用于稳定无细胞核酸和细胞的方法和组合物与流程

本发明涉及用于稳定无细胞核酸、特别是无细胞的dna和/或rna的方法和组合物，以及替代地或另外地，用于稳定来自生物样品、特别是全血或血浆或尿液的细胞的方法和组合物，和该组合物作为用于生物样品中的无细胞核酸和/或细胞的稳定剂的用途。可例如通过血液采集管将组合物与无细胞样品或含细胞样品混合，在所述血液采集管中已经直接地抽入了全血并且在其中存在所述组合物，例如以高达血液采集管为其设定的血液的最大体积的20％存在。对于尿液作为生物样品，可将组合物放置在样品容器中或与注入在其中的样品混合，其中在各自的情况下优选的是，将组合物以预定的体积比添加或混合至样品或者添加或混合以达到预定的样品体积。

所述方法和组合物具有如下的优点：稳定生物样品中所含的无细胞核酸，特别是用于进一步分析，例如通过杂交、测序或扩增，任选地利用在先分离，例如通过吸附在用于核酸的吸附剂上并随后洗脱。无细胞核酸的稳定化特别地为无细胞核酸的数量和结构的保持，这也可称为其完整性。

所述组合物和方法优选地还具有如下的作用(效果)：稳定样品中所含细胞，例如防止自发裂解，从而一方面，细胞中所含的核酸不会被释放到采样样品中或者在较小程度上被释放到采样样品中，并且不与样品中的无细胞核酸混合，以及另一方面，细胞可从样品中分离，以能够在基本上不受裂解的干扰，并且例如不含无细胞核酸的情况下对细胞进行分析。在此，细胞可为样品的供体的细胞，即人体自身的细胞，例如上皮细胞和/或肿瘤细胞，并且细胞可为外来细胞，例如细菌、真菌或酵母或病毒。

从组合物与生物样品的混合物中分离出的细胞的分析可包括细胞内和/或表面结合的蛋白质的分析，例如通过免疫学分析。该组合物优选地导致表面结合的蛋白质在细胞上的稳定化。

现有技术

wo2013/123030a2描述了为稳定化全血以用于随后对无细胞dna的分析而混入释放甲醛的化合物，特别是重氮烷基脲或咪唑烷基脲，其中结合了用于除去游离的甲醛的清除剂，例如氨基酸、特别是甘氨酸、烷基胺、多胺，在各自的情况下结合了作为阻凝剂的edta。

umetani等人，clinicalchemistry52：6，1062-1069(2006)描述了通过定量pcr扩增alu重复序列的两个区段(其中115bp(alu115)的一个区段位于247bp(alu247)的另一区段之内)来分析血清中的无细胞dna的稳定性。扩增子(扩增产物)的量的比例形成dna质量的量度。

为1的alu247/alu115的pcr扩增子的商，即等量的alu247和alu115被认为是gdna的特征，因为这样的样品除了小模板之外还包含更长的模板。对于无细胞(cf)dna，hao,t.b.,shi,w.,shen,x.j.,qi,j.,wu,x.h.,wu,y.,tang,y.y.,ju,s.q.“circulatingcell-freednainserumasabiomarkerfordiagnosisandprognosticpredictionofcolorectalcancer”,britishjournalofcancer111,1482–1489(2014)给出的alu247/alu115商为约0.3。

为了稳定全血，wo2013/045458描述了用于稳定全血的以下的混合物：作为高渗添加剂(hypertonischenzusatz)的二羟基丙酮，作为细胞外核酸稳定剂的n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺或n,n-二乙基乙酰胺(n,n-diethylacetatmid)，作为阻凝剂的螯合剂，和细胞凋亡抑制剂、特别地为半胱天冬酶抑制剂。

wo2007/073397a1描述了一种用于治疗膀胱疾病的药物组合物，其具有在缓冲剂中的麻醉剂和阴离子多糖，其可包含六亚甲基四胺(对应于乌洛托品)作为抗菌剂。

技术问题

本发明的目的是提供用于稳定生物样品、特别是全血或尿液中的无细胞核酸例如dna或细胞以用于后续分析的替代组合物和替代方法，其中所述组合物优选地是储存稳定的，并且更优选具有比已知试剂更低数量的各种成分。

技术实现要素：

本发明通过权利要求的特征，特别是通过组合物用作稳定剂的用途以及用于稳定生物样品、特别是全血或尿液，特别是用于稳定无细胞核酸的含量和完整性和/或用于稳定细胞的含量和完整性的方法来实现所述目的。在水溶液中，该组合物具有以下或由以下组成：至少一种缓冲物质，其缓冲至ph值为7或以下、优选地3.5至7.0并且特别地被设定成将组合物和生物样品的混合物缓冲至此ph值；至少一种抗凝剂和/或至少一种螯合剂、特别是至少一种用于二价阳离子、优选地用于钙离子的螯合剂；和乌洛托品；任选地peg，所述组合物特别地用作用于全血的稳定剂。由于螯合剂、特别是edta也是抗凝剂，因此出于本发明的目的，可通过螯合剂形成抗凝剂。为了用作用于作为生物样品的尿液的稳定剂，该组合物可具有以下或由以下组成：缓冲物质和乌洛托品，作为干燥的混合物，例如以粉末的形式，或者优选地以水溶液形式，任选地具有至少一种抗凝剂和/或螯合剂。通常，生物样品优选地为动物或人的组织或体液的样品。

所述至少一种缓冲物质可选自以下或由以下组成：柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、mes(2-n-吗啉代乙醇磺酸)、pipes(哌嗪-n,n′-双-2-乙醇磺酸)、mops(3-n-吗啉代丙烷磺酸)、磷酸盐缓冲剂和其中至少两种的混合物。至少一种抗凝剂可为例如水蛭素，任选地以与螯合剂混合的形式。抗凝剂优选地为螯合剂，其例如可选自以下或由以下组成：柠檬酸盐和edta及其混合物。

例如，当组合物包含柠檬酸盐时，可不向该组合物添加作为用于游离的或溶解在水中的甲醛的清除剂的化合物，该组合物特别地可以没有甘氨酸和/或没有另外的螯合剂，特别地没有edta(乙二胺四乙酸盐)。该组合物特别优选地由柠檬酸盐缓冲剂和乌洛托品在水中的溶液组成。为了用作用于无细胞核酸和/或用于尿液中的细胞的稳定剂，或在用于稳定无细胞核酸和/或尿液中细胞的方法中使用，组合物可由柠檬酸盐缓冲剂和乌洛托品，任选地连同抗凝剂和/或螯合剂，以干燥的混合物的形式组成，其中柠檬酸盐缓冲剂被设成，在样品中缓冲至ph值为7或以下、优选地3.5-7.0，特别是对于预定的样品体积。

缓冲物质优选地具有柠檬酸盐缓冲溶液的缓冲容量，其具有在0.3至1m、优选地0.4至0.7m的范围内，例如0.5m的浓度，和在3.5至7、优选地4至6.5的范围内，对于全血作为样本的情况，例如ph4至4.5，通常更优选地4.5或4.2的ph值，并且例如被设定成，将生物样品和组合物的混合物缓冲至此ph。在缓冲溶液中，乌洛托品(六亚甲基四胺)的含量优选地在1至30重量/体积％的范围内、优选地在2或5至25重量/体积％或至20重量/体积％的范围内，例如5至19或至8重量/体积％。优选地，缓冲物质是浓度在0.3至1m、优选地0.4至0.7m的范围内，例如为0.5m的柠檬酸盐缓冲溶液，并且具有在3.5至7的范围内的ph值、优选地ph4至6.0，对于全血作为样本的情况，例如ph4至4.5，通常更优选地4.5或4.2的ph值，并且优选地被设定成，将生物样品和组合物的混合物缓冲至此ph。

已经表明，即使不包含edta，柠檬酸盐缓冲剂也充分抑制全血的凝结。因此，至少一种缓冲物质和至少一种螯合剂可由柠檬酸盐缓冲剂形成。

优选地，特别是对于全血作为生物样品，根据本发明的组合物如下制备：通过在水中制备缓冲剂(其优选地为柠檬酸盐缓冲剂)、调节ph值、然后添加并溶解乌洛托品。缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲剂或乙酸盐缓冲剂优选地如下制备：通过混合缓冲物质(其为例如柠檬酸或乙酸)在水中的溶液与缓冲物质的盐例如柠檬酸三钠或乙酸钠在水中的溶液，在各自的情况下以所需的缓冲剂的浓度。

作为替代，将酸和酸的盐按一定比例干混，以便在添加液体时调整(设定)所需的ph值。

根据本发明的组合物适合用作用于生物样品、特别是全血或尿液，特别是用于生物样品中包含的无细胞核酸、dna和/或rna的稳定剂，随后分离无细胞级分(部分)，例如无细胞血浆或细胞。特别地，可由无细胞级分分析无细胞核酸。在此，已经显示，该组合物适合于在生物样品、特别是全血中稳定无细胞核酸、特别是无细胞dna或无细胞rna的数量和结构，并且基本上防止这些核酸的数量或结构的改变，使得基本上不会因组合物而引起这些核酸的数量或结构发生会干扰核酸的后续分析的变化。核酸的后续分析可例如通过杂交、测序或扩增，例如pcr完成。

任选的peg含量，例如peg6000至peg20000中的一种或混合物可抵消溶血作用。特别地，组合物在如下情形中不包含peg：其用于无细胞核酸的后续分析，优选地利用通过吸附在核酸的吸附剂上来分离核酸。

已经与根据本发明的组合物混合的生物样品的细胞的特征在于，其核酸、特别是dna和rna的含量基本上保持不变，并且不影响无细胞级分的核酸的含量。

根据本发明的组合物具有如下的优点：其在0至30℃、更优选地在5至20℃下例如储存稳定持续至少一个月、更优选地至少两个月，例如最长达八个月或最长达六个月，以实现稳定作用。另外，如果组合物被容纳在血液采集管中并且被提供在其中用于待抽入的血液，或者组合物被容纳在尿液样品容器中并被提供在其中用于待注入的尿液，则该组合物也是储存稳定。因此，本发明还涉及一种血液采集管及其用于稳定作为全血样品的生物样品的无细胞核酸和/或细胞的用途，其中将所述组合物容纳在血液采集管中。因此，本发明还涉及尿液样品容器及其用于稳定作为尿液样品的生物样品的无细胞核酸和/或细胞的用途，其中将所述组合物容纳在尿液样品容器中。

已经表明，不含用于游离的或溶解在水中的甲醛的清除剂化合物并且不含另外的阻凝剂例如edta的组合物适用于稳定核酸和/或细胞。目前，将组合物的储存稳定性及其对生物样品的稳定作用归因于以下事实：乌洛托品在组合物中以及在含有样品的混合物中与游离的甲醛处于平衡状态，其浓度足以使蛋白质稳定或失活。

优选地，所述组合物被容纳在血液采集管中，例如以占可被抽入血液采集管中或者血液采集管被最大程度地配置的全血体积的最多20％、至少2％、优选地5至15％、特别是8至12％，例如达10％的体积含量。优选地，所述组合物被容纳在尿液样品容器中，例如以占可被注入到尿液样品容器中或者尿液样品容器被最大程度地配置的尿液体积的最多20％、至少2％、优选地5至15％、特别是8至12％，例如达10％的体积含量。

用于稳定生物样品、特别是全血的生物样品的方法，具有以下步骤：

-使样品与组合物接触以产生样品和组合物的混合物，优选地以至多20％、优选地5至15％、特别是8至12％的组合物(其优选地在水溶液中)相对于样品的体积比例，

-任选地将样品和组合物的混合物在0℃以上，例如在0至37℃下，例如在0至30℃下，更优选地在5至20℃下或在22.5℃下储存1小时至14天，优选地5小时至5天或至3天或至2天，

-任选地，随后将混合物分离成含细胞级分和无细胞级分，

-优选地，在分离混合物之后向产生的无细胞级分添加蛋白酶，例如蛋白酶k，和

-由其无细胞级分分析混合物的核酸和/或由含细胞级分分析细胞。

用于稳定和分析生物样品的无细胞核酸的方法具有例如如下的步骤或由如下的步骤组成：使样品与用作用于样品中包含的无细胞核酸的稳定剂的组合物接触，以制备样品和组合物的混合物，并将样品和组合物的混合物在0至30℃下储存至少1小时至14天，优选地随后将混合物分离成含细胞级分和无细胞级分，优选地在分离混合物之后向产生的无细胞级分添加蛋白酶，例如蛋白酶k，和由其无细胞级分分析混合物的核酸和/或由含细胞级分分析细胞。

混合物的分析任选地包括核酸的分离，优选地通过与用于核酸的吸附剂接触，然后洗涤吸附剂并从吸附剂洗脱结合的核酸。适当的吸附剂例如离子交换材料例如包含在macherey-nagel(nucleosnapdnaplasma)或qiagen(qiaampcirculatingnucleicacidkit)的dna分离试剂盒中。

将混合物分离成含细胞和无细胞的级分通常可例如通过过滤或离心和/或通过吸附来进行。

通常，特别是对于尿作为样品，该方法，特别是对于无细胞级分，可包括至少一个富集游离核酸的步骤，例如核酸的沉淀和/或核酸在吸附材料如顺磁性颗粒上的吸附，所述顺磁性颗粒涂覆有吸附剂。

含细胞级分的分析可任选地包括从含细胞级分中富集细胞，例如将细胞吸附到吸附材料如顺磁性颗粒上，所述顺磁性颗粒涂覆有吸附剂如抗体。

任选地，可将含细胞级分、即从生物样品与组合物的混合物中与无细胞级分分离的含细胞级分在如本文所述作为稳定剂的水性(含水)组合物中悬浮和溶解(aufgeschlossen)。

现在将参考附图通过实施例更详细地描述本发明。附图示出了：

-图1在不同储存时间后样品中的无细胞dna的pcr扩增结果，和

-图2两个dna区段在不同储存时间后的作为扩增产物浓度的商的pcr扩增结果。

实施例1：全血的无细胞dna的分离和分析

通过将在水中的0.5m柠檬酸(一水合物)和在水中的0.5m柠檬酸三钠(二水合物)混合直到达到ph4.2，然后添加并溶解18重量/体积％的乌洛托品来制备组合物。

作为生物样品的实例，将3个供体的4.9ml全血分别抽入到4个相同的血液采集管中，其含有0.49ml组合物(占全血的10体积％)。从这些包含全血和组合物的混合物并在22.5℃下储存的血液采集管中，分别在第0天(t0)、第3天(t3)、第7天(t7)和第14天(t14)对其中一只进行处理并从其中分离和分析无细胞dna。为此，通过两阶段离心过程(10分钟，2,000xg；15分钟，15,000xg)从每个血液采集管中产生无细胞级分。

使用nucleosnapdna血浆试剂盒(可从macherey-nagel获得)，从由此产生的包含用于稳定的组合物的无细胞血浆中分离出无细胞dna。与试剂盒的说明书不同，使用1.7ml而不是3.0ml无细胞血浆，并且裂解缓冲液vl和乙醇也从3ml降低至1.7ml。此外，在室温和56℃下用蛋白酶k将无细胞血浆的孵育时间分别从5分钟延长至15分钟。

如umetani等人(2006)所述，通过使用定量pcr扩增115bp区段alu115和247bp区段alu247来分析无细胞dna。

图1示出了等分试样在第0天(t0)、第3天(t3＝tx)、第7天(t7＝tx)和第14天(t14＝tx)所示时间点的alu115浓度与在第0天(t0)的alu115的浓度的商的平均值。在此，商(tx/t0)为1表示混合物中的无细胞dna的浓度保持不变或稳定，并且混合物中的无细胞dna可通过pcr不变地扩增。该结果表明，全血和组合物的混合物中的无细胞dna在22.5℃下在至少14天的储存期内在浓度和结构方面稳定地用于随后的分析。

图2示出了在25℃下在所示的存储时间点(对于本发明的组合物(cfdnaexact)在第0天(0)、第3天(3)、第7天(7)、第10天(10)和第14天(14)以及对于edta样品(edta)在第0天(0)和第7天(7))以alu247和alu115为例的无细胞dna(cfdna)的绝对量的商。结果表明了稳定化，其依据是通过根据本发明的组合物(exact)实现的在孵育时间内为常数的商。在未稳定化的edta抗凝样品中，alu247/alu115商随储存时间的增加而增加。血液样品/生物样品的不充分稳定化导致细胞裂解，从而导致基因组dna(gdna)的释放。为1的alu247/alu115商，即等量的alu247和alu115是gdna的特征。

这些结果还表明，该组合物适合于随后从该组合物与血浆的无细胞混合物中分离无细胞核酸，其中利用了所述核酸在吸附剂上的吸附，或者不损害这种分离。

实施例2：全血的细胞的分离和分析

根据实施例1，制备组合物和全血的混合物，并在22.5℃下储存。代替根据本发明的组合物，第二全血样品包含生理盐水和edta(1.6mg/ml血液)以防止凝结。在第0天、第1天、第3天和第5天，分别对5.0ml的两种类型的全血样品进行红细胞裂解，并使用miltenyibiotech公司的cec富集和计数试剂盒富集和分析循环内皮细胞(cec)，对于健康的人，循环内皮细胞的数量为约1-20个细胞/ml。对于不同的疾病，cec的数量有时会大大增加。稳定的制剂必须确保储存的血样中的cec的数量稳定。在针对试剂盒描述的分析之后，发现仅在根据本发明稳定化的样品中，检测到的cec数在整个存储时间内保持恒定。

实施例3：尿的无细胞dna的分离和分析

通过将在水中的0.5m柠檬酸(一水合物)和在水中的0.5m柠檬酸三钠(二水合物)混合直至达到ph4.2，然后添加并溶解15重量/体积％的乌洛托品来制备组合物。

作为生物样品的实例，在取样后立即将90ml尿液与1/10体积的组合物混合。从在22.5℃下储存的该混合物中，分别在第0天、第3天、第7天和第14天对等分试样进行处理并由其分离和分析无细胞dna。为此目的，通过在15000xg下离心15分钟并分离无细胞级分，分别由等分试样产生无细胞级分。使用nucleosnapdna血浆试剂盒(可从macherey-nagel获得)，从由此产生的包含用于稳定化的组合物的无细胞级分中分离出无细胞dna。

与未经处理或添加等体积的生理盐水或仅添加溶解的缓冲物质并以相同方式储存的尿液样品相比，发现无细胞dna被该组合物稳定化。

实施例4：尿中的经稳定化的细胞的分析

根据实施例3，将前列腺癌细胞(lncap)添加至尿液中并与所述组合物混合和储存以进行稳定化或与生理盐水混合和储存以进行比较。

在相同的对比样品储存时间后对通过离心沉淀的细胞进行分析。发现仅根据本发明的组合物允许对添加的细胞进行流式细胞术检测。

与未经处理或添加等体积的生理盐水或仅添加溶解的缓冲物质并以相同的方式储存的尿液样品相比，发现该组合物在储存过程中稳定了细胞的表面标记物。