗活性化合物。“有效量”或“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。抗体的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害效果的量。剂量应当理解，下文提及多肽或抗体描述的实施方案是指包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，多肽或抗体也可以是多特异性多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第一fc区和第一抗原结合区，以及具有免疫球蛋白的第二fc区和第二抗原结合区的第二多肽或抗体。抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。本发明抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.1至100mg/kg，例如约0.1至50mg/kg，例如约0.1至20mg/kg，例如约0.1至10mg/kg，例如约0.5，约0.3，约1，约3，约5或约8mg/kg。本发明的多肽或抗体也可以在联合疗法中施用，即与对于要治疗的疾病或病况相关的其他治疗剂组合施用。因此，在一个实施方案中，含有抗体的药物用于与一种或多种其他治疗剂组合，例如细胞毒剂、化学治疗剂或抗血管生成剂。此列组合施用可以是同时的、分开的或序贯的。在另一个实施方案中，本发明提供治疗或预防疾病如癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者与放射治疗和/或手术组合施用治疗有效量的本发明的变体或药物组合物。制备方法应当理解，下文提及多肽或抗体描述的实施方案是指包含免疫球蛋白的fc区和抗原结合区的多肽或抗体，多肽或抗体也可以是多特异性多肽或抗体，其具有免疫球蛋白的第一fc区和第一抗原结合区，以及具有免疫球蛋白的第二fc区和第二抗原结合区的第二多肽或抗体。本发明还提供了编码根据上述任一方面的变体的分离的核酸和载体，以及编码所述变体的载体和表达系统。用于抗体及其变体的合适的核酸构建体、载体和表达系统是本领域已知的，并且在实施例中描述。在变体不仅包含重链(或其含有fc的片段)而且还包含轻链的实施方案中，编码重链和轻链部分的核苷酸序列可以存在于相同或不同的核酸或载体上。本发明还提供了在宿主细胞中产生根据上述任一方面的多肽或抗体的方法，其中所述多肽或抗体至少包含重链的fc区，所述方法包括以下步骤：a)提供编码所述变体的所述fc区的核苷酸构建体，b)在宿主细胞中表达所述核苷酸构建体，和c)从所述宿主细胞的细胞培养物中回收所述抗体变体。在一些实施方案中，抗体是重链抗体。然而，在大多数实施方案中，抗体还含有轻链，因此所述宿主细胞在相同或不同的载体上进一步表达轻链编码构建体。适用于抗体重组表达的宿主细胞是本领域公知的，包括cho、hek-293、expi293、per-c6、ns/0和sp2/0细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是能够进行蛋白质的asn连接糖基化的细胞，例如真核细胞，如哺乳动物细胞，例如人细胞。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞是非人细胞，其经遗传工程改造以产生具有人样或人糖基化的糖蛋白。此类细胞的实例是遗传修饰的巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)((hamiltonetal.,science301(2003)1244-1246；potgieteretal.,j.biotechnology139(2009)318-325))和遗传修饰的浮萍(lemnaminor)(coxetal.,naturebiotechnology12(2006)1591-1597)。在一个实施方案中，所述宿主细胞是不能从抗体重链有效除去c-末端赖氨酸k447残基的宿主细胞。例如，liuetal.(2008)jpharmsci97:2426(通过引用并入本文)的表2列出了许多此类抗体生产系统，例如，sp2/0，ns/0或转基因乳腺(山羊)，其中仅获得c-末端赖氨酸的部分除去。在一个实施方案中，宿主细胞是具有改变的糖基化机制的宿主细胞。此类细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，其中表达本发明的变体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如shields,r.l.etal.(2002)j.biol.chem.277:26733-26740；umanaetal.(1999)nat.biotech.17:176-1以及ep1176195；wo03/035835；和wo99/54342。用于产生工程化糖型的其他方法是本领域已知的，包括但不限于daviesetal.,2001,biotechnolbioeng74:288-294；shieldsetal,2002,jbiolchem277:26733-26740；shinkawaetal.,2003,jbiolchem278:3466-3473),us6602684,wo00/61739a1；wo01/292246a1；wo02/311140a1；wo02/30954a1；potelligenttm技术(biowa,inc.princeton,n.j.)；glycomabtm糖基化工程化技术(glycartbiotechnologyag,zurich,switzerland)；us20030115614；okazakietal.,2004,jmb,336:1239-49中描述的那些。本发明还涉及通过上述本发明的方法获得或可获得的抗体。另一方面，本发明涉及能够产生本发明多肽或抗体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞已经用本发明的核苷酸构建体转化或转染。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。表1实施例实施例1：抗体产生，生产和纯化。抗体的表达构建体对于抗体表达，通过基因合成(geneartgenesynthesis；thermofisherscientific,germany)制备可变重(vh)链和可变轻(vl)链序列，并克隆到含有igg1重链(hc)和轻链(lc)恒定区的pcdna3.3表达载体(thermofisherscientific,us)中。通过基因合成或定点诱变引入期望的突变。本申请中提及的抗体具有源自先前描述的dr5抗体hdr5-01,hdr5-05(wo2014/009358)和可那木单抗(conatumumab)(us7521048b2和wo2010/138725),dr4抗体chctb007(us2009/0136503),fas抗体e09(chodorgecelldeathdiffer.2012jul；19(7):1187–1195),apo1(wo2014/076292)和hfe7a(us6972323),ox40抗体sf2(us2014/0377284),cd40抗体sgn40(us6838261)和cp870893(us7338660),4-1bb抗体mor7480(wo2012/032433)和bms-663513(us8475790),cd20抗体humab-7d8和11b8(wo2004/035607),cd52抗体阿仑珠单抗(croweetal.,clinexpimmunol.1992；87(1):105–10),和egfr抗体2f8(wo2002/100348)的vh和vl序列。在一些实例中，人igg1抗体b12，gp120特异性抗体用作阴性对照(barbasetal.,jmolbiol.1993apr5；230(3):812-23)。瞬时表达以igg1，κ表达抗体。使用expifectamine(invitrogen,us)基本上如制造商所述在expi293细胞(life/thermoscientific,usa)中瞬时转染编码抗体重链和轻链两者的质粒dna混合物。蛋白质的纯化和分析通过蛋白a亲和层析纯化抗体。将培养物上清液用0.20μm死端滤器过滤，并加载到5mlmabselectsure柱(gehealthcare)上，清洗并且用0.02m柠檬酸钠-naoh(ph3)洗脱。在纯化后立即将洗脱液加载到hiprep脱盐柱(gehealthcare)上，并且将抗体缓冲液交换到12.6mmnah2po4,140mmnacl,ph7.4缓冲液(b.braun或thermofisher)中。在缓冲液交换后，将样品用0.20μm死端滤器无菌过滤。通过许多生物分析测定分析纯化的蛋白质，包括在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(ce-sds)上的毛细管电泳和高效大小排阻层析(hp-sec)。通过280nm处的吸光度测量浓度。将纯化的抗体储存在2-8℃。双特异性抗体的产生在受控还原条件下通过fab臂交换产生双特异性igg1抗体。该方法的基础是使用互补的ch3域，其促进在如wo2011/131746中描述的特定测定条件下的异二聚体的形成。将f405l和k409r(eu编号)突变引入抗dr5igg1抗体中以产生具有互补ch3域的抗体对。将f405l突变导入igg1-b12-k326a/e333a/p396l/e430g和igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g中；将k409r突变引入igg1-b12-k326w/e333s/e430g和igg1-hdr5-01-g56t-k326a/e333a/p396l/e430g中。为了产生双特异性抗体，将两种亲本互补抗体(每种抗体终浓度为0.5mg/ml)与75mm2-巯基乙胺-hcl(2-mea)在总体积为100μl的pbs中于31℃温育5小时。通过使用旋转柱(microcon离心滤器，30k，millipore)根据制造商的方案除去还原剂2-mea来终止还原反应。将抗体缓冲液交换到12.6mmnah2po4,140mmnacl,ph7.4缓冲液(b.braun或thermo)中。以此方式，产生双特异性抗体igg1-hdr5-01-g56t-k326a/e333a/p396l/k409r/e430gxigg1-b12-k326a/e333a/p396l/f405l/e430g，称为bsab(hdr5-01-g56t-k409rxb12-f405l)-k326a/e333a/p396l/e430g和igg1-cona-c49w-f405l-k326w/e333s/e430gxigg1-b12-k409r-k326w/e333s/e430g，称为bsab(igg1-cona-c49w-f405lxigg1-b12-k409r)-k326w/e333s/e430g。实施例2：组合e430g和k326a/e333a/p396l对激动性抗dr5抗体功效的影响。进行存活力测定法以评估fc-fc增强取代e430g(wo2013/004842；wo2014/108198；wo2014/006217；dejongetal.,2016)和k326a/e333a/p396l(wo2016/116635)的组合对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr-05对dr5阳性bxpc-3细胞(atcc，crl-1687)的激动活性的影响。通过胰蛋白酶消化收获细胞并通过细胞滤器。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以浓度0.5x105个细胞/ml重悬于培养基(rpmi1640，含有25mmhepes和l-谷氨酰胺(lonzacatnrbe12-115f)+10％热灭活的供体牛血清与铁(dbsi；lifetechnologiescatnr10371-029)+50u/ml青霉素/链霉素(pen/strep；lonza；catnrde17-603e)。将100μl单细胞悬浮液(每孔5,000个细胞)接种于聚苯乙烯96孔平底板(greinerbio-one,catnr655182)中，并在37℃粘附过夜。接着，添加50μl连续稀释抗体制备系列(范围为0.0003至20,000ng/ml终浓度，以4倍稀释)，并且在37℃培养3天。作为阴性和阳性对照，分别在没有抗体或5μm星状孢子素(sigmaaldrich，catnrs6942)的情况下温育细胞。细胞培养物的存活力在celltiter-glo发光细胞存活力测定法(promega,catnrg7571)中测定，所述celltiter-glo发光细胞存活力测定法量化存在的atp，这是代谢活跃细胞的指标。从试剂盒中，每孔加入20μl萤光素溶液试剂，并通过以500rpm摇动板2分钟进行混合。接着，将板在37℃温育1.5小时。将100μl上清液转移至白色optiplate-96(perkinelmer,catnr6005299)并在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析和绘制数据。图1显示了如使用下式计算的活细胞百分比：％活细胞＝[(抗体样品发光-星状孢子素样品发光)/(无抗体样品发光-星状孢子素样品发光)]*100。图1显示组合fc-fc增强取代e430g和三个取代k326a/e333a/p396l导致抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t(图1a)和igg1-hdr5-05(图1b)当对粘附人bxpc-3胰腺癌细胞的体外存活力测定法中作为单一试剂测试时的杀伤效力的诱导。相反，当仅存在e430g或k326a/e333a/p396l时，这些抗体未显示对这些预先粘附的bxpc-3细胞的有效杀伤。同样对于非交叉阻断抗体igg1-hdr5-01-g56t+igg1-hdr5-05的组合，引入组合的取代k326a/e333a/p396l/e430g导致对预先粘附的bxpc-3细胞的最有效的杀死(图1c)。这些数据显示k326a/e333a/p396l/e430g取代诱导抗dr5抗体对粘附bxpc-3细胞的强烈的激动活性。实施例3：含有k326a/e333a/p396l/e430g的单价抗dr5抗体的功效。对人bxpc-3胰腺癌和colo205结肠癌细胞进行存活力测定法，以研究含有k326a/e333a/p396l/e430g的单价抗dr5抗体的功效。如实施例1中所述，通过igg1-hdr5-01-g56t-k326a/e333a/p396l/k409r/e430g和igg1-b12-k326a/e333a/p396l/f405l/e430g之间的受控fab臂交换产生单价dr5抗体。产生的双特异性抗体，称为bsab(hdr5-01-g56t-k409rxb12-f405l)-k326a/e333a/p396l/e430g，含有一个特异于dr5的臂和一个针对hiv糖蛋白gp120的非特异性臂，产生dr5阳性人癌细胞上结合的单价dr5。如实施例2中所述收获bxpc-3细胞。通过合并含有非粘附细胞和胰蛋白酶处理的粘附colo205细胞的培养上清液来收获colo205细胞(atcc，ccl-222)。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以浓度0.5x105个细胞/ml重悬于培养基(rpmi1640，具有25mmhepes和l-谷氨酰胺+10％热灭活的dbsi+50u/mlpen/strep)。将100μl单细胞悬浮液(每孔5,000个细胞)接种在聚苯乙烯96孔平底板中并于37℃粘附过夜。接着，添加50μl连续稀释抗体制备系列(范围0.0024至10,000ng/ml终浓度，以4倍稀释)，并在37℃温育3天。作为阴性和阳性对照，分别在没有抗体或5μm星状孢子素的情况下温育细胞。在celltiter-glo发光细胞存活力测定法中测定培养细胞的活力，如实施例2中所述。图2显示，在存在k326a/e333a/p396l/e430g突变的情况下，igg1-hdr5-01-g56t的单价变体仍可诱导人bxpc-3胰腺癌和colo205结肠癌细胞的杀死。实施例4：组合e430g和k326a/e333a,k326a/p396l或e333a/p396l对c1q结合和激动性抗dr5抗体功效的影响。进行存活力测定法以研究fc-fc增强取代e430g与k326a/e333a/p396l中三个取代中的两个取代的组合对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t对dr5阳性bxpc-3和colo205细胞的激动活性的影响。作为参考，实验中包括e430g与如实施例2中所述的所有三种取代k326a/e333a/p396l的组合。如实施例3中所述进行存活力测定法。如实施例2中所述，在celltiter-glo发光细胞存活力测定法中测定培养细胞的存活力。图3显示组合fc-fc增强取代e430g和来自k326a/e333a/p396l的两个取代(e333a/p396l,k326a/e333a或k326a/p396l)导致抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t当对粘附人bxpc-3胰腺癌(图3a)和colo205结肠癌(图3b)细胞的体外存活力测定法中作为单一试剂测试时的杀伤效力的诱导。相反，当仅存在e430g时，未观察到对这些预先粘附的癌细胞的杀伤。当e430g与所有三种突变k326a/e333a/p396l组合时，观察到最有效的杀伤。进行结合elisa以评估不同取代对c1q结合的影响。测试含有e430g取代与k326a/e333a,k326a/p396l,e333a/p396l或k326a/e333a/p396l取代组合的igg-hdr5-01-g56t变体的纯化抗体样品，并与wtigg-hdr5-01-g56t和igg-hdr5-01-g56t-e430g进行比较。igg-2f8-i253d/k322a用作c1q结合的阴性对照。通过在4℃与100μlpbs中的1μg/ml抗体样品一起温育过夜来进行96孔microlonelisa板(greinercat#655092)的包被。将板清洗并在室温用200μl/孔补充有0.025％tween20和0.1％明胶的0.5xpbs在摇动的情况下封闭1小时。通过温育之间进行清洗，将板依次与每孔100μl的纯化c1q连续稀释系列(quidelcat#a400；最终c1q浓度范围30-0.010μg/ml，3倍稀释)在37℃温育1小时，每孔100μl兔抗人c1qc1q(dako,product#a0136,1/4.000)在室温1小时，以及与100μl/孔猪抗兔igg-hrp(dako,p0399,1:10.000)作为检测抗体在室温温育1小时，最后与100μl/孔具有1mg/ml2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts；rochecat#11112597001)的底物在室温温育约15分钟。通过加入100μl2％草酸终止反应。在biotekel808微孔板读数器(biospx)中在405nm处测量吸光度。通过使用graphpadprism软件拟合具有可变斜率的s形剂量-响应曲线来分析对数转换数据。图3c显示e430gfc-fc增强取代的引入不影响对1μg/ml包被的igg1-hdr5-01-g56t抗体的表观c1q结合亲和力，而含有e430g取代与k326a/e333a,k326a/p396l,e333a/p396l或k326a/e333a/p396l取代的组合的抗体变体与igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-01-g56t-e430g相比显示增强的c1q结合(表2)。表2：c1q与igg1-hdr5-01-g56t抗体变体结合的ec50值(elisa)1单因素anovap值＝0.0022；bonferroni事后检验ab相对于wt：如所示p<0.05。这些数据共同显示，将e430gfc-fc增强取代与k326a/e333a,k326a/p396l,e333a/p396l或k326a/e333a/p396l取代组合导致仅具有e430gfc-fc增强突变的抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t-e430g的增加的c1q结合和增加的激动活性。实施例5：组合e430g和k326w/e333s对激动性抗dr5抗体的c1q结合和功效的影响。进行结合elisa以评估k326a/e333a和k326w/e333s对c1q与含有e430gfc-fc增强突变的抗体的结合的影响。测试含有e430g取代与k326a/e333a或k326w/e333s突变组合的igg1-cona-c49w变体的纯化抗体样品，并与wtigg1-cona-c49w和igg1-cona-c49w-e430g进行比较。还测试了不含e430g取代的igg1-cona-c49w-k326w/e333s。igg1-2f8-i253d/k322a用作c1q结合的阴性对照。如实施例4中所述，在用1μg/ml抗体包被的elisa板上进行c1q结合elisa。当与wt抗体相比时，证实通过引入k326w/e333s取代实现的c1q结合的强烈增强(图4a)。相反，引入e430gfc-fc增强突变不影响对1μg/ml包被的igg1-cona-c49w抗体的表观c1q结合亲和力。与igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-01-g56t-e430g相比，含有e430g取代和k326a/e333a或k326w/e333s取代的组合的抗体变体显示出强烈增强的c1q结合(表3)。表3：c1q与igg1-cona-c49w抗体变体的结合的ec50值(elisa)1单因素anovap值＝0.0013；bonferroni事后检验ab相对于wt：如所示p<0.05。进行存活力测定法以研究fc-fc增强突变e430g与c1q结合取代k326a/e333a或k326w/e333s的组合对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t对dr5-阳性bxpc-3和colo205细胞的激动活性的影响。如实施例3中所述进行存活力测定法。如实施例2中所述，在celltiter-glo发光细胞存活力测定法中测定培养细胞的存活力。图4b/c显示组合fc-fc增强取代e430g和两个突变k326w/e333s导致抗-dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t当对粘附的人bxpc-3胰腺(图4b)和colo205结肠(图4c)癌细胞的体外存活力测定法中作为单一试剂测试时强烈杀伤功效的诱导。相反，wt抗体和igg1-hdr5-01-g56t-e430g未显示功效。在bxpc-3和colo205癌细胞两者上，igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g的杀伤效力优于igg1-hdr5-01-g56t-k326a/e333a/e430g的杀伤效力。这些数据共同显示，将e430gfc-fc增强取代与k326a/e333a或k326w/e333s取代组合导致仅具有e430g六聚化增强突变的抗-dr5抗体igg1-cona-c49w-e430g的增加的c1q结合和增加的激动活性。实施例6：将e430g与其他fc变体组合对激动性抗dr5抗体的c1q结合和功效的影响。进行c1q结合elisa以研究c1q结合取代s267e/h268f/s324t或igg1/igg3嵌合同种型igg1变体113f对c1q与含有e430gfc-fc增强取代的抗体(tammenetal.,jimmunol.2017)结合的影响。测试具有和不具有这些取代的igg1-hdr5-01-g56t变体的纯化抗体样品，并与wtigg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-01-g56t-e430g进行比较。igg1-2f8-i253d/k322a用作c1q结合的阴性对照。如实施例4中所述，在用1μg/ml抗体包被的elisa板上进行c1q结合elisa。图5a显示e430gfc-fc增强取代的引入不影响对1μg/ml包被的igg1-hdr5-01-g56t抗体的表观c1q结合亲和力。相比之下，与igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-01-g56t-e430g相比，含有e430g取代和s267e/h268f/s324t取代组合的抗体变体显示强烈增强的c1q结合，而与igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-01-g56t-e430g相比，在igg113f-hdr5-01-g56t形式变体中引入e430g取代导致c1q结合略微增强(表4)。表4：c1q与igg1-hdr5-01-g56t抗体变体的结合的ec50值(elisa)1单因素anovap值＝0.0013；bonferroni事后检验ab相对于wt：如所示p<0.05。进行存活力测定法以研究fc-fc增强取代e430g与c1q结合取代s267e/h268f/s324t(mooreetal.,mabs2010)或igg1/igg3嵌合同种型变体113f(natsumeetal.,cancerres.2008)的组合对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t对dr5阳性bxpc-3和colo205细胞的激动活性的影响。如实施例3中所述进行存活力测定法。如实施例2中所述，在celltiter-glo发光细胞存活力测定法中测定培养细胞的存活力。图5b/c显示组合fc-fc增强取代e430g与c1q结合取代s267e/h268f/s324t导致抗-dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t在对粘附的人bxpc-3胰腺(图5b)和colo205结肠(图5c)癌细胞的体外存活力测定法中作为单一试剂测试时的杀伤效力的诱导。当将e430g掺入igg1-hdr5-01-g56t的igg1/igg3嵌合同种型igg1变体113f中时，在colo205上观察到杀伤效力的诱导(图5c)，并且在bxpc-3上略微观察到杀伤效力的诱导，其中仅在测试的最高抗体浓度观察到激动活性(图5b)。然而，在这两种细胞系上，这些变体igg1-hdr5-01-g56t-s267e/h268f/s324t/e430g和igg113f-hdr5-01-g56t-e430g的功效显著低于igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g和igg1-hdr5-01-g56t-k326a/e333a/p396l/e430g的功效。如在先前的实施例中，wt抗体和igg1-hdr5-01-g56t-e430g未显示功效。这些数据共同显示，将e430gfc-fc增强取代与s267e/h268f/s324t取代组合导致仅具有e430gfc-fc增强取代的抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t-e430g的强烈增加的c1q结合和激动活性。在igg113f-hdr5-01-g56t形式变体中引入e430g取代导致抗体的略微增强的c1q结合和激动活性。实施例7：e430g与其他fc突变和变体组合对激动性抗dr5抗体功效的影响的总结。在前面的实施例中，描述了存活力测定法，其中当fc-fc增强取代e430g与描述为影响dr5激动性或c1q结合的其他fc区取代或变体组合时，测试了对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t的激动活性的影响。在该实施例中，通过相对于wtigg1-hdr5-01-g56t(其在实施例2、4、5和6中显示没有影响)用10μg/ml指定的抗体温育三天后活细胞百分比的表示和排序，呈现对粘附的人胰腺bxpc-3癌细胞的所有存活力测定法的总结。在实施例2中描述了对粘附bxpc-3细胞的存活力测定法和celltiter-glo发光测定法的细节。图6显示了含有热灭活胎牛血清的完全培养基中粘附人bxpc-3胰腺癌细胞与10μg/ml抗体的3天温育期后的wtigg1-hdr5-01-g56t抗体相比时，fc-fc增强取代e430g与c1q结合双取代k326w/e333s的组合显示出最显著的效果。此外，e430g与k326a/e333a/p396l,e333a/p396l和k326a/e333a的组合比wt抗体导致显著更低的活细胞的百分比。已显示增强c1q结合的其他fc变体如s267e/h268f/s324t和igg1/igg3嵌合igg-113f对粘附bxpc-3细胞在具有10μg/ml抗体的本文实验设置中当在igg1-hdr5-01-g56t中与e430g组合时未显示杀伤效力的显著诱导，其中当作为单一试剂测试时，igg1-hdr5-01-g56t-e430g也没有导致杀伤效力的诱导。实施例8：c1q对具有fc-fc增强取代与c1q结合取代组合的激动性抗-dr5抗体的体外活性的影响。先前的实施例表明，增强的c1q结合有助于所测试的含有e430gfc-fc增强突变的抗dr5抗体的更好的激动活性。为了测试c1q的效果，用igg1-cona-k326a/e333a/p396l/e430g和igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g对无血清培养基中的wil2-ssf细胞在存在或缺乏纯化的人c1q的情况下进行存活力测定法。wil2-ssf细胞衍生自wil2-s(atcc,crl-8885)b淋巴母细胞，并适于在含有50u/mlpen/strep和1mm丙酮酸钠的hyq-adcf-mab(perbio,cat#sh30349)配制的培养基中在无血清条件下生长。使wil2-ssf悬浮细胞通过细胞滤器，通过以300xg离心5分钟沉淀，并以0.5x106个细胞/ml的浓度重悬于无血清培养基中。将100μl单细胞悬浮液(每孔50,000个细胞)接种在聚苯乙烯96孔平底板(greinerbio-one,catnr655182)中。添加25μl系列稀释抗体制剂系列(范围为0.0003至20,000ng/ml的终浓度，4倍稀释)和25μl纯化的c1q(quidel,cat#a400；2.5μg/ml终浓度)并于37℃温育1天。作为阴性和阳性对照，将细胞分别在不含抗体或含有5μm星状孢子素(sigmaaldrich,catnrs6942)的培养基中培养。通过to-pro-3染色测定细胞存活力。to-pro-3是一种细胞不渗透的与双链dna结合的羰花青单体染色剂。因此，to-pro-3可用作死细胞指示剂。将所有样品转移到聚苯乙烯96孔u形底板(greinerbio-one,catnr650261)中并以300xg离心3分钟，然后除去70μl上清液。添加10μlto-pro-3混合物(invitrogen,cat#t3605)20μlto-pro-3+1980μlpbs)，然后通过移液重悬细胞。在bdlsrfortessax-20细胞分析仪(bdbiosciences)上通过流式细胞术测定to-pro-3阳性细胞的量。图7显示将纯化的c1q加入无血清培养基中大大增强了igg1-cona-k326a/e333a/p396l/e430g(图7a)和igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g(图7b)对wil2-ssf细胞的效力。这些数据指示c1q结合有助于激动性抗dr5抗体的更好的激动活性，所述激动性抗dr5抗体含有e430gfc-fc增强取代与k326a/e333a/p396l或c1q结合k326w/e333s取代的组合。实施例9：c1q对具有fc-fc增强取代与c1q结合取代组合的激动性抗-dr5抗体的体外激动活性的影响。在实施例8中，在具有抗体浓度系列和固定c1q浓度的无血清培养基中的wil2-ssf细胞的存活力测定中测试c1q对激动性抗dr5抗体功效的影响。在该实施例中，在无血清培养基中对wil2-ssf细胞的存活力测定法中测试c1q浓度系列对具有fc-fc增强取代(e430g)与c1q结合取代(k326a/e333s/p396l,k326w/e333s或k326a/e333a)的组合的激动性igg1-hdr5-01-g56t抗体变体的功效的影响。以固定抗体浓度为2.5μg/ml和以4倍稀释的范围为0.0002至2.5μg/ml终浓度的纯化c1q浓度系列，基本上如实施例8中所述进行存活力。图8显示将纯化的c1q加入无血清培养基中增强了含有e430gfc-fc增强取代的抗dr5抗体的效力。所有测试的含有c1q结合增强取代(k326a/e333s/p396l,k326w/e333s或k326a/e333a)的igg1-hdr5-01-g56t-e430g抗体变体以c1q剂量依赖性方式显示对wil2-ssf细胞的功效(图8a)。igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g显示出所有测试抗体的最高功效，并且在从0.16μg/ml开始的c1q浓度范围达到最大杀伤。这些数据指示c1q结合有助于含有e430gfc-fc增强取代与k326a/e333a/p396l,k326w/e333s或k326a/e333ac1q结合取代的组合的激动性抗dr5抗体的更好的活性。双表位靶向抗体组合igg1-hdr5-01-g56t-e430g+igg1-hdr5-05-e430g也显示在无血清培养基中杀死wil2s-sf细胞的c1q剂量依赖性增加，达到约0.16μg/mlc1q的最大杀伤(图8b)。实施例10：c1q中和对具有fc-fc增强取代与c1q结合取代组合的激动性抗-dr5抗体的体外激动活性的影响。在含有纯化的c1q的无血清培养基中的wil2-ssf细胞的存活力测定中，通过使用针对c1q球状头部区域的抗c1q中和抗体测试含有e430gfc-fc增强取代与c1q结合的k326w/e333s取代的组合的激动性抗dr5igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g效力的c1q需要。类似地，还在双表位靶向抗体组合igg1-hdr5-01-g56t-e430g+igg1-hdr5-05-e430g的相同设置中测试了中和c1q的效果。基本上如实施例8中所述进行存活力测定法。简言之，将wil2-ssf细胞以0.67x106个细胞/ml的浓度重悬于无血清培养基中。将75μl单细胞悬浮液(每孔50,000个细胞)接种在聚苯乙烯96孔平底板中的无血清培养基中。接着，添加25μl抗dr5抗体样品(2.5μg/ml终浓度)，25μl纯化的c1q(0.01μg/ml终浓度)和25μl抗c1q抗体样品(sanquin,clb/c1q-85cat#mw1828；10μg/ml终浓度)并在37℃温育1天。如实施例8中所述，通过to-pro-3染色测定细胞存活力。在该实验中证实了将纯化的c1q加入到无血清培养基中以增强抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t-k326w/e333s/e430g的效力的效果，如实施例9中所述(图9a)。此外，当通过过量的抗c1q抗体的存在中和补充的c1q与抗dr5抗体的结合时，该效力降低(图9a)。这些数据说明c1q结合对于含有e430gfc-fc增强取代与k326w/e333sc1q结合取代的组合的激动性抗dr5抗体的最佳活性是需要的。对于双表位靶向抗体组合igg1-hdr5-01-g56t-e430g+igg1-hdr5-05-e430g，也证实了杀死wil2s-sf细胞的c1q依赖性功效，其在向无血清培养基中添加c1q时显示出增强的功效并且通过过量的抗c1q抗体的存在中和此种效果(图9b)。实施例11：具有fc-fc增强取代和c1q结合取代组合的抗体的溶液相补体活化测定法。通过在正常人血清(nhs)中温育抗体后c4d(经典补体途径活化的标志物)的定量来测定抗体变体的靶物结合非依赖性补体活化。使用microvuec4d酶免疫测定法(quidel,cat#a0008)进行三步elisa程序，所述microvuec4d酶免疫测定法包含(1)用小鼠单克隆抗体包被的微量测定板，所述小鼠单克隆抗体与人c4的含c4d的活化片段特异性结合，(2)与hrp缀合的山羊抗人c4d抗体，和(3)生色底物。给试剂盒补充内部对照和标准品，并按照制造商的用法说明所述进行使用。作为阳性对照，如下制备热聚集的γ球蛋白。将1.5ml小瓶的ivig溶液(60mg/ml；sanquin,cat#04h04h443a)中的1ml等分试样在63℃加热20分钟。合并小瓶并用pbs稀释至20mg/ml，并通过0.22μm孔无表面活性剂的乙酸纤维素(sfca)膜注射器滤器(corning,cat#431219)过滤。将约0.2ml的等分试样储存在4℃。对于抗体样品，在37℃在90％正常人血清(nhs,sanquinm0008ac)中的50μl100μg/ml抗体制剂样品在聚丙烯96孔u形底板(greinerbio-one；cat#650261)中温育1小时。接着，将5μl这些样品用样品稀释剂稀释90倍，并将100μl稀释的样品在室温在包被条中在摇动的情况下每孔温育30分钟，所述包被条用250μl清洗溶液预清洗三次。接着，将孔用250μl清洗溶液清洗五次，然后在室温在摇动的情况下温育每孔50μlc4d缀合物30分钟。将孔用250μl清洗溶液清洗五次，然后在室温下在摇动的情况下将每孔100μl底物温育30分钟。通过每孔加入50μl终止溶液终止反应，并在biotekel808微量板读数器(biospx)上用分光光度法在405nm处测量颜色强度。与阴性对照样品相比，阳性对照样品显示出明显增强的c4d水平(图10)。相反，在缺乏靶细胞的情况下在nhs中温育时对含有e430gfc-fc增强取代与c1q结合取代k326w/e333s,k326a/e333a或k326a/e333a/p396l的组合的所有测试的igg1-hdr5-01-g56t抗体变体未观察到c4d水平的清楚的增强(图10)，而当代表随机免疫复合物的阳性对照hagg和代表液相igg1六聚体的igg1-cona-rgy在nhs中温育时产生c4d。这些数据指示含有e430gfc-fc增强取代与c1q结合取代k326w/e333s,k326a/e333a或k326a/e333a/p396l组合的igg1-hdr5-01-g56t抗体变体未显示溶液相中的靶物非依赖性六聚化和补体活化。实施例12：组合e430g和k326w，e333s或k326w/e333s对激动性抗dr5抗体的c1q结合和功效的影响。进行c1q结合elisa以评估引入k326w，e333s或k326w/e333s取代对具有或不具有e430g取代的igg-cona-c49w变体的c1q结合的影响。igg-2f8-i253d/k322a用作c1q结合的阴性对照。如实施例4中所述，在测试不同浓度纯化c1q(范围0.010-30μg/ml，3倍稀释)的结合的用1μg/ml抗体包被的96孔板中进行elisa实验。在405nm处测量吸光度，并且通过使用graphpadprism软件拟合具有可变斜率的s形剂量-响应曲线来分析对数转换数据。图11a，b显示对于抗-dr5抗体igg1-cona-c49w及其具有e430gfc-fc相互作用增强和六聚化增强突变的变体igg1-cona-c49w-e430g两者，引入k326w，e333s或k326w/e333s取代均导致c1q与随机固定化的抗体的结合增加。igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g显示所有测试抗体变体的最高表观c1q结合亲和力。通过流式细胞术分析纯化的抗体变体与wil2-ssf悬浮细胞的结合。收获细胞，计数，在pbs中清洗并以3.33×106个细胞/ml重悬于培养基中。将30μl细胞(每孔1×105个细胞)移液到96孔板中。加入50μl抗体滴定系列样品(范围0.001-2.5μg/ml最终抗体浓度，3倍稀释的)并在37℃温育15分钟。随后，添加20μl纯化的c1q(2.5μg/ml终浓度)并在4℃温育45分钟。接着，加入100μlfacs缓冲液(pbs+0.1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)+0.02％(w/v)叠氮化钠)，然后用150μlfacs缓冲液清洗细胞两次。将清洗的细胞在4℃与50μl经fitc标记的兔抗人c1q抗体(20μg/ml终浓度；dakocat.no.f0254)一起温育30分钟。加入100μlfacs缓冲液，并且用facs缓冲液清洗细胞两次。将细胞重悬于30μlfacs缓冲液中，并使用iquescreener(intellicyt)通过流式细胞术测量荧光。使用graphpadprism软件，使用非线性回归分析(具有可变斜率的s形剂量响应)分析具有对数转换的c1q浓度轴的结合曲线。图11c，d显示仅在抗-dr5抗体igg1-cona-c49w中引入e333s或e430g取代对c1q结合与dr5阳性wil2-ssf细胞结合的抗体没有影响(图11c)。在抗dr5抗体igg1-cona-c49w或igg1-cona-c49w-e430g中引入k326w突变导致c1q与经抗dr5抗体调理的wil2-ssf细胞的结合增加，这与对用igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g调理的细胞观察到的c1q结合增加一致(图11c，d)。在抗-dr5抗体igg1-cona-c49w-e430g中引入e333s导致c1q与经抗体调理的wil2-ssf细胞结合的适度增加(图11d)。这些流式细胞术数据表明细胞结合的igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g显示出最亲合的c1q结合。进行存活力测定法以评估在具有或不具有e430g取代的抗dr5igg1-cona-c49w变体中引入k326w，e333s或k326w/e333s对wil2-ssf细胞上的dr5激动剂活性的影响。基本上如实施例8中所述进行1天存活力测定法。简言之，将无血清培养基中的100μl细胞(50.000细胞/孔)移液到96孔板中。添加25μl纯化的c1q(终浓度2.5μg/ml)和25μl浓度稀释系列的抗体样品(范围0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)，并在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiterglo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析对数转换的c1q浓度数据并绘图。图11e-g显示在抗dr5抗体igg1-cona-c49w中仅引入k326w，e333s或e430g突变未导致wil2-ssf细胞中dr5激动剂活性的诱导，而igg1-cona-c49w中的k326w/e333s双突变导致dr5激动剂活性的诱导和wil2-ssf细胞的部分杀伤(图11e)。在抗dr5抗体igg1-cona-c49w中将突变k326w，e333s突变或双突变k362w/e333s与fc-fc增强突变e430g组合导致dr5激动剂活性的诱导，其中k362w/e333s/e430g导致wil2-ssf细胞中最高的最大杀伤(图11f)。实施例13：组合e430g和k326w，e333s或k326w/e333s对激动性抗dr5抗体的c1q依赖性功效的影响。测试了在具有或不具有突变e430g的抗-dr5igg-cona-c49w抗体变体中引入k326w，e333s或k326w/e333s取代对c1q依赖性激动活性的影响。使用具有c1q浓度稀释系列的无血清培养基中的wil2-ssf细胞在体外进行1天存活力测定法，基本上如实施例8中所述。简言之，在96孔板中移液无血清培养基中的100μl细胞(50.000细胞/孔)。添加25μl抗体样品(2.5μg/ml终浓度)和25μl浓度稀释系列的纯化c1q(范围42pg/ml–2.5μg/ml终浓度，3倍稀释)并在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiter-glo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析c1q浓度对数转换数据并绘图。图12显示在抗dr5抗体igg1-cona-c49w中引入fc-fc增强取代e430g或c1q结合增强取代k326w或e333s作为单突变导致对wil2-ssf细胞的c1q剂量依赖性杀伤的诱导，并且与此相比，k326w/e333s双突变的引入导致对wil2-ssf细胞的c1q剂量依赖性杀伤的更有效诱导。组合e430gfc-fc增强取代和测试的c1q结合取代导致更有效的杀伤，igg-cona-c49w-k326w/e333s/e430g诱导对wil2-ssf细胞的最有效的c1q剂量依赖性杀伤(图12)。实施例14：c1q中和对具有e430g突变与k326w，e333s或k326w/e333s突变组合的抗dr5抗体的体外激动活性的影响。为了测试c1q对含有e430gfc-fc增强突变的激动剂抗dr5抗体功效的贡献，用在含有纯化的人c1q的无血清培养基中用igg1-cona-c49w变体调理的wil2-ssf细胞的存活力测定法中添加c1q中和抗体。基本上如实施例8中所述进行实验。简言之，将75μl细胞悬浮液接种在聚苯乙烯96孔平底板中在无血清培养基中(每孔50,000个细胞)。25μligg1-cona-c49w抗体变体(2.5μg/ml终浓度)，25μl纯化的c1q(在最终c1q浓度，接近根据表5的每种不同抗体的ec90浓度)和25μl(10μg/ml终浓度)c1q中和抗体(clb-c1q-85；sanquin,articleno.mw1828)或同种型对照抗体(纯化小鼠igg1，κ克隆mopc-21；bdbiosciencescat.no.555746)加入到wil2-ssf细胞中并在37℃培养1天。如实施例2中所述使用celltiter-glo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件分析和绘制数据。图13显示，在c1q中和抗体存在下，具有k326w/e430g，e333s/e430g或k326w/e333s取代的igg1-cona-c49w变体的dr5激动剂活性被完全抑制。对于igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g，c1q中和导致对于dr5激动剂活性的部分抑制。表5：在如实施例13(数据未显示)中所述的补充有纯化的c1q浓度系列的无血清培养基中的wil2-ssf细胞上的存活力测定法中2.5μg/ml指定抗体的c1qec90值。实施例15：fc-fc相互作用抑制对具有e430g突变与k326w，e333s或k326w/e333s组合的抗dr5抗体的体外激动活性的影响。为了测试fc-fc介导的抗体六聚化在igg1-cona抗体变体诱导细胞死亡中的牵涉，我们使用了13个残基的肽dcawhlgelvwct(delanoetal.,science2000feb18；287(5456):1279-83)，其结合包含参与fc-fc相互作用的疏水性结区域中的核心氨基酸的区域中的fc(diebolderetal.,science.2014mar14；343(6176):1260-3)。在存在或不存在dcawhlgelvwct肽的情况下测定wil2-ssf细胞的存活力，基本上如实施例14中所述。简言之，将75μlwil2-ssf细胞悬浮液接种在聚苯乙烯96孔平底板中的无血清培养基中(每孔50,000个细胞)。添加25μl抗体(2.5μg/ml终浓度)并在室温下温育10分钟。接着，添加25μl的fc-fc抑制肽dcawhlgelvwct或乱序对照肽wcdlegvtwhacl(80μg/ml)并在室温温育10分钟。然后，添加25μl纯化的c1q(在最终c1q浓度，接近每种不同抗体的ec90，如实施例14，表1中所列)，并将反应混合物在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiter-glo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件分析和绘制数据。图14显示在存在fc-fc抑制肽dcawhlgelvwct的情况下，具有k326w/e430g,e333s/e430g,k326w/e333s或k326w/e333s/e430g取代的igg1-cona-c49w变体的dr5激动剂活性受到部分抑制。fc-fc抑制肽抑制具有fc-fc增强突变e430g的igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g的激动活性，比没有突变e430g的igg1-cona-c49w-k326w/e333s的更强烈。实施例16：将k326w/e333s与fc-fc增强突变e345k，e345r或s440y组合对抗dr5抗体的激动剂活性的影响进行存活力测定法以研究将c1q结合取代k326w/e333s与fc-fc增强突变e345k，e345r或s440y组合对针对bxpc-3细胞调理的抗dr5抗体igg1-cona-c49w的激动剂活性的影响。基本上如实施例2中所述进行存活力测定法。简言之，将100μlbxpc-3单细胞悬浮液接种在聚苯乙烯96孔平底板(每孔5,000个细胞)的完全培养基(含有10％dbsi的rpmi)中，并允许在37℃粘附过夜。接着，添加50μl连续稀释抗体制剂系列(范围为0.0003至20μg/ml终浓度，5倍稀释)，并在37℃温育3天。使用celltiter-glo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件分析具有对数转换浓度轴的数据并使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)绘图。图15a显示igg1-cona-c49w对bxpc-3细胞的杀伤通过引入e345r突变强烈诱导，通过e430g或e345k突变略微诱导，而s440y没有效果。图15b显示igg1-cona-c49w-k326w/e333s变体对bxpc-3细胞的杀伤通过引入e430g，e345k或e345r突变而增加，而通过引入s440y突变未进一步增强。这些数据共同指示c1q结合增强k326w/e333s突变可以增强具有不同fc-fc增强突变如e430g，e345k或e345r的抗dr5激动剂igg1抗体的功效。实施例17：将e430g与其他fc修饰组合对激动性抗dr5抗体的功效的影响进行存活力测定法以研究组合fc-fc增强取代e430g与c1q结合取代s267e/h268f/s324t或igg1/igg3嵌合同种型变体113f对针对dr5阳性bxpc-3细胞调理的抗dr5抗体igg1-cona-c49w的激动活性的影响。基本上如实施例3中所述进行存活力测定法。简言之，将100μlbxpc-3单细胞悬浮液接种在聚苯乙烯96孔平底板(每个5,000个细胞)的培养基(含有10％热灭活的dbsi的rpmi)中，并允许在37℃粘附过夜。添加25μl纯化的c1q(2.5μg/ml终浓度)和浓度稀释系列的25μl抗体样品(范围为0.0003-20μg/ml的终浓度，5倍稀释)，并在37℃温育3天。如实施例2中所述，在celltiter-glo测定法中测定培养细胞的存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析具有对数转换浓度轴的数据，并使用graphpadprism软件绘图。图16显示将e430gfc-fc增强取代与c1q结合增强形式s267e/h268f/s324t(图16a)或igg113f(图16b)组合导致抗dr5抗体igg1-cona-c49w对粘附的人bxpc-3胰腺癌细胞的激动剂活性诱导。与igg1-cona-c49w-s267e/h268f/s324t/e430g和igg113f-cona-c49w-e430g相比，将e430g取代与k326w/e333sc1q结合增强突变组合导致igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g的更强的dr5激动活性。实施例18：含有k326w/e333s/e430g取代的单价抗dr5抗体的功效进行存活力测定法以研究针对bxpc-3胰腺癌细胞调理的含有k326w/e333s/e430g取代的单价抗dr5抗体的激动剂活性的影响。如实施例1中所述，通过igg1-cona-c49w-f405l-k326w/e333s/e430g和igg1-b12-k409r-k326w/e333s/e430g之间的受控fab臂交换产生单价dr5抗体。产生的双特异性抗体，称为bsab(igg1-cona-c49w-f405lxigg1-b12-k409r)-k326w/e333s/e430g，含有一个特异于dr5的臂和一个针对hiv糖蛋白gp120的非特异性臂，导致dr5阳性人细胞上的单价dr5结合。基本上如实施例8中所述，对wil2-ssf细胞进行1天存活力测定法。简言之，将无血清培养基中的100μlwil2-ssf细胞移液到96孔板(50.000细胞/孔)中。将25μl纯化的c1q(2.5μg/ml终浓度)和浓度稀释系列的25μl抗体样品(范围为0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)加入细胞中并在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiter-glo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析具有对数转换浓度轴的数据，并使用graphpadprism软件绘图。图17显示在存在k326w/e333s/e430g突变的情况下，igg1-cona-c49w单价变体仍可诱导对wil2-ssf细胞的杀伤。实施例19：组合e430g和k326w/e333s对抗dr5抗体的不同同种型变体的激动剂活性的影响。为了测试引入k326w/e333s/e430g取代是否可以在非igg1抗体主链中诱导抗-dr5抗体的激动剂活性，通过本领域已知方法产生具有人igg3恒定域的igg1-cona-c49w的igg3同种型变体，产生igg3-cona-c49w。igg3主链还含有r345h突变以增强fcrn结合(stapletonetal.,2011natcommun)。在igg1和igg3同种型变体两者中引入k326w/e333s/e430g取代，并且使用不同细胞系在体外存活力测定法中测试不同抗体的激动剂活性：人wil2-ssfb淋巴母细胞，bxpc-3和hpaf-ii(atcc，crl-1997)胰腺癌细胞和ht-29(atcc，htb-38)结肠癌细胞。基本上如实施例8中所述，使用wil2-ssf悬浮细胞进行存活力测定法。简言之，将100μlwil2-ssf细胞移液到96孔板(50.000细胞/孔)中的无血清培养基中。接着，将25μl纯化的c1q样品(2.5μg/ml终浓度)和25μl浓度稀释系列的抗体样品(范围0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)加入细胞中并在37℃温育1天。对于粘附细胞bxpc-3，hpaf-ii和ht-29，进行3天存活力测定法，基本上如实施例3中所述。简言之，将培养基(rpmi1640，具有25mmhepes和l-谷氨酰胺+10％热灭活的dbsi+50u/mlpen/strep)中的100μl细胞移液到96孔板(5.000个细胞/孔)中，并通过在37℃温育过夜允许粘附。接着，将25μl纯化的c1q样品(2.5μg/ml终浓度)和25μl浓度稀释系列的抗体样品(范围0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)加入细胞中并在37℃温育3天。如实施例2中所述使用celltiter-glo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析具有对数转换浓度轴的数据，并使用graphpadprism软件绘图。图18显示在抗dr5抗体的igg3变体(igg3-dr5-cona-c49w-r435h-k326w/e333s/e430g)中引入k326w/e333s/e430g取代在所有测试细胞系中诱导激动剂活性：wil2s-sf(图18a)，bxpc-3(图18b)，hpaf-ii(图18c)和ht29(图18d)。在所有测试的细胞系中，igg1变体igg1-dr5-cona-c49w-k326w/e333s/e430g比igg3变体igg3-dr5-cona-c49w-r435h-k326w/e333s/e430g更有效。实施例20：组合e430g与k326w/e333t对抗dr5抗体的激动剂活性的影响进行存活力测定法以评估与k326w/e333s相比fc-fc增强取代e430g和k326w/e333t的组合对抗dr5抗体igg1-cona-c49w对dr5阳性wil2-s细胞的激动活性的影响。基本上如实施例8中所述进行体外存活力测定法。简言之，将100μlwil2-s细胞移液到96孔板(50.000细胞/孔)中的培养基(rpmi1640，含有25mmhepes和l-谷氨酰胺(lonza,catnobe12-115f)+10％热灭活的dbsi+1mm丙酮酸钠(lonza,目录号be13-115e)+50u/mlpen/strep)中。接着，将50μl浓度稀释系列的抗体样品(范围0.001-20μg/ml终浓度，5倍稀释)和10μl纯化的c1q样品(2.5μg/ml终浓度)加入细胞并在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiterglo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析和绘制数据。图19显示在igg1-cona-c49w中引入k326w/e333t/e430g导致与通过引入k326w/e333s/e430g在wil2-s细胞上的体外存活力测定法中具有类似的杀伤效力的单一试剂的dr5激动剂活性的诱导。实施例21：含有fc-fc增强突变和/或影响c1q结合的fc突变的igg1-cona-c49w抗体变体的药代动力学(pk)分析。在scid小鼠的pk实验中研究了e430gfc-fc增强突变和c1q结合增强突变对igg1-cona-c49w清除率的影响。所有测试的抗体变体列于表6中。动物实验按照从指令(2010/63/eu)转化的荷兰动物保护法(wod)和若适用的话实践准则“癌症研究动物实验”(inspectionv&w,zutphen,thenetherlands,1999)进行，并且并得到乌特勒支伦理委员会的批准。根据felasa定义的良好动物实践，在aaalac和iso9001:2000认可的动物房(gdl)中饲养和处理动物。给11-12周龄雌性scid小鼠(c.b-hsd-prkdcscid；envigoscid小鼠)静脉内注射200μl注射体积中的450μg抗体(22.5mg/kg)(每组3只小鼠)。在抗体施用后10分钟，4小时，1天，2天，7天，14天和20天从隐静脉收集50μl血液样品。将血液收集到含肝素的小瓶中，并以14,000g离心10分钟。用380μlpbs(1:20)稀释20μl血浆样品并储存在-20℃直至测定抗体浓度。使用夹心elisa测定总人igg浓度。使用小鼠抗人igg-kappamab克隆mh16(clbsanquin,目录号m1268)作为捕获抗体，并在4℃以pbs中浓度2μg/ml在100μl中包被过夜至96孔microlonelisa板(greiner，germany)。通过在平板摇动器上在室温用补充有0.2％牛血清白蛋白(bsa)的pbs温育平板来封闭平板。清洗后，加入100μl稀释的血浆样品，并在平板摇动器上于室温温育1小时。将板用300μlpbst(补充有0.05％tween20的pbs)清洗三次，随后在平板摇动器上在室温与100μl过氧化物酶标记的山羊抗人igg免疫球蛋白(#109-035-098,jackson,westgrace,pa；补充有0.2％bsa的pbst中的1:10.000)温育1小时。将板用300μlpbst再清洗三次，然后在室温与100μl底物2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[abts；roche,目录号11112422001；50mlabts缓冲液中1片(roche,目录号11112597001)]温育15分钟，避光。通过加入100μl2％草酸并在室温温育10分钟来终止反应。在微板阅读器(biotek，winooski，vt)中在405nm处测量吸光度。通过使用注射的材料作为参考曲线计算浓度。作为平板对照，包括含有igg的人骨髓瘤蛋白(结合位点，目录号bp078)。绘制人igg浓度(以μg/ml计)(图20a)，并使用graphpadprism计算曲线下面积(auc)。直到血液取样的最后一天(第21天)的清除率由公式d*1.000/auc测定，其中d是22.5mg/kg的注射剂量(图20b)。所有测试的含有e430gfc-fc增强突变和/或c1q结合增强突变的igg1-cona-c-49w变体显示出与wtigg1相当的清除率(图20a，b)。总之，引入c1q结合增强突变如k326w/e333s或k326a/e333a不显著影响含有e430gfc-fc增强突变的igg1抗体的清除率，例如在igg1-cona-c49w-k326w/e333s/e430g和igg1-cona-c49w-k326a/e333a/e430g中。表6：在scid小鼠中的pk分析中测试的igg1-cona-c49w抗体变体实施例22：组合e430gfc-fc增强突变和c1q结合增强突变k326a/e333a或k326w/e333s对igg1抗体的fcrn结合的影响。新生儿fc受体(fcrn)通过保护igg免于降解而负责igg的长血浆半衰期。在抗体内化后，fcrn结合内体中的抗体fc区，其中相互作用在温和酸性环境(ph6.0)中是稳定的。在再循环到质膜(其中环境是中性(ph7.4))时，相互作用丧失并且抗体被释放回循环中。这影响igg的血浆半衰期。进行fcrn结合elisa以评估引入fc-fc增强突变和c1q结合增强突变k326a/e333a或k326w/e333s的组合对人fcrn与igg1-7d8抗体变体的结合的影响。igg1-7d8-i235a/h310a/h435a用作fcrn结合的阴性对照(fcrn敲除；shieldsetal.,j.biol.chem.2001；276:6591)；igg1-7d8-m252y/s254t/t256e用作增强的fcrn结合的对照(dall'acquaetal.,jbiolchem.2006aug18；281(33):23514-24)。所有温育均在室温进行。用pbst和0.2％bsa中稀释的5μg/ml(100μl/孔)重组产生的人fcrn的生物素化胞外域(fcrnecdhis-b2m-bio，即具有c末端his和bap标签的人fcrn的胞外域，作为与β2微球蛋白的二聚体)包被96个streptawell板(roche，目录号1734776001)达1小时。将板用pbst清洗三次。添加连续稀释的抗体样品(范围0.003-10μg/ml终浓度，在pbst/0.2％bsa,ph6.0中的3倍稀释)并温育1小时。用pbst/0.2％bsa，ph6.0清洗平板。添加用pbst/0.2％bsa,ph6.0或7.4中稀释的辣根过氧化物酶(hrp)缀合的多克隆山羊-抗-人igg(1:10,000；jacksonimmunoresearch,目录号109-035-097)，并温育平板1小时。清洗后，添加100μlabts(1mg/ml)作为底物，并且将板避光温育30分钟。使用100μl2％草酸终止反应，并使用elx808吸光度微板读数器(biotek)在405nm测量吸光度。通过使用graphpadprism软件拟合具有可变斜率的s形剂量-响应曲线来分析对数变换的数据。阴性对照(igg1-7d8-i235a/h310a/h435a)在ph6.0显示人fcrn结合完全丧失(图21a)，而与于ph6.0的wtigg1-7d8和ph7.4时的结合丧失相比，阳性对照(igg1-7d8-m252y/s254t/t256e)显示与人fcrn的增强的结合(图21b)。具有fc-fc增强突变且具有或不具有c1q结合增强突变的所有测试的igg1-7d8变体显示在ph6.0与人fcrn的有效结合以及在ph7.4的结合丧失。然而，与wtigg1-7d8相比，单独引入fc-fc增强突变e430g导致在ph6.0与人fcrn的结合略微降低，其当与c1q结合增强突变k326a/e333a或k326w/e333s突变组合时稍微进一步降低。实施例23：c1q对含有k326w/e333s/e430g取代的抗cd20igg1-7d8抗体变体的adcc活性的影响。使用无血清培养基中的wil2-ssf细胞在铬释放测定法中测试c1q对含有e430gfc-fc增强突变和c1q结合增强取代k326w/e333s两者的抗cd20igg1-7d8抗体变体的adcc活性的影响。收获wil2-ssf细胞(5x106个细胞/ml)，清洗(在pbs中两次，1,200rpm，5分钟)并收集在1ml无血清培养基(补充有10％丙酮酸钠的hyqadcf-mab培养基)中。添加200μci51cr(铬-51；amershambioscienceseuropegmbh)并在37℃在振荡水浴中温育1小时。清洗细胞(pbs中两次，1,200rpm，5分钟)后，将细胞重悬于无血清培养基中。通过锥虫蓝排除法计数铬标记的细胞，并稀释至1x105个细胞/ml的浓度。根据制造商的用法说明(淋巴细胞分离培养基；lonza)，使用标准ficoll密度离心从健康供体(sanquin)的新鲜血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞(pbmc)。在无血清培养基中重悬pbmc后，通过锥虫蓝排除法计数pbmc并浓缩至1x107个细胞/ml。对于adcc实验，将50μl铬标记的wil2-ssf细胞移液到96孔板(5,000个细胞/孔)中。添加来自稀释系列的25μl抗体样品(范围为0.003-10μg/ml终浓度，3倍稀释)和25μl纯化的人c1q(2.5μg/ml终浓度)或培养基并在室温预温育10分钟。接着，添加50μlpbmc(500.000个细胞/孔)，导致效应物与靶物的比率为100:1，并在37℃温育4小时。通过将50μl铬标记的wil2-ssf细胞(5,000个细胞/孔)与100μl5％triton-x100(sigma-aldrich)一起温育来测定最大细胞裂解。通过在不含抗体和效应细胞的150μl培养基中温育铬标记的wil2-ssf细胞(5,000个细胞/孔)来测定自发裂解。通过在不存在抗体的情况下将铬标记的wil2-ssf细胞(5,000个细胞/孔)与pbmc(500.000个细胞/孔)在150μl的总体积中温育来测定抗体非依赖性细胞裂解。使用闪烁计数器测定细胞裂解量。将细胞离心(1,200rpm；3分钟)并将25μl上清液转移至填充有100μlmicroscint-40溶液的96孔白色optiplates。使用闪烁计数器计数上清液中释放的51cr。测量的每分钟计数(cpm)用于根据下式计算抗体介导的裂解的百分比：(cpm样品-cpm抗体非依赖性裂解)/(cpm最大裂解-cpm自发裂解)×100％。作为阴性对照，测试非特异性igg1-b12抗体和具有l234a/l235a/p329g取代的igg1-7d8变体，已知所述取代消除补体结合和活化以及fcγr结合和adcc诱导(loetal.jbc2017)。如所预期的，在不存在或存在c1q的情况下都未观察到非特异性抗体igg1-b12的adcc活性(图22)。对于igg1-7d8-f405l-k326w/e333s/e430g抗体，添加2.5μg/ml纯化的人c1q导致在无血清培养基中对wil2-ssf细胞的adcc活性的抑制。相反，c1q不影响wtigg1-7d8和igg1-7d8-e430g的adcc活性。实施例24：k326w/e333s/e430g对抗dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-05的激动剂活性的影响。在使用wil2-ssf细胞的体外存活力测定法中测试在抗-dr5抗体igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-05的激动剂活性上引入fc-fc增强突变e430g和c1q结合增强突变k326w/e333s的组合的效果。基本上如实施例8中所述进行1天存活力测定法。简言之，将100μl无血清培养基中的细胞移液到96孔板(50.000细胞/孔)中。添加25μl浓度稀释系列的抗体样品(范围为0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)和25μl纯化的c1q(2.5μg/ml终浓度)，并在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiterglo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析和绘制数据。引入e430gfc-fc增强和k326w/e333sc1q结合增强突变两者导致这两种测试抗体igg1-hdr5-01-g56t和igg1-hdr5-05诱导dr5激动剂活性，而这些抗体当仅引入e430gfc-fc增强突变时没有诱导细胞杀伤(图23)。实施例25：在激动剂抗dr5抗体组合中k326w/e333s/e430g与互补fc突变对k439e；s440k的相容性。在wil2-ssf细胞上进行的体外存活力测定法中使用抗dr5激动剂抗体组合igg1-hdr5-01-k326w/e333s/e430g+igg1-hdr5-05-k326w/e333s/e430g测试k326w/e333s/e430g突变与其他fc工程突变的相容性，如互补fc突变对k439e；s440k，其可以控制不同细胞表面靶物结合抗体之间的分子间fc-fc相互作用。基本上如实施例8中所述进行1天存活力测定法。简言之，将100μl无血清培养基中的细胞移液到96孔板(50.000细胞/孔)中。添加25μl浓度稀释系列的抗体样品(范围为0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)和25μl纯化的c1q(2.5μg/ml终浓度)，并在37℃温育1天。如实施例2中所述使用celltiterglo测定法测定细胞存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析和绘制数据。图24显示含有fc-fc抑制突变k439e的单一抗体igg1-hdr5-01-k326w/e333s/e430g-k439e几乎不诱导任何细胞杀伤。含有fc-fc抑制突变s440k的igg1-hdr5-05-k326w/e333s/e430g-s440k诱导一些细胞杀伤，尽管最大杀伤不是100％。相反，组合两种互补fc-fc控制突变k439e和s440kigg1-hdr5-01-k326w/e333s/e430g-k439e+igg1-hdr5-05-k326w/e333s/e430g-s440k两者的组合显示出有效细胞杀伤，其与没有互补fc-fc控制突变k439e和s440k的组合相似。含有k326w/e333s/e430g突变(含有和不含互补突变k439e；s440k)的抗体组合的细胞杀伤比仅含有e430gfc-fc增强突变的抗体组合(igg1-hdr5-01-k326w/e333s/e430g-k439e+igg1-hdr5-05-k326w/e333s/e430g-s440k)有效得多。实施例26：将c1q结合增强取代k326w/e333s与k248e/t437r组合对抗cd52抗体的cdc功效的影响对cd52敏感性wien133b细胞淋巴瘤细胞使用抗cd52igg1-campath变体(基于阿仑珠单抗)测试将k326w/e333sc1q结合增强突变与促进细胞表面上的抗体多聚化的k248e/t437r取代(zhangetal.,2017mabs(9)7:1129-42)组合对cdc功效的影响。收获wien133细胞(由geoffhale博士，bioanalablimited，oxford，uk提供)并重悬于培养基[含有0.2％牛血清白蛋白(bsa；rochecatno.10735086001)的rpmi(lonza,catno.be12-115f)]中。将40μl细胞移液到圆底96孔板(0.1x106细胞/孔)中。添加40μl连续稀释的抗体样品(范围为0.002-40μg/ml终浓度，4倍稀释)，并在室温振荡温育15分钟。接着，添加20μlnhs(20％终浓度)作为人补体来源并在37℃温育45分钟。通过将样品置于冰上来终止反应。将冷却的细胞沉淀并重悬于30μl2μg/ml碘化丙啶(pi；sigmaaldrich)中。在intellicytiquescreenerplus上通过流式细胞术分析样品，并根据下式确定裂解百分比：％裂解＝(pi阳性细胞数/细胞总数)x100％。图25显示在wtigg1-campath中引入六聚化增强单突变e430g或多聚化增强双突变k248e/t437r导致对wien133细胞的cdc功效增加。通过在igg1-campath-k248e/k326w/e333s/t437r中组合促进细胞表面上多聚化的k248e/t437r突变和增强c1q结合的k326w/e333s突变进一步增强cdc功效。实施例27：在存在c1q的情况下组合e430g和k326w/e333s对激动性抗dr4抗体功效的影响。进行存活力测定法以研究六聚化增强突变e430g和k326w/e333s的组合对抗dr4抗体chctb007对dr4阳性bxpc-3细胞的激动活性的影响。基本上如实施例2中所述进行存活力。简言之，将100μlbxpc-3单细胞悬浮液接种在聚苯乙烯96孔平底板(每个5,000个细胞)的培养基(含有10％热灭活的dbsi的rpmi)中，并允许在37℃粘附过夜。添加25μl纯化的c1q样品(2.5μg/ml终浓度)和浓度稀释系列的25μl抗体样品(范围0.00001-20μg/ml终浓度，5倍稀释)，并在37℃温育3天。如实施例2中所述，在celltiter-glo发光细胞存活力测定法中测定培养细胞的存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光，并使用graphpadprism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析数据并绘图。图26显示了当在补充有2.5μg/ml纯化的c1q的热灭活的胎牛血清存在下对粘附的人bxpc-3胰腺癌细胞的体外存活力测定法中作为单一试剂测试时，组合六聚化增强突变e430g和两个突变k326w/e333s导致类似于三重突变体e345r/e430g/s440y的抗dr4抗体igg1-dr4-chctb007的强杀伤效力的诱导。相反，当作为野生型抗体igg1-dr4-chctb007测试或当仅存在突变e430g时，这些抗体未显示对这些预先粘附的bxpc-3细胞的有效杀伤。这些数据显示k326w/e333s/e430g突变诱导抗dr4抗体对补充有c1q的粘附bxpc-3细胞的强激动活性。实施例28：引入六聚化增强e430g突变与c1q结合增强突变k326w/e333s组合改善fas抗体的补体依赖性细胞毒性(cdc)和细胞死亡诱导的功效。fas受体是细胞表面上的死亡受体，其通过fas配体交联受体而导致程序性细胞死亡(凋亡)(wajantetal.,2002science296(5573):1635–6)。fas也称为凋亡抗原1(apo-1或apt)，分化簇95(cd95)或肿瘤坏死因子受体超家族成员6(tnfrsf6)。在fas阳性wil2-sb淋巴细胞的体外cdc测定法中分析含有k326w/e333s/e430g三重突变的抗fas抗体的cdc。使用wil2-ssf细胞在cdc测定法中研究了在不同fas抗体igg1-fas-e09，igg1-cd95-apo1和igg1-cd95-hfe7a中引入六聚化增强突变e430g与c1q结合增强突变k326we333s的组合，基本上如实施例26中所述，简言之，在室温在摇动器上将rpmi-1640培养基中的30μlwil2-ssf细胞(3.33x106个细胞/ml)在圆底96孔板(0.1x106细胞/孔)中与50μl抗体浓度系列(0.003-10.0μg/ml终浓度，3倍稀释)预温育15分钟。接着，添加20μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，并在37℃培养箱中温育45分钟。通过将板置于冰上以停止反应。通过碘化丙啶染色测定细胞裂解。使用ique筛选器通过流式细胞术分析样品。使用graphpadprism软件分析，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析具有对数转换浓度轴的数据并绘图。所有三种野生型抗fas抗体igg1-fas-e09(图27a)，igg1-cd95-apo1(图27b)和igg1-cd95-hfe7a(图27c)均未诱导与阴性对照抗体igg1-b12相似的cdc。具有fc-fc增强突变(e430g)或c1q结合增强突变(k326w/e333s)的igg1-fas-e09诱导cdc。在igg1-fas-e09中将e430g与k326w/e333s组合产生最大cdc，类似于igg1-fas-e09-e345r/e430g/s440y。用igg1-cd95-apo1观察到类似的模式，其中igg1-cd95-apo1-e430g诱导cdc，igg1-fas-e09-k326w/e333s/e430g可以进一步增强cdc。对于抗体igg1-cd95-hfe7a，添加突变e430g对cdc没有影响，然而具有三重突变k326w/e333s/e430g的igg1-cd95-hfe7a完全拯救cdc至最大裂解。为了证实在上述cdc测定法中观察到的细胞杀伤是由于补体介导的裂解，使用添加纯化的c1q(quidel)作为交联剂的无血清培养基中的wil2-ssf进行存活力测定法。基本上如实施例8中所述进行存活力测定法。简言之，将100μlwil2-ssf细胞移液到96孔板(50.000细胞/孔)中的无血清培养基中。接着，将50μl浓度稀释系列的抗体样品(范围为0.0003-20μg/ml终浓度，5倍稀释)和10μl纯化的c1q(2.5μg/ml终浓度)加入细胞中并在37℃温育45分钟或24小时。如实施例2中所述，使用celltiterglo测定法测定培养细胞的存活力。在envisionmultilabelreader(perkinelmer)上测量发光。使用graphpadprism软件分析，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析具有对数转换浓度轴的数据并绘图。图28显示了在2.5μg/mlc1q存在下与抗体温育45分钟后细胞的rlu(原始数据)。在这短暂的温育期后，无一抗体影响细胞的存活力。图29a显示在24小时存活力测定法中，引入单一六聚化增强突变e430g以及c1q结合增强突变k326w/e333s使得fas抗体igg1-fas-e09能够在存在c1q的情况下诱导wil2-ssf的剂量依赖性杀伤，而野生型抗体不能在测试的抗体浓度下诱导杀伤。当fc-fc增强突变e430g在igg1-fas-e09中与c1q结合增强突变k326w/e333s组合时，抗体在24小时存活力测定法中在存在c1q的情况下与e345r/e430g/s440y一样有效。图29b显示，对于igg1-cd95-apo1抗体，e430g或k326w/e333s/e430g的引入也导致c1q存在下剂量依赖性wil2-ssf杀伤，其中k326w/e333s/e430g三重突变体是最有力的。图29c显示对于igg1-cd95-hfa7e，需要c1q结合增强和fc-fc增强的组合(k326w/e333s/e430g)以在c1q存在下诱导增殖抑制。作为对照实验，还使用不含c1q的wil2-ssf细胞进行24小时存活力测定法。图30a显示引入六聚化增强突变e345r/e430g/s440y使得fas抗体igg1-fas-e09能够诱导不依赖于c1q的wil2-ssf细胞的剂量依赖性杀伤，而野生型抗体和仅具有fc-fc增强突变e430g或c1q结合增强突变k326w/e333s的抗体变体在没有c1q的情况下不能在测试的抗体浓度下诱导杀伤。然而，在不存在c1q的情况下，引入fc-fc增强和c1q结合增强突变两者(igg1-fas-e09-k326w/e333s/e430g)导致细胞存活力丧失高达25％。在不存在c1q的情况下，k326w/e333s/e430g的引入对igg1-cd95-apo1具有类似的效果(图30b)，但对igg1-cd95-hfa7e没有影响(图30c)。总之，在抗fas抗体中将fc-fc增强突变e430g与c1q结合增强突变k326w/e333s组合可在45分钟后诱导wil2-ssf细胞的cdc。该过程完全是血清依赖性的，因为单独的c1q在45分钟后不诱导细胞杀伤。然而，在c1q存在下将抗fas抗体与突变k326w/e333s/e430g温育24小时后确实诱导杀伤并且优于e430g和k326w/e333s突变体的杀伤效力。实施例29：将e430gfc-fc增强突变与k326w/e333s突变组合对抗ox40抗体对jurkat细胞上的ox40活化的影响。ox40配体(ox40l)对ox40配体受体(cd134)的交联可以诱导表达ox40的t细胞的增殖(gramagliaetal.,1998j.immunol.161,6510–6517)。使用ox40生物测定试剂盒(promega，目录号cs197704)，使用不同的抗ox40抗体igg1-sf2变体测试突变k326w/e333s对ox40信号传导的影响，基本上根据制造商提供的用法说明。thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2/ox40jurkat细胞(promega，目录号cs197704)(其稳定表达人ox40和nfat响应元件下游的萤光素酶报告物基因)在ox40活化后表达萤光素酶。将25μl新鲜解冻的细胞在存在8％胎牛血清(fbs,promegaref.j121a)的情况下在25μlrpmi1640培养基(promega，目录号g708a)中在96孔白色f底optiplates(perkinelmer，目录号6005299)中温育过夜。次日，将连续稀释的抗体(19.5-5,000ng/ml终浓度，4倍稀释)添加到培养基中的细胞至终体积80μl。将细胞再温育5小时，然后添加bio-glo试剂(promega，目录号cs197704)。在环境温度下温育5-10分钟后，使用envisionmultilabel读板器记录发光。图31显示野生型抗ox40抗体igg1-cd134-sf2不诱导ox40响应。引入fc-fc增强突变在e345r的情况下导致强诱导，并且在e430g的情况下导致ox40响应的温和诱导。将e430gfc-fc增强突变与c1q结合增强突变k326w/e333s组合导致igg1-sf2的强激动剂活性。实施例30：k326w/e333s/e430g突变对胎牛血清存在下抗cd40抗体对u20s细胞上cd40活化的影响。通过th细胞上的cd40配体交联抗原呈递细胞上发现的cd40受体可以诱导多种下游效应(chatzigeorgiouetal.,2009biofactors(oxford,england)35(6):474–83)。使用cd40生物测定试剂盒(promega，目录号cs1979a06)，使用抗cd40抗体的不同变体sgn40和cp870893基本上根据制造商提供的用法说明测试突变k326w/e333s/e430g对cd40信号传导的影响。thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2p/u20s(其稳定表达人cd40和nfat响应元件下游的萤光素酶报告物基因)在cd40活化后表达萤光素酶。将25μl新鲜解冻的细胞在存在8％胎牛血清(j1211)的情况下在25μlrpmi1640培养基(promega，目录号g708a)中在96孔白色f底optiplates(perkinelmer，目录号6005299)中温育过夜。次日，将连续稀释的抗体或纯化的重组cd40配体(r&dsystems，目录号6420-cl-025/cf)加入到培养基中的细胞中至终浓度80μl。将细胞再温育5小时，然后加入bio-glo试剂(promega，目录号cs197704)。在环境温度下温育5-10分钟后，使用envisionmultilabel读板器记录发光。使用胎牛血清(fbs，promegaref.j121a)作为血清来源。以范围为0.1至25,000ng/ml的连续稀释测试抗体。在cd40响应测定法中用作阳性对照的重组cd40配体(范围为0.04至10,000ng/ml的连续稀释)相对于非结合阴性对照抗体igg1-b12诱导清楚的响应信号(图32)。野生型抗cd40抗体igg1-sgn40诱导的cd40响应水平基本上类似于阴性对照抗体igg1-b12。相反，仅含有e430g突变的igg1-cd40-sgn40变体诱导cd40响应(ec50336.4±15.3sdng/ml)，所述e430g突变在细胞表面结合后诱导抗体之间的fc-fc相互作用。具有e430gfc-fc增强突变与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的igg1-cd40-sgn40变体进一步增强igg1-sgn40的效力(ec5018.0±1.1sdng/ml)。野生型抗体igg1-cd40-cp870893已经能够诱导cd40响应(ec50187.4±9.2sdng/ml)，其可以通过k326w/e333s/e430g(ec5045.9±3.3sdng/ml)进一步增强至与cd40配体相似的水平。总之，k326w/e333s/e430g突变增强在胎牛血清存在下抗cd40抗体对u20s细胞上cd40的活化。表7：cd40配体和igg1-cd40抗体和变体的ec50和sd实施例31：k326w/e333s/e430g突变对胎牛血清存在下抗-4-ibb抗体对jurkat细胞上4-ibb(cd137)活化的影响。4-1bb或cd137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)，是肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员，并且由淋巴细胞活化诱导(ila)(schwarzetal.,1993,gene.134(2):295–8)。4-1bb的交联增强t细胞增殖，il-2分泌，存活和细胞溶解活性(sicaetal.,2000arch.immunol.ther.exp.(warsz.).47(5):275–9)。使用4-1bb生物测定试剂盒(promega，目录号cs196005)基本上按照制造商提供的用法说明，使用抗4-1bb抗体的不同变体mor7480和bms-663513测试突变k326w/e333s/e430g对4-1bb信号传导的影响。thaw-and-usegloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞(其稳定表达人4-1bb和nfat响应元件下游的萤光素酶报告物基因)在cd40活化后表达萤光素酶。将25μl新鲜解冻的细胞在存在1％胎牛血清(j121a)的情况下在25μlrpmi1640培养基(promega，目录号g708a)中在96孔白色f底optiplates(perkinelmer，目录号6005299)中温育过夜。次日，将连续稀释的具有his标签的抗体或纯化的重组4-1bb配体(r&dsystems,2295-4l-025/cf)，抗his标签抗体(克隆j099b12)加入培养基中的细胞至最终体积80μl。将细胞再温育5小时，然后加入bio-glo试剂(promega，目录号cs197704)。在环境温度下温育5-10分钟后，使用envisionmultilabel读板器记录发光。使用胎牛血清(fbs，promegaref.j121a)作为血清来源。在4-1bb响应测定法中用作阳性对照的重组4-1bb配体和抗his抗体混合物相对于非结合阴性对照抗体igg1-b12-wsg诱导清楚的响应信号(图33)。含有fc-fc增强突变e430g和c1q结合增强突变k326w/e333s组合的测试抗体在胎牛血清存在下诱导jurkat细胞上4-1bb信号传导的剂量依赖性活化(对于igg1-cd137-mor7480-k326w/e333s/e430g为ec5016.9ng/ml和对于igg1-bms-663513-k326w/e333s/e430g为ec5032.9ng/ml)。实施例32：k326w/e333s/e430g突变对胎牛血清存在下抗gitr抗体对jurkat细胞上gitr活化的影响。gitr(糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白)或肿瘤坏死因子受体超家族成员18(tnfrsf18)是tnfr超家族的成员。gitr由gitr配体(gitrl)活化，gitr配体主要在apc上表达。在次优tcr刺激后t细胞上gitr与激动剂抗体，重组gitrl或gitrl转染子的结合通过上调cd25，诱导il-2和ifnγ表达以及增加增殖来增强t细胞活化(kneeetal.于eurjcancer.2016nov；67:1-10综述)。使用gitr生物测定试剂盒(promega，目录号cs184006)基本上根据制造商提供的用法说明，使用抗gitr抗体的不同变体incagn01876测试突变k326w/e333s/e430g对gitr信号传导的影响。thaw-and-usegloresponsenfκb-luc2p/gitrjurkat细胞(其稳定表达人gitr和nfat响应元件下游的萤光素酶报告物基因)在gitr活化后表达萤光素酶。将25μl新鲜解冻的细胞在存在8％胎牛血清(j1211)的情况下在25μlrpmi1640培养基(promega，目录号g708a)中在96孔白色f底optiplates(perkinelmer，目录号6005299)中温育过夜。次日，将连续稀释的抗体加入到培养基中的细胞至终浓度80μl。将细胞再温育5小时，然后加入bio-glo试剂(promega，目录号cs197704)。在环境温度下温育5-10分钟后，使用envisionmultilabel读板器记录发光。使用胎牛血清(fbs，promegaref.j121a)作为血清来源。非结合阴性对照抗体igg1-b12定义背景信号。野生型抗gitr抗体igg1-gitr-incagn01876诱导gitr响应水平，刚好高于阴性对照抗体igg1-b12(图34)。相反，仅含有e430gfc-fc增强突变的igg1-gitr-incagn01876变体诱导更强的gitr响应。具有e430gfc-fc增强突变与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的igg1-gitr-incagn01876进一步增强了igg1-gitr-incagn01876的效力。总之，k326w/e333s/e430g突变增强胎牛血清存在下通过抗gitr抗体对jurkat细胞上gitr的活化。实施例33：k326w/e333s/e430g突变对胎牛血清存在下不同igg亚类的抗gitr抗体对jurkat细胞上gitr活化的影响。使用如实施例32中所述的gitr生物测定试剂盒，在胎牛血清存在下，使用抗gitr抗体36e5的igg1，igg2，igg3和igg4亚类变体测试突变k326w/e333s/e430g对gitr信号传导的影响。以终浓度111ng/ml测试抗体。与非结合对照igg1-b12相比，野生型igg1抗gitr抗体igg1-gitr-36e5诱导低gitr激动剂响应(图35)。引入e430gfc-fc增强突变导致gitr激动剂响应的适度增加。具有e430gfc-fc增强突变与c1q结合增强突变k326w/e333s组合的igg1-gitr-36e5变体进一步增强抗体效力至最大响应。在igg2亚类igg2-gitr-36e5中引入k326w/e333s/e430g导致适度的gitr激动剂响应。在igg3-gitr-36e5和igg4-gitr-36e5中，引入k326w/e333s/e430g突变导致低gitr激动剂响应，类似于wtigg1抗体的水平。序列表<110>根马布私人有限公司<120>多肽变体及其用途<130>p/0114-wo<160>172<170>patentinversion3.5<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>1glypheasnilelysaspthrphe15<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>2ileaspproalaasnthrasnthr15<210>3<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>3valargglyleutyrthrtyrtyrpheasptyr1510<210>4<211>118<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>4gluvalglnleuglnglnserglyalagluvalvallysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglypheasnilelysaspthr202530pheilehistrpvallysglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glyargileaspproalaasnthrasnthrlystyraspprolysphe505560glnglylysalathrilethrthraspthrserserasnthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095valargglyleutyrthrtyrtyrpheasptyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserser115<210>5<211>448<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>5gluvalglnleuglnglnserglyalagluvalvallysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglypheasnilelysaspthr202530pheilehistrpvallysglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glyargileaspproalaasnthrasnthrlystyraspprolysphe505560glnglylysalathrilethrthraspthrserserasnthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095valargglyleutyrthrtyrtyrpheasptyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro115120125leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly130135140cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn145150155160serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln165170175serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser180185190serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser195200205asnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplysthr210215220histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser225230235240valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg245250255thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro260265270gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala275280285lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval290295300servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr305310315320lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr325330335ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu340345350proproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcys355360365leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser370375380asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp385390395400seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser405410415argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala420425430leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys435440445<210>6<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>6glnserileserasnasn15<210>7<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>7glnglnglyasnsertrpprotyrthr15<210>8<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>8gluilevalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnserileserasnasn202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045lysphealaserglnserilethrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnser65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnglyasnsertrpprotyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>214<212>prt<213>人工序列<220><223>n/a<400>9gluilevalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnserileserasnasn202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045lysphealaserglnserilethrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnser65707580gluaspphe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