抗硫酸化糖胺聚糖抗体的制作方法

本发明涉及与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体。本发明的抗体具有细胞增殖抑制活性，可用作细胞增殖抑制剂、用于药物递送的靶向化试剂和癌症的检测药。

背景技术：

已知糖胺聚糖是具有氨基糖和糖醛酸或半乳糖的二糖重复单元的长链多糖，存在于动物体内的各种组织中。糖胺聚糖根据构成糖的种类、硫酸基的有无/程度和部位、构成糖的结合方式等进行分类，作为主要类别，已知有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素。硫酸乙酰肝素糖胺聚糖是由各种程度地添加了硫酸基的二糖的重复结构构成的多糖类，典型的是，作为与称作核心蛋白的蛋白结合而成的蛋白聚糖而存在(非专利文献1)。肝素也与核心蛋白结合形成蛋白聚糖，具有与硫酸乙酰肝素相比硫酸化的程度高的特征(非专利文献2)。

在非专利文献3中，对糖胺聚糖的存在与肿瘤的相关性进行了概述，记载了糖胺聚糖能够成为针对肿瘤的治疗靶。另外，还公开了与硫酸软骨素结合的疟疾来源肽与白喉毒素的缀合物会抑制体内的肿瘤细胞的增殖(非专利文献4)。

另一方面，胃癌是世界上出现频率最高的恶性肿瘤之一，其中已知在弥漫性胃癌(diffuse-typegastriccarcinoma,dgc)中存在预后非常差的亚型(例如非专利文献5)。作为胃癌的治疗，除了包括内窥镜下的切除在内的手术以外，还进行抗癌药、或根据情况并用曲妥珠单抗的化学疗法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：sasisekharanr等人,natrevcancer2002jul;2(7):521-8；

非专利文献2：mulloy等人,pharmacolreview68,76-141,january2016；

非专利文献3：yip等人,molcancerther2006;5(9)2139-2148；

非专利文献4：salanti等人,cancercell28,500-514,october12,2015；

非专利文献5：koriyama等人,worldjcastroenterol2007,13,3925-3931。

技术实现要素：

发明所要解决的课题

在癌中特异性表达的分子明确的情况下，存在着能够将以其分子为靶的免疫疗法作为治疗选项的可能性。免疫疗法因其特异性，与使用普通的抗癌药的化学疗法相比不易产生有害的副作用，能够成为有希望的治疗方法。

然而，已知弥漫性胃癌的体细胞突变频率低，另外，一些报道的靶向突变蛋白的治疗策略尚未奏效。而且，即使是近年来备受关注的免疫检查点抑制剂，其有效性目前尚未明确。因此，需要一种对包括弥漫性胃癌在内的胃癌有效的、基于抗肿瘤免疫的新型治疗方法。

在上述的现有技术文献中，公开了糖胺聚糖与肿瘤的相关性和使用与糖胺聚糖结合的肽进行癌症治疗的可能性。然而，关于能够成为抗体药物的具体的单克隆抗体既没有教导也没有暗示。

用于解决课题的手段

本发明人在人的弥漫性胃癌病例中对浸润于肿瘤内的免疫细胞的特征进行各种研究时，确认到特定的b细胞克隆组的增殖，并且针对该克隆组获取了编码所产生的抗体分子的基因序列信息。根据所得的信息重构抗体分子，探索该抗体所识别的抗原，结果令人惊讶的是，判明了抗原不是蛋白、而是作为多糖的硫酸化糖胺聚糖。本发明人进一步确认到：该抗体对胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等各种人细胞株呈现出增殖抑制效果。发现本发明的抗硫酸化糖胺聚糖抗体在效应细胞和补体的不存在下也具有细胞增殖抑制活性，即使单独使用也对肿瘤的治疗有效，与抗癌药等其他药物组合，还可用作用于药物递送的靶向化试剂。

本发明是根据这些见解而进行的发明，提供以下的1～12。

1.抗体，该抗体与硫酸化糖胺聚糖结合，具有细胞增殖抑制活性。

2.上述1所述的抗体，其中，硫酸化糖胺聚糖为硫酸乙酰肝素糖胺聚糖或肝素。

3.上述1所述的抗体，其中，硫酸化糖胺聚糖为肝素。

4.上述1～3中任一项所述的抗体，该抗体在效应细胞和补体的不存在下具有细胞增殖抑制活性。

5.抗体，其与硫酸化糖胺聚糖结合，选自以下(1)～(10)的任一种：

(1)抗体，该抗体具有包含由seqidno:13所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:14所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:15所示的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；

(2)抗体，该抗体具有包含由seqidno:16所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:17所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:18所示的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区；

(3)抗体，该抗体具有包含由seqidno:19所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:20所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:21所示的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；

(4)抗体，该抗体具有包含由seqidno:22所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:23所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:24所示的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有：具有seqidno:1或4所示的氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno:2或6所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有：具有seqidno:7或10所示的氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno:8或12所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(7)抗体，该抗体具有：由相对于seqidno:1具有90%以上的序列同源性的氨基酸序列构成的重链可变区和由相对于seqidno:2具有90%以上的序列同源性的氨基酸序列构成的轻链可变区；

(8)抗体，该抗体具有：由相对于seqidno:7具有90%以上的序列同源性的氨基酸序列构成的重链可变区和由相对于seqidno:8具有90%以上的序列同源性的氨基酸序列构成的轻链可变区；

(9)抗体，该抗体具有：由上述(1)～(6)的抗体中的重链可变区和/或轻链可变区的1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加而得到的氨基酸序列构成的重链和/或轻链；以及

(10)上述(9)的抗体，该抗体具有选自下述的1个以上的取代：seqidno:1所示的氨基酸序列中的第51位的氨基酸asp取代成asn、第56位的氨基酸ala取代成gly、以及第66位的氨基酸ile取代成thr。

6.细胞增殖抑制剂，其含有上述1～5中任一项所述的抗体作为有效成分。

7.上述6所述的细胞增殖抑制剂，其与具有细胞毒性的药物组合使用。

8.上述6或7所述的细胞增殖抑制剂，其用于抑制癌细胞的增殖。

9.上述8所述的细胞增殖抑制剂，其中，癌细胞为胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌和/或胸膜恶性肿瘤中的癌细胞。

10.用于药物递送的靶向化试剂，其包含上述1～5中任一项所述的抗体。

11.药物组合物，其含有上述6～9中任一项所述的细胞增殖抑制剂或上述10所述的靶向化试剂作为有效成分。

12.癌症的检测药，该检测药包含上述1～5中任一项所述的抗体。

13.上述12所述的检测药，该检测药用于检测选自胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌和胸膜恶性肿瘤的癌症。

14.受试体的癌症的治疗方法，该治疗方法包括：对受试体给予上述6～9中任一项所述的细胞增殖抑制剂、上述10所述的靶向化试剂或上述11所述的药物组合物。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2017-120435号的公开内容。

发明效果

通过本发明，提供一种新型抗体，该抗体能够与人的癌组织中存在的硫酸化糖胺聚糖结合而抑制其细胞增殖，同时还能够用于向细胞内进行药物递送。

附图说明

[图1a]显示在人胃癌病例中编码肿瘤组织中显性(优势)存在的抗体的重链(igg)的基因的v-j组合的相对频率分布。箭头所示的峰对应于gpat#2的重链基因序列。

[图1b]显示在人胃癌病例中编码肿瘤组织中显性存在的抗体的轻链(igκ)的基因的v-j组合的相对频率分布。箭头所示的峰对应于gpat#2的轻链基因序列。

[图2a]显示cy5标记的gpat#1抗体与硫酸乙酰肝素糖胺聚糖结合。heparin(肝素)、de2shep(2-o-脱硫酸化肝素)、de6shep(6-o-脱硫酸化肝素)、denshep(n-脱硫酸化肝素)和dens/achep(n-脱硫酸化/乙酰化肝素)。

[图2b]显示cy5标记的gpat#1抗体和gpat#2抗体与n-聚糖(m9、na2、a2、na2f、na3、a3和na4)、o-聚糖(stn和t)、gag(肝素、de2shep、de6shep、denshep和dens/achep)、lewis抗原(lea、lex、slea和slex)、lac(lac、3sl、6sl、3slnac、6slnac、lnt和lnnt)和abo抗原(a、b和o)的结合。上图和下图是改变显示cy5信号值的纵轴的数值来显示相同实验的结果的图。图中显示肝素、de2shep、de6shep、denshep和dens/achep的主要重复单元的结构。

[图2c]通过fitc荧光信号的聚集显示与蛋白-g磁珠结合的gpat#1抗体和gpat#2抗体与fitc-缀合肝素结合。

[图3a]显示将fitc标记的本发明的抗体添加在胃癌细胞株nugc3和katoiii、胰腺癌细胞株panc1、肝癌细胞株huh7、肺癌细胞株nci-h2170的培养基中进行培养后、在流式细胞仪中的fitc信号。

[图3b]显示fitc标记的本发明的gpat#1抗体和gpat#2抗体摄入到katoiii和nugc3细胞内。

[图4a]显示在胃癌细胞株katoiii、nugc3、hgc27和mkn1中使用了gpat#1抗体和gpat#2抗体的mtt测定的结果。结果是以平均值(平均)和标准偏差显示独立的4次实验的结果，星号显示p<0.05。

[图4b]显示在胰腺癌细胞株(panc1、aspc1和capan1)、大肠癌细胞株(sw480、sw620和hct116)、肝癌细胞株(hepg2、huh7、alex和hlf)、以及肺癌和胸膜恶性肿瘤(hci-h2170、a549和nci-h28)中使用了gpat#1抗体和gpat#2抗体的mtt测定的结果。结果是以平均值和标准偏差显示独立的4次实验的结果，星号显示p<0.05。

[图4c]显示在胃癌细胞株nugc3中在肝素的非存在下(肝素(-))或存在下(肝素(+)：60μg/ml；肝素(++)：100μg/ml)实施的mtt测定的结果。结果是以平均值和标准偏差显示4次实验的结果，星号显示p<0.05。

[图5]显示在胃癌细胞株katoiii和nugc3中并用本发明的抗体和缀合有抗癌药的二次抗体的情况下的细胞增殖抑制效果。

[图6a]是将根据gpat#1抗体的氨基酸序列(seqidno:1)修饰的5种抗体(gpat#1修饰1～gpat#1修饰5)的重链的氨基酸序列(seqidno:27～31)与seqidno:1的序列进行比较而显示。将各自的cdr1～cdr3用粗体字和四方形围起来显示，在修饰1～修饰5的序列中与seqidno:1不同的氨基酸残基显示有下划线。序列之下所示的数字对应于seqidno:1和27～31中的氨基酸的位置。

[图6b]是将使用了gpat#1修饰1～修饰5的mtt测定的结果与对照igg、gpat#1种系序列和gpat#1抗体进行比较而显示。结果是以平均值和标准偏差显示独立的4次实验的结果，对与gpat#1抗体相比细胞增殖抑制效果显著(p<0.05)上升的抗体标注星号。“gpat#1种系序列”抗体是指由在构成gpat#1抗体的v区中不存在体细胞超突变(somatichypermutation)的情况下的胚细胞基因序列的氨基酸序列(imgt数据库：由http://www.imgt.org/获取ighv3-9*01序列)规定的抗体。

具体实施方式

本发明提供与硫酸化糖胺聚糖结合、且具有细胞增殖抑制活性的抗体。

＜硫酸化糖胺聚糖＞

糖胺聚糖是具有氨基糖和糖醛酸或半乳糖的二糖单元的重复结构的长链多糖，作为天然存在的糖胺聚糖，已知有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素。

透明质酸具有由d-葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸构成的二糖单元的重复结构，硫酸软骨素具有由d-半乳糖胺和d-葡萄糖醛酸构成的二糖单元的重复结构，硫酸皮肤素具有由d-半乳糖胺和l-艾杜糖醛酸构成的二糖单元的重复结构，硫酸角质素具有由d-葡萄糖胺和d-半乳糖构成的二糖单元的重复结构，硫酸乙酰肝素和肝素具有由作为氨基糖的d-葡萄糖胺、作为糖醛酸的l-艾杜糖醛酸或d-葡萄糖醛酸构成的二糖单元的重复结构。在本说明书中，糖胺聚糖的氨基糖、即d-葡萄糖胺或d-半乳糖胺的氨基可被乙酰化也可以未被乙酰化，另外糖胺聚糖可被硫酸化也可以未被硫酸化。

糖胺聚糖的分子量为3,000～30,000的范围，在生物体内的各种组织中例如与细胞表面上表达的蛋白结合作为蛋白聚糖而存在，但关于糖胺聚糖在生物体内的功能尚有许多不明之处。

本说明书中记载的“硫酸化糖胺聚糖”是指每个二糖单元具有1～4个硫酸基的糖胺聚糖。硫酸基是指导入so3^-以代替氨基糖和/或糖醛酸和/或半乳糖上的羟基或氨基的氢而得到的基团。

因此，天然不具有硫酸基的透明质酸不包括在硫酸化糖胺聚糖中。然而，在本说明书中，硫酸化糖胺聚糖不仅包括天然的硫酸化糖胺聚糖，还包括人为导入了硫酸基的糖胺聚糖，例如包括在天然的透明质酸或合成的糖胺聚糖中平均每个二糖单元包含1个以上的硫酸基的硫酸化糖胺聚糖。

这里，关于“平均每个二糖单元”的记载，可以用于意指，在具有二糖单元的重复结构的糖胺聚糖中，用整个糖胺聚糖分子中的硫酸基数除以二糖单元数而得到的数值。因此，例如“平均每个二糖单元为3个以上”意指，在用整个糖胺聚糖分子中的硫酸基数除以二糖单元数的情况下，每个二糖单元包含2.5～3.4个硫酸基。

然而，由于抗体所识别的表位位点在糖胺聚糖之中是更受限定的部分结构，因此在糖胺聚糖的一部分区域每个二糖单元的硫酸基的平均数可以是上述范围。

＜硫酸乙酰肝素糖胺聚糖＞

上述的硫酸化糖胺聚糖包括硫酸乙酰肝素糖胺聚糖。作为本说明书中记载的“硫酸乙酰肝素糖胺聚糖”，包括低分子量的被用作抗凝血剂的肝素、结构与肝素类似的狭义的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的任一种。

＜抗硫酸化糖胺聚糖抗体＞

本发明的抗体能够特异性地识别并结合硫酸化糖胺聚糖。例如，本发明的抗体与平均每个二糖单元具有1个以上的硫酸基的糖胺聚糖结合，而不与不具有硫酸基的糖胺聚糖结合。另外，本发明的抗体与平均每个二糖单元具有2个以上的硫酸基的糖胺聚糖结合，而不与平均具有1个以下的硫酸基的糖胺聚糖结合。或者，本发明的抗体与平均每个二糖单元具有3个以上的硫酸基的糖胺聚糖结合，而不与平均具有2个以下的硫酸基的糖胺聚糖结合。

换言之，本发明的抗体所结合的硫酸化糖胺聚糖的平均每个二糖单元具有1个以上、2个以上或3个以上的硫酸基。

作为本发明的抗体的例子，可以列举：与平均每个二糖单元具有3个硫酸基的肝素和平均每个二糖单元具有2个硫酸基的脱硫酸化肝素(2-o-脱硫酸化肝素、6-o-脱硫酸化肝素、n-脱硫酸化肝素和/或n-脱硫酸化/乙酰化肝素)结合、特别是对肝素的结合亲和性高的抗体。作为本发明中特别适合的抗体的例子，可以列举：特异性地识别并结合肝素的抗体。

另外，本发明的抗体与包括肝素的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖结合，而不与下述物质结合：m9、na2、a2、na2f、na3、a3和na4等n-聚糖；stn和t等o-聚糖；lea、lex、slea和slex等lewis抗原；lac、3sl、6sl、3slnac、6slnac、lnt和lnnt等lac；以及a、b和o等abo抗原。因此，作为本发明的抗体的一个例子，可以列举：能够识别作为硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的特征性结构的上述的重复结构或由该重复结构形成的三维结构的抗体。

关于抗体与硫酸化糖胺聚糖是否结合，例如在本领域通常使用的条件下，例如与用荧光标记等标记的抗体接触，检测来自标记的信号，从而可以确认与天然的硫酸化糖胺聚糖的结合。例如，如后面的实施例所示，关于结合强度，可以使cy5荧光标记的抗体与有可能作为抗原的物质接触，之后以荧光强度或s/n比的形式获得与物质结合的抗体量的信息。或者，使天然的硫酸化糖胺聚糖与本发明的抗体、进一步与可识别本发明的抗体的标记化二次抗体接触，通过检测来自标记化二次抗体的信号即可确认。另外，使用修饰或合成的分子量为3,000～30,000范围的硫酸化糖胺聚糖代替天然的硫酸化糖胺聚糖作为抗原，本发明的抗体也可以是能够与其结合的抗体。

尚需说明的是，在本说明书中，对“结合”和“特异性地结合”没有特别限定，可以是指下述的结合：抗原与抗体的结合具有10^-8m以下、优选10^-9m以下、更优选10^-10m以下的kd值的结合亲和性。因此，本发明的抗体的特征在于：对硫酸化糖胺聚糖具有上述的结合亲和性，而对其他糖类和包括蛋白在内的其他抗原不具有上述的结合亲和性。

或者，在本说明书中，“与靶物质特异性地结合”可以是指下述的情形：与靶物质、例如硫酸化糖胺聚糖、硫酸乙酰肝素糖胺聚糖或肝素的结合，例如使用过量的靶物质、且通过普通的结合测定进行检测，和与靶物质以外的物质的结合相比，为2倍以上、3倍以上、4倍以上。另外，还可以是指下述的情形：在如上所述通过荧光标记检测结合的情况下，s/n比为2以上、3以上、4以上。

本发明的抗体经由与硫酸化糖胺聚糖的结合来抑制具有硫酸化糖胺聚糖的细胞的增殖。该活性可以在效应细胞和补体的不存在下进行检测，因此，能够与抗体依赖性细胞毒活性(adcc)和补体依赖性细胞毒活性(cdc)区分开。然而，在使用本发明的抗体作为细胞增殖抑制剂和用于药物递送的靶向化试剂的情况下，应理解为可以存在效应细胞和补体。如本领域所理解的那样，已知抗体的fc区具有效应子功能，可以带来补体的活化和效应细胞的活化。补体若活化，则能够使结合有可变区的细胞溶解。“效应细胞”是指杀伤t细胞、辅助性t细胞、天然杀伤细胞、巨噬細胞等，其表面上存在的fc受体与抗体的fc区结合而被活化，能够发挥细胞毒活性。

本发明的抗体的细胞增殖抑制活性例如可以在与目标细胞一同培养后通过mtt测定等来测定。虽然没有限定，但例如在相对于1.0×10³～1.0×10⁴个细胞、例如癌细胞使用1.0～4.0μg的抗体的情况下，可以抑制10%以上、20%以上或30%以上的细胞增殖。

本发明的抗体只要是与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体即可，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但优选为单克隆抗体。另外，本发明的抗体可以是小鼠、兔、山羊等的非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体的任一种，在用于治疗人的癌症等疾病的情况下没有特别限定，但优选为人源化抗体或人抗体。因此，本发明中可适合使用的抗体可以是包含人抗体的构架区(fr)和对于硫酸化糖胺聚糖能够带来高的结合亲和性的互补性决定区(cdr)的抗体。

本发明的抗体可以使用被特定为抗原的硫酸化糖胺聚糖对非人哺乳动物进行免疫，再通过已知的方法以多克隆抗体或单克隆抗体的形式获取。本发明的抗体还可以根据活性得到证实的本发明的抗体的氨基酸序列信息或编码该抗体的多核苷酸的核苷酸序列信息，采用基因工程学方法、或者采用化学合成方法通过合成而获取。

在通过基因工程学方法制作抗体的情况下，将编码重链和轻链的多核苷酸导入到适当的宿主细胞中使其表达，可以作为重组蛋白来获得。这种情况下，多核苷酸可以是dna也可以是rna，另外，向宿主细胞中导入多核苷酸的手段可以适当利用本领域所采用的手段。作为用于将多核苷酸导入到宿主细胞中的载体，可以适当使用病毒载体、质粒载体、噬菌体载体等。作为宿主细胞，例如可以利用大肠杆菌等细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。这里，编码重链和轻链的多核苷酸可以导入到分开的载体中，也可以与同一载体连接而导入。

例如，如下述实施例所记载，将编码本发明抗体的重链和轻链的cdna根据情况整合到包含信号序列、polya序列、同时还包含启动子序列等调控序列、选择标志物的载体中，再导入到适当的宿主细胞中进行培养，从而可以将能够特异性地识别硫酸化糖胺聚糖的抗体以重组蛋白的形式获取。

在使用本发明的抗体作为单克隆抗体的情况下，抗体可以是igg抗体分子、或其抗原结合性片段和抗原结合性衍生物。例如，抗体可以是完全抗体、fab、fab’、f(ab’)2片段、以及用接头连接重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)而得到的单链抗体(scfv)片段、scfv-fc、sc(fv)2、fv、双抗体等。

scfv、scfv-fc和sc(fv)2是用接头连接可变区而得到的合成多肽。作为接头，只要是本领域通常使用的接头，则可以是任意一种，没有特别限定，例如可适合使用由5～25个、优选10～20个氨基酸残基构成的肽接头、例如gs接头等。

本发明的抗体在不影响抗原结合性的范围内还包括本领域技术人员所能理解的衍生物、例如施行了用于使抗体纯化容易进行或者用于提高稳定性的修饰的衍生物、以及与抗癌药等药物结合而成的复合物。在本说明书中，只要文章条理上不矛盾，则为了方便起见意指将保持与硫酸化糖胺聚糖的结合性的片段和衍生物包含在“抗体”中。

本发明的抗体还能够以二聚体、三聚体、四聚体等多聚体的形式合成。而且，本发明的抗体可以是具有与硫酸化糖胺聚糖结合的第1特异性和与其他抗原结合的第2特异性的双特异性抗体。第2特异性例如可以是针对靶细胞所能表达的其他抗原的特异性，也可以是针对抗癌药等药物的特异性，可以根据目的而适当选择。在第2特异性为针对靶细胞、例如癌细胞所能表达的其他抗原的特异性的情况下，通过使用双特异性抗体，可更具特异性地向靶细胞进行药物递送。另外，在第2特异性为针对抗癌药等药物的特异性的情况下，可将药物和双特异性抗体一起作为复合物递送到靶位点。

如果是本领域技术人员，则根据本说明书的记载和本领域中的技术常识，能够以适合用途的适当形式获取本发明的抗体。

虽然没有特别限定，但作为本发明的与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体的例子，可以列举与肝素结合的以下的抗体。

(1)抗体，该抗体具有包含由seqidno:13所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:14所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:15所示的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；

(2)抗体，该抗体具有包含由seqidno:16所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:17所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:18所示的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区；

(3)抗体，该抗体具有包含由seqidno:19所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:20所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:21所示的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；

(4)抗体，该抗体具有包含由seqidno:22所示的氨基酸序列构成的cdr1、由seqidno:23所示的氨基酸序列构成的cdr2和由seqidno:24所示的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区。

另外，作为本发明的与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体，可以列举与肝素结合的以下的抗体：

(5)抗体，该抗体具有：具有seqidno:1或4所示的氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno:2或6所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有：具有seqidno:7或10所示的氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno:8或12所示的氨基酸序列的轻链可变区。

另外，作为本发明的与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体，可以列举与肝素结合的以下的抗体：

(7)抗体，该抗体具有：由相对于seqidno:1具有90%以上、例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的氨基酸序列构成的重链可变区；以及由相对于seqidno:2具有90%以上、例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的氨基酸序列构成的轻链可变区；

(8)抗体，该抗体具有：由相对于seqidno:7具有90%以上、例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的氨基酸序列构成的重链可变区；以及由相对于seqidno:8具有90%以上、例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的氨基酸序列构成的轻链可变区。

另外，作为本发明的与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体，可以列举与肝素结合的以下的抗体：

(9)抗体，该抗体具有：由上述(1)～(6)的抗体中的重链可变区和/或轻链可变区的1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加而得到的氨基酸序列构成的重链和/或轻链。

这里，“多个”可以是5个以下、例如1个、2个、3个、4个或5个。因此，本发明的抗体在上述(1)～(6)的抗体中的重链可变区和/或轻链可变区可以分别具有5个以下的氨基酸的修饰。与某抗体在功能上同等的抗体的调制例如可以通过位点特异性诱变法等本领域周知的方法进行。

抗体的结合特性基本是由重链和轻链的cdr来确定。因此，从对结合特性的影响少的角度考虑，修饰优选位于构架区或恒定区内。对取代没有特别限定，可以是保守取代。另外，修饰优选为不会大幅改变抗体的三维结构的修饰。

然而，已知在生物体内产生针对某抗原的抗体后，通过称为“亲和性成熟(affinitymaturation)”的过程产生对抗原的亲和性较初代抗体有所提高的抗体。在本发明人的见解中，也确认到了在肿瘤浸润b细胞克隆内通过体细胞超突变(somatichypermutation)发生了各种突变的抗体分子的产生。因此，根据上述的具体公开的抗体的氨基酸序列和核苷酸序列信息，可以获取具有与所公开的抗体同等或者高于所公开的抗体的活性的抗体，具体而言，可以获取对硫酸化糖胺聚糖的结合亲和性、细胞增殖抑制活性、作为用于药物递送的靶向化试剂的功能性有所提高的抗体。实际上，本发明人确认到：如后面的实施例所记载，根据公开的序列进行了修饰的抗体与修饰前的抗体相比能够显示出细胞增殖抑制活性的提高。这些修饰除了发生在构架区和恒定区内的情形以外，在cdr区内也可发生这些修饰。

因此，本发明的抗体可以是在本说明书中具体公开的序列中的cdr区具有通过取代、缺失和/或添加的修饰的抗体。

作为被如此修饰的抗体的例子，可以列举：本发明的与硫酸化糖胺聚糖结合、具体而言是与肝素结合的以下的抗体：

(10)上述(9)的抗体，该抗体具有选自下述的1个以上的取代：seqidno:1所示的氨基酸序列中的第51位的氨基酸asp取代成asn、第56位的氨基酸ala取代成gly、以及第66位的氨基酸ile取代成thr。

具有上述的3种修饰的抗体与修饰前的抗体相比显示出细胞增殖抑制活性的提高。而且，具有seqidno:1中的第54位的氨基酸ser取代成thr、或者第102位的氨基酸pro取代成ser的抗体也显示出与修饰前的抗体同等的细胞增殖抑制活性。因此，例如在具有seqidno:1所示氨基酸序列的重链可变区中包含选自第51位的氨基酸asp取代成asn、第54位的氨基酸ser取代成thr、第56位的氨基酸ala取代成gly、第66位的氨基酸ile取代成thr和第102位的氨基酸pro取代成ser的1、2、3、4或5种取代的抗体也可适合用作本发明的抗体。

尚需说明的是，在上述的取代中，第51位的氨基酸asp取代成asn、第54位的氨基酸ser取代成thr和第56位的氨基酸ala取代成gly是视为保守取代的取代，另一方面，第66位的氨基酸ile取代成thr和第102位的氨基酸pro取代成ser是视为非保守取代的取代。

＜细胞增殖抑制剂＞

本发明还提供细胞增殖抑制剂，其含有与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体作为有效成分。与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体为如上所述的抗体。本发明的细胞增殖抑制剂能够与具有细胞增殖抑制活性的其他药物组合使用。另外，本发明的细胞增殖抑制剂能够与具有细胞毒性的药物组合使用。已确认本发明的抗体与具有硫酸化糖胺聚糖的细胞结合后被摄入该细胞内(被内化)，因此，预测与本发明的细胞增殖抑制剂组合使用的药物、例如具有细胞毒性的药物被摄入细胞内，能够发挥细胞毒活性。本发明的细胞增殖抑制剂和具有细胞毒活性的药物可以同时或者分别与细胞接触。另外，本发明的细胞增殖抑制剂还可以与放射线治疗等其他的抗癌治疗组合使用。

对具有细胞增殖抑制活性或细胞毒性的药物没有限定，可以列举：毒素等蛋白、抗有丝分裂药、烷基化剂、抗生素、代谢拮抗药、细胞凋亡药、生物碱类药物、紫杉类药物等抗癌药、放射性同位素等。作为毒素，例如可以列举：白喉毒素、皂草素(saporin)毒素、绿脓杆菌毒素、相思子毒素、蓖麻毒蛋白a毒素、肿瘤坏死因子、干扰素-γ等。对抗癌药没有限定，例如可以列举：环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、克唑替尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿法替尼、拉帕替尼、伊马替尼、厄洛替尼、依维莫司等分子靶向药；单甲基奥里斯他汀e(mmae，monomethylauristatine，一甲基澳瑞他汀e)、单甲基奥里斯他汀f(mmaf)、倍癌霉素(dm，duocarmycin)、多拉司他汀(md10)、鹅膏蕈碱(aamt)、pnu-159682(奈莫柔比星代谢物)等。作为放射性同位素，可以列举⁹⁰y、¹³¹i等。

这些药物可以与本发明的抗体缀合后使用。对抗体与药物的连接方法没有限定，例如优选通过共价键结合，例如可以经由接头在抗体上添加药物。接头可以是肽、脂肪酸、脂肪酸酯等能够构成药物与抗体的连接部的任意物质。接头还可以是作为用于不妨碍抗体的三维结构的间隔物、或者作为包含蛋白酶识别位点的可切断(切割)的连接部分插入药物与抗体之间的物质。药物与本发明抗体的连接优选针对不妨碍抗体与硫酸化糖胺聚糖的结合的位点、例如针对fc区进行。药物与抗体的连接可以在摄入到靶细胞中之后再被切断。

另外，如上所述，通过使本发明的抗体成为具有针对硫酸化糖胺聚糖的第1特异性和针对靶细胞、例如癌细胞所能表达的其他抗原的第2特异性的双特异性抗体，能够更具特异性地实现向靶细胞的递送，能够更有效地发挥细胞增殖抑制活性。另外，如果第2特异性成为针对具有细胞增殖抑制活性或细胞毒性的抗癌药等药物的特异性，则可以将药物与双特异性抗体一同作为复合物递送到靶位点。

或者，药物可以和能与本发明的抗体结合的二次抗体(secondaryantibody-drugconjugate，二次抗体-药物缀合物)缀合，与本发明的抗体组合使用。药物与二次抗体的连接也可以和上述同样地进行。或者，已与药物连接的二次抗体还可以作为市售品来获取。

具体而言，本发明的细胞增殖抑制剂例如可用于癌细胞的增殖抑制。癌细胞可以是胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌、乳癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、胆管癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌和/或胸膜恶性肿瘤中的癌细胞。

在后面的实施例中已证实：在使用与本发明的抗体组合且与抗癌药缀合的二次抗体的情况下，诱导了癌细胞的增殖抑制和细胞死亡。

＜靶向化试剂＞

本发明还提供用于药物递送的靶向化试剂，其包含与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体。与硫酸化糖胺聚糖结合的抗体为如上所述的抗体。通过与本发明的靶向化试剂组合，可以将抗癌药等药物递送至具有硫酸化糖胺聚糖的靶细胞。

靶细胞是意指通过抗癌药等药物的递送不仅抑制细胞增殖还会带来细胞毒效果的细胞、例如癌细胞。本发明的靶向化试剂和打算向靶细胞递送的药物可以同时、或者分别给予具有靶细胞的受试体。

例如，如上所述，通过使本发明的抗体成为具有针对硫酸化糖胺聚糖的第1特异性和针对药物的第2特异性的双特异性抗体，可以将药物和双特异性抗体一同作为复合物递送到靶位点。

或者，如上所述，药物可以和能与本发明的抗体结合的二次抗体缀合，与本发明的靶向化试剂组合使用。

本发明的靶向化试剂还可用于不以靶细胞的细胞死亡为目的的用途。这种情况下，为了避免在给予了靶向化试剂和药物的受试体的体内产生效应细胞和/或补体的活化而带来抗体依赖性细胞毒活性(adcc)和补体依赖性细胞毒活性(cdc)，优选使靶向化试剂中所含的本发明的抗体成为不含fc区的形式。

＜药物组合物＞

本发明还提供药物组合物，该药物组合物以有效量单独含有、或者与其他有效成分组合含有上述的本发明的细胞增殖抑制剂或上述的本发明的靶向化试剂作为有效成分。在药物组合物中，除了本发明的细胞增殖抑制剂或靶向化试剂和其他有效成分以外，根据给药形式，还可以包含本领域通常使用的药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂等。

本发明的细胞增殖抑制剂、靶向化试剂或药物组合物可以对受试体进行局部给药或全身给药，对给药形式没有限定，例如优选通过注射或注入向静脉内、腹腔内、患处或患处附近进行给药。例如通过向癌组织内进行局部给药，可使本发明的抗体和任意地通过本发明的抗体靶向化的药物聚集在癌组织，可以更有效地发挥癌细胞特异性的细胞增殖抑制效果。

作为有效成分的本发明的抗体的给药量根据患者的体重、年龄、疾病的严重程度等发生变动，没有特别限定，例如能够以0.0001～100mg/kg体重的范围按1天1次～数次、每2天、每3天、每周、每2周、每个月、每2个月、每3个月进行给药。

＜检测药＞

如上所述，已确认针对硫酸化糖胺聚糖的抗体在人的弥漫性胃癌组织中浸润，另外还确认到本发明的抗体与各种人癌细胞结合。因此，本发明还提供癌症检测药，该检测药含有上述的本发明的抗体。本发明的检测药可用于检测胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌、乳癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、胆管癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌和/或胸膜恶性肿瘤、例如选自胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌和胸膜恶性肿瘤的癌症。

具体而言，使来自受试体的生物学样品、例如血液(全血、血浆、血清)、淋巴液、间质液、胸膜液、活检样品与含有本发明抗体的检测药接触，可以检测与本发明的抗体结合的抗原、即硫酸化糖胺聚糖的有无。例如，用荧光试剂或显色试剂等标记本发明的抗体或者针对本发明抗体的二次抗体，通过检测荧光或显色即可确认。

因此，本发明还可提供癌细胞的检测方法，该检测方法包括上述的步骤。对检测方法没有限定，例如可以利用elisa、免疫沉淀法、免疫组织化学法等本领域中已知的方法。

而且，本发明的检测药还可以包含在检测试剂盒中进行提供，该检测试剂盒中包含用于抗体与硫酸化糖胺聚糖的结合反应的反应液、反应容器、用于检测的标记试剂、二次抗体、缓冲剂、使用说明书等。

＜治疗方法＞

本发明还提供受试体的癌症的治疗方法，该治疗方法包括：对受试体给予上述的本发明的细胞增殖抑制剂、上述的本发明的靶向化试剂或上述的本发明的药物组合物。本发明的方法包括：对患有由具有硫酸化糖胺聚糖的细胞引起的疾病的受试体给予本发明的细胞增殖抑制剂、靶向化试剂或药物组合物。

作为本发明的治疗方法的对象的受试体为非人动物和人，特别是人。

实施例

以下，列举实施例以进一步详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。

本发明中使用的以下的细胞株：人胃癌细胞株katoiii、hgc27、mkn1和nugc3；人胰腺癌细胞株panc-1、aspc-1和capan-1；人大肠癌细胞株sw480、sw620和hct116；人肝癌细胞株hepg2、huh7、alexander和hlf；以及人肺癌和胸膜恶性肿瘤细胞株nci-h2170、a549和nci-h28分别从理化学研究所(riken)、jcrb细胞库或atcc获取，并在适当的条件下培养后使用。

[实施例1抗体的制作]

由来自30名人弥漫性胃癌病例的冷冻肿瘤样品制作厚度为10μm的切片，使用rneasyminikit(试剂盒)(qiagen公司)提取mrna。

为了鉴定在肿瘤内浸润的b细胞产生的抗体，以提取的mrna为模板，使用美国irepertoire公司制造的多重引物组，对每名病例进行b细胞抗原受体(免疫球蛋白)的重链和轻链的基因扩增，通过使用美国illumina公司的miseq系统的300bp双端测序，对pcr产物进行下一代序列分析。

对所得的序列信息进行综合/筛选后，获取了关于v、d和j片段、以及cdr区的位置的信息(irepertoire(注册商标)、http://www.irepertoire.com/)。进一步使用imgt(http://www.imgt.org)的工具实施通过基因重构形成的抗原受体基因的v(d)j、c的比对，将重链和轻链的频率分布分别作成图。其结果，鉴定了在肿瘤环境内呈现高度地显性存在的多个b细胞/浆细胞(形質細胞)克隆。

图1a和1b分别以三维显示编码由同一病例获取的抗体的重链和轻链(κ)基因的v-j基因组合的相对频率分布。

由所鉴定的克隆具有的重链和轻链基因制作cdna构建物。这里，在通过上述的序列分析获取的核苷酸序列中不含重链和轻链的5’末端，所以在添加通过v-片段的比对推测的5’序列的同时，进行适合在哺乳动物中表达的密码子优化。尚需说明的是，添加的5’序列编码重链和轻链的cdr区的n末端侧的构架区(fw1)。

将编码重链和轻链的各cdna构建物整合到pcdna3质粒(lifetechnologies公司)中，通过各克隆中的组合导入到hek293细胞中，使重链和轻链强制表达，实施纯化，重构了2种抗体分子(gpat#1和gpat#2抗体)(acrobiosystems公司)。

gpat#1抗体是由2分子的具有由seqidno:1所示的氨基酸序列构成的可变区的重链和2分子的具有由seqidno:2所示的氨基酸序列构成的可变区的轻链构成的igg抗体。gpat#1抗体的重链可以根据经序列分析获取的序列信息(核苷酸序列：seqidno:3；氨基酸序列：seqidno:4)，在n末端添加用于抗体重构所必需的序列来获得。gpat#1抗体的轻链可以根据经序列分析获取的序列信息(核苷酸序列：seqidno:5；氨基酸序列：seqidno:6)，在n末端添加用于抗体重构所必需的序列来获得。

gpat#2抗体是由2分子的具有由seqidno:7所示的氨基酸序列构成的可变区的重链和2分子的具有由seqidno:8所示的氨基酸序列构成的可变区的轻链构成的igg抗体。gpat#2抗体的重链可以根据经序列分析获取的序列信息(核苷酸序列：seqidno:9；氨基酸序列：seqidno:10)，在n末端添加用于抗体重构所必需的序列来获得。gpat#2抗体的轻链可以根据经序列分析获取的序列信息(核苷酸序列：seqidno:11；氨基酸序列：seqidno:12)，在n末端添加用于抗体重构所必需的序列来获得。

通过重构得到的gpat#1和gpat#2抗体的各cdr的氨基酸序列见表1。

[表1]

[实施例2抗原的鉴定]

进行了实施例1中重构的gpat#1和gpat#2抗体所识别的抗原的鉴定。首先，对各种蛋白抗原的可能性进行了研究，但无法鉴定与这些抗体结合的蛋白抗原。

然后，研究了糖抗原的可能性。使用lightning-link^(r)rapidcy5conjugationkit(innovabiosciences公司)对gpat#1和gpat#2抗体进行cy5荧光标记，之后使之在住友bakelite公司制造的糖链固定阵列(bs-x1731)上反应，检测了cy5荧光信号。图2a是gpat#1抗体中的检测结果的一部分，明确了：在固定于阵列上的5种糖胺聚糖中，gpat#1抗体特别地与肝素结合。

图2b显示gpat#1抗体和gpat#2抗体与n-聚糖(m9、na2、a2、na2f、na3、a3和na4)、o-聚糖(stn和t)、糖胺聚糖(肝素、de2shep、de6shep、denshep和dens/achep)、lewis抗原(lea、lex、slea和slex)、含乳糖的糖链(lac、3sl、6sl、3slnac、6slnac、lnt和lnnt)和abo抗原(a、b和o)的结合。由图2b的结果显示：在阵列上的各种糖链中，gpat#1和gpat#2抗体特异性地与硫酸化糖胺聚糖、特别是与肝素分子结合，鉴定了这些抗体的抗原分子为硫酸化糖胺聚糖。

如图2b所示，与对denshep(n-脱硫酸化肝素)的结合相比，gpat#1抗体对肝素显示出2倍以上的结合信号值(s/n比)，特别是强力地与肝素结合。另外，与每个二糖单元具有2个硫酸基的脱硫酸化肝素(de2shep)相比，gpat#2抗体以3倍以上的量与每个二糖单元具有3个硫酸基的肝素结合。

另外，使gpat#1抗体和gpat#2抗体与蛋白-g磁珠(美国biorad公司)结合，再与fitc-缀合肝素(美国lifetechnologies公司)混合进行反应。洗涤珠粒3次后，在荧光显微镜下观察时，在通过与抗体的结合反应而结合有gpat#1抗体和gpat#2抗体的珠粒中观察到fitc的荧光信号的聚集块，确认到肝素与gpat#1抗体和gpat#2抗体的结合(图2c)。

因此，在2种不同的实验体系中显示了：gpat#1抗体和gpat#2抗体与硫酸化糖胺聚糖、特别是与肝素结合。

[实施例3癌细胞的识别和向癌细胞内的内化]

对实施例1中获取的gpat#1抗体和gpat#2抗体进行fitc标记，添加在培养胃癌细胞株nugc3和katoiii、胰腺癌细胞株panc1、肝癌细胞株huh7、肺癌细胞株nci-h2170的培养基中，在37℃下培养过夜。使用流式细胞仪(mofloxdp,beckmancoulter公司)检测fitc信号，确认到这些抗体识别并结合各种的人癌细胞(图3a)。另外，在荧光显微镜下的观察中还确认到：该抗体不仅识别并结合人癌细胞，而且在与细胞结合后还被摄入细胞内(内化)(图3b)。尚需说明的是，对照igg是判明了与细胞内的其他蛋白结合的、本发明人所拥有的其他抗体，但确认到其对上述癌细胞几乎或者完全没有反应性。所使用的对照igg的重链和轻链可变区的序列分别如seqidno:25和26所示。

[实施例4通过mtt测定来证明细胞增殖抑制效果]

使用gpat#1抗体和gpat#2抗体，使用细胞增殖试剂盒i(cellproliferationkiti)(mtt)(rochediagnostics公司)在4种胃癌细胞株(katoiii、nugc3、hgc27和mkn1)以及胰腺癌细胞株(panc1、aspc1和capan1)、大肠癌细胞株(sw480、sw620和hct116)、肝癌细胞株(hepg2、huh7、alex和hlf)和肺癌和胸膜恶性肿瘤(hci-h2170、a549和nci-h28)中实施mtt测定。

在96孔板上分别接种1.0×10⁴个katoiii、6.0×10³个nugc3、5.0×10³个hgc27、5.0×10³个mkn1、6.0×10³个panc1、8.0×10³个aspc1、1.0×10⁴个capan1、8.0×10³个sw480、8.0×10³个sw620、8.0×10³个hct116、1.0×10⁴个hepg2、6.0×10³个huh7、6.0×10³个alex、7.0×10³个hlf、6.0×10³个hci-h2170、5.0×10³个a549和1.0×10⁴个nci-h28，与20μg/ml(每孔2.0μg)的对照igg(人igg(正常)、invitrogen)、gpat#1抗体或gpat#2抗体一同在37℃下培养4天。培养是根据细胞株在d-mem或rpmi培养基中适当添加fbs(sigma-aldrich公司)、青霉素/链霉素(wakopurechemicalindustries公司)、l-谷氨酸(wakopurechemicalindustries公司)和丙酮酸钠(thermofisherscientific公司)来进行。

培养后，添加10μl的mtt标记试剂，进一步培养4小时，然后添加100μl的溶解液，培育过夜。对于各孔测定550nm的吸光度，减去空白孔的数值。实验独立地实施了4次。

其结果确认到：与对照抗体相比，gpat#1抗体和gpat#2抗体对各种的人癌细胞株呈现出增殖抑制效果(图4a和4b)。使用不同浓度的抗体进行了同样的测定，结果还确认到：该增殖抑制效果依赖于抗体浓度(未显示数据)。

[实施例5通过肝素来中和细胞增殖抑制效果]

研究了gpat#1抗体和gpat#2抗体对nugc3细胞株的细胞增殖抑制效果是否会被肝素中和。

将gpat#1抗体和gpat#2抗体(20μg/ml)与60μg/ml或100μg/ml的低分子量肝素(h3149、sigmaaldrich)一同在室温下培育3小时后，添加在包含nugc3(6.0×10³个)的孔中，实施了与实施例4同样的mtt测定。

其结果，如图4c所示，与未添加肝素的情形(肝素(-))相比，在添加了肝素的情况下(肝素(+)和肝素(++))，细胞增殖抑制效果降低。由此再次确认到：这些抗体所识别的抗原为硫酸化糖胺聚糖(肝素)。

在其他细胞株中也确认到同样的结果(未显示数据)。

[实施例6与抗癌药的并用效果的证实]

已证实：通过并用本发明的抗体和缀合有药物的二次抗体，会在人癌细胞中诱导细胞死亡。

作为药物，选择作为已知的抗癌药的单甲基奥里斯他汀f(mmaf)、倍癌霉素(dm)和鹅膏蕈碱(aamt)，使用了事先结合有这些药物的抗人igg二次抗体(moradecllc公司)。

以1.0×10⁴个的细胞浓度在96孔板中接种人胃癌细胞株katoiii和nugc3，在37℃下培养4小时。然后，在各孔中添加1.0μg/孔的gpat#1抗体或与实施例3相同的对照igg，1小时后添加0.5μg/孔的二次抗体，进一步培养3天。

3天后，在显微镜下观察细胞的形态时确认到：与并用对照igg和抗癌药的情形相比，通过并用gpat#1抗体和抗癌药，诱导了更明确的增殖抑制和细胞死亡(图5)。

[实施例7血清中的抗硫酸化糖胺聚糖抗体的检测]

使用弥漫性胃癌患者血清和非癌对照血清(bioreclamationivt公司)，与实施例2同样地使用蛋白-g磁珠(美国biorad公司)，检测到血清中存在抗硫酸化糖胺聚糖抗体。

使10μl的各血清与蛋白-g磁珠反应，接下来与fitc-缀合肝素(美国lifetechnologies公司)混合进行反应。洗涤珠粒后，在荧光显微镜下观察时，在弥漫性胃癌患者血清中观察到通过与抗体的结合反应而聚集的fitc-肝素的聚集块，但在非癌对照血清中没有观察到(未显示数据)。由该结果显示：抗硫酸化糖胺聚糖抗体(抗肝素抗体)不仅存在于癌组织中还存在于血清中，认为在癌患者中抗硫酸化糖胺聚糖抗体增加。

[实施例8修饰抗体的制作和细胞增殖抑制效果]

关于gpat#1抗体，根据在胃癌样品内的克隆中高频率出现的体细胞超突变(somatichypermutation)的数据，利用已知的基因重组法和实施例1中记载的蛋白表达体系，制作了重链可变区的氨基酸被取代的修饰抗体(gpat#1修饰1～修饰5)(图6a)。均通过取代进行修饰，修饰的氨基酸的位置和取代的氨基酸残基根据实施例1中记载的胃癌病例中的免疫球蛋白序列数据，通过提取与gpat#1抗体类似的氨基酸序列来确定。这些修饰抗体的轻链具有与gpat#1抗体相同的氨基酸序列，轻链可变区的序列如seqidno:2所示。

具体而言，gpat#1修饰1抗体具有：gpat#1抗体的重链可变区的氨基酸序列(seqidno:1)中的第51位的氨基酸asp取代成asn(seqidno:27)。该位置相当于gpat#1抗体的cdr2区的氨基酸序列(seqidno:14)中的第4位氨基酸的位置。

gpat#1修饰2抗体具有：seqidno:1中的第54位的氨基酸ser取代成thr(seqidno:28)。该位置相当于gpat#1抗体的cdr2区的氨基酸序列(seqidno:14)中的第7位氨基酸的位置。

gpat#1修饰3抗体具有：seqidno:1中的第56位的氨基酸ala取代成gly(seqidno:29)。该位置相当于与gpat#1抗体的cdr2区相邻的构架(fr)3区的最初的氨基酸的位置。

gpat#1修饰4抗体具有：seqidno:1中的第66位的氨基酸ile取代成thr(seqidno:30)。该位置相当于gpat#1抗体的fr3区的第11位氨基酸的位置。

gpat#1修饰5抗体具有：seqidno:1中的第102位的氨基酸pro取代成ser(seqidno:31)。该位置相当于gpat#1抗体的cdr3区的氨基酸序列(seqidno:15)中的第9位氨基酸的位置。

对于所得的修饰抗体，与实施例4同样地实施了mtt测定。其结果，所有的修饰抗体均显示出与gpat#1同等或超过gpat#1的细胞增殖抑制效果，其中，在gpat#1修饰1、修饰3和修饰4中得到了较gpat#1高的细胞增殖抑制效果(图6b)。

产业实用性

根据本发明，以一直以来没有有效的治疗手段的弥漫性胃癌为代表，以各种癌中在细胞上发现的硫酸化糖胺聚糖为靶，提供对癌症等疾病的治疗和检测有用的新颖方法。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过直接引用而纳入本说明书中。

<110>国立大学法人东京医科齿科大学

<120>抗硫酸化糖胺聚糖抗体

<130>ph-7491-pct

<150>jp2017-120435

<151>2017-06-20

<160>31

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gpat#1抗体重链可变区

<400>1

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

leusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamethis

202530

trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyser

354045

sertrpaspserglyserilealatyralaaspservallysglyarg

505560

pheileileserargaspasnalalysasnserleutyrleuglnmet

65707580

asnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalysgly

859095

leuleuproserleuprotyrglymetaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>2

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gpat#1抗体轻链可变区

<400>2

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnasnilephetyrser

202530

serasnasnaspasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysleuleuphetyrargalaserthrtrpgluserglyval

505560

proaspargpheseralaserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrserthrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluile

100105110

lys

<210>3

<211>309

<212>dna

<213>homosapiens

<400>3

agactctcctgtgcagcctctggattcagcttggatgattatgccatgcactgggtccgg60

caagctccagggaagggcctggagtgggtctcaggtagtagttgggatagtggtagcata120

gcctatgcggactctgtgaagggccgattcatcatctccagagacaacgccaagaactcc180

ctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtattactgtgcaaaa240

ggccttctgccctccttgccctatggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcacc300

gtctcctca309

<210>4

<211>103

<212>prt

<213>homosapiens

<400>4

argleusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamet

151015

histrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalsergly

202530

sersertrpaspserglyserilealatyralaaspservallysgly

354045

argpheileileserargaspasnalalysasnserleutyrleugln

505560

metasnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalys

65707580

glyleuleuproserleuprotyrglymetaspvaltrpglyglngly

859095

thrthrvalthrvalserser

100

<210>5

<211>288

<212>dna

<213>homosapiens

<400>5

agggccaccatcaactgcaagtccagccagaatattttctacagctccaacaatgacaat60

tacttagcttggtaccagcagaaaccgggacagcctcctaagttgctcttttacagggca120

tctacctgggaatccggggtccctgaccgattcagtgccagcgggtctgggacagatttc180

actctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattattgtcagcaatat240

tatagtactccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaa288

<210>6

<211>96

<212>prt

<213>homosapiens

<400>6

argalathrileasncyslysserserglnasnilephetyrserser

151015

asnasnaspasntyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnpro

202530

prolysleuleuphetyrargalaserthrtrpgluserglyvalpro

354045

aspargpheseralaserglyserglythraspphethrleuthrile

505560

serserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglnglntyr

65707580

tyrserthrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

859095

<210>7

<211>124

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gpat#2抗体重链可变区

<400>7

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglyalaserileargserthr

202530

alaphetyrtrpglytrpileargglnseralaalalysglyleuglu

354045

trpileglyhisvaltyrglnserglythrserlystyrasnproser

505560

leuasnserargvalthrileserleuaspthrserlysasnglnphe

65707580

pheleuargleuthrservalthralaalaaspthralailetyrtyr

859095

cysalaserserglnalatyrtyraspvalserglyglyprovalasn

100105110

asntrpglyargglythrleuvalalavalserser

115120

<210>8

<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gpat#2抗体轻链可变区

<400>8

aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvaltyrthr

202530

aspglyasnthrtyrleuasntrptyrhisglnargproglyglnser

354045

proargargleuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

thrargvalglualaaspaspileglyleutyrtyrcysileglngly

859095

thrhistrppropropheglyglnglythrlysleugluilearg

100105110

<210>9

<211>324

<212>dna

<213>homosapiens

<400>9

accctgtccctcacctgcactgtctctggtgcctccatcaggagtactgctttttactgg60

gggtggatccgccagtcagcagcgaaggggctggagtggattggccatgtctatcaaagt120

ggaacttccaaatacaacccgtccctcaacagtcgagtcaccatatcgctggacacatcc180

aagaaccagttcttcctcagactaacctctgtgaccgccgcggacacggccatatattat240

tgtgcgagtagtcaggcgtattacgatgtttcgggcggccccgttaataactggggccgg300

ggaaccctggtcgccgtctcctca324

<210>10

<211>108

<212>prt

<213>homosapiens

<400>10

thrleuserleuthrcysthrvalserglyalaserileargserthr

151015

alaphetyrtrpglytrpileargglnseralaalalysglyleuglu

202530

trpileglyhisvaltyrglnserglythrserlystyrasnproser

354045

leuasnserargvalthrileserleuaspthrserlysasnglnphe

505560

pheleuargleuthrservalthralaalaaspthralailetyrtyr

65707580

cysalaserserglnalatyrtyraspvalserglyglyprovalasn

859095

asntrpglyargglythrleuvalalavalserser

100105

<210>11

<211>282

<212>dna

<213>homosapiens

<400>11

ccggcctccatctcctgcaggtctagtcaaagcctcgtttacactgatggaaacacctac60

ttgaattggtatcaccagaggccaggccagtctccaaggcgcctaatttataaggtttct120

aaccgggactctggggtcccagacagattcagcggcagtgggtcaggcactgatttcaca180

ctgaaaatcaccagggtggaggctgacgatattggactttattactgcatccaaggtaca240

cactggcctccgttcggccaagggaccaagttggaaatcaga282

<210>12

<211>94

<212>prt

<213>homosapiens

<400>12

proalaserilesercysargserserglnserleuvaltyrthrasp

151015

glyasnthrtyrleuasntrptyrhisglnargproglyglnserpro

202530

argargleuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalproasp

354045

argpheserglyserglyserglythraspphethrleulysilethr

505560

argvalglualaaspaspileglyleutyrtyrcysileglnglythr

65707580

histrppropropheglyglnglythrlysleugluilearg

8590

<210>13

<211>8

<212>prt

<213>homosapiens

<400>13

glypheserleuaspasptyrala

15

<210>14

<211>8

<212>prt

<213>homosapiens

<400>14

sersertrpaspserglyserile

15

<210>15

<211>14

<212>prt

<213>homosapiens

<400>15

alalysglyleuleuproserleuprotyrglymetaspval

1510

<210>16

<211>12

<212>prt

<213>homosapiens

<400>16

glnasnilephetyrserserasnasnaspasntyr

1510

<210>17

<211>3

<212>prt

<213>homosapiens

<400>17

argalaser

1

<210>18

<211>9

<212>prt

<213>homosapiens

<400>18

glnglntyrtyrserthrprotyrthr

15

<210>19

<211>10

<212>prt

<213>homosapiens

<400>19

glyalaserileargserthralaphetyr

1510

<210>20

<211>7

<212>prt

<213>homosapiens

<400>20

valtyrglnserglythrser

15

<210>21

<211>16

<212>prt

<213>homosapiens

<400>21

alaserserglnalatyrtyraspvalserglyglyprovalasnasn

151015

<210>22

<211>11

<212>prt

<213>homosapiens

<400>22

glnserleuvaltyrthraspglyasnthrtyr

1510

<210>23

<211>3

<212>prt

<213>homosapiens

<400>23

lysvalser

1

<210>24

<211>8

<212>prt

<213>homosapiens

<400>24

ileglnglythrhistrppropro

15

<210>25

<211>120

<212>prt

<213>homosapiens

<400>25

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysservalserglyglyserileserserhis

202530

tyrtrpsertrpileargglnproproglylysalaleuglutrpile

354045

glyhisilephetyrserglyseralathrtyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileservalglythrserlysasnaspphethrleu

65707580

lysleuargservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argpheleuserasptyrserserglyargpheasptyrtrpglygln

100105110

glythrprovalthrvalserser

115120

<210>26

<211>112

<212>prt

<213>homosapiens

<400>26

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser

202530

aspglyasnthrtyrleuglytrpleuglnlysargproglyglnpro

354045

proargleuleuiletyrlysileserasnargleuserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyalaglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysleuglnala

859095

thrglnpheprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>27

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的抗体重链可变区

<400>27

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

leusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamethis

202530

trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyser

354045

sertrpasnserglyserilealatyralaaspservallysglyarg

505560

pheileileserargaspasnalalysasnserleutyrleuglnmet

65707580

asnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalysgly

859095

leuleuproserleuprotyrglymetaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>28

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的抗体重链可变区

<400>28

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

leusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamethis

202530

trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyser

354045

sertrpaspserglythrilealatyralaaspservallysglyarg

505560

pheileileserargaspasnalalysasnserleutyrleuglnmet

65707580

asnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalysgly

859095

leuleuproserleuprotyrglymetaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>29

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的抗体重链可变区

<400>29

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

leusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamethis

202530

trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyser

354045

sertrpaspserglyserileglytyralaaspservallysglyarg

505560

pheileileserargaspasnalalysasnserleutyrleuglnmet

65707580

asnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalysgly

859095

leuleuproserleuprotyrglymetaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>30

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的抗体重链可变区

<400>30

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

leusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamethis

202530

trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyser

354045

sertrpaspserglyserilealatyralaaspservallysglyarg

505560

phethrileserargaspasnalalysasnserleutyrleuglnmet

65707580

asnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalysgly

859095

leuleuproserleuprotyrglymetaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>31

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的抗体重链可变区

<400>31

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

leusercysalaalaserglypheserleuaspasptyralamethis

202530

trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyser

354045

sertrpaspserglyserilealatyralaaspservallysglyarg

505560

pheileileserargaspasnalalysasnserleutyrleuglnmet

65707580

asnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcysalalysgly

859095

leuleuproserleusertyrglymetaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115