用于改善的免疫细胞疗法的NK抑制剂基因的靶向基因整合的制作方法

本发明属于适应性细胞免疫疗法领域。它旨在增强原代免疫细胞针对发展免疫抗性的病症(如肿瘤)的功能，从而改善这些免疫细胞的治疗潜力。具体地，本发明的方法提供了编码nk抑制剂的外源编码序列的遗传插入以防止来自患者nk细胞攻击的同种异体t细胞排斥并且有利于所述t细胞的移植，特别是当它们来源于供体时。更具体地，这些外源编码序列插入到受通过免疫细胞激活，通过肿瘤微环境或者危急生命的炎症性病况上调的内源基因启动子或者对免疫细胞激活不敏感的启动子转录控制的细胞基因组中，更具体地在β2m基因座插入。本发明还提供了序列特异性核酸内切酶试剂和供体dna载体，如aav载体，以实施在所述具体基因座的这类靶向插入。本发明的方法有助于改善工程化原代免疫细胞的治疗潜力和安全性以便有效地用于细胞疗法中。
背景技术：
：：十多年来，通过针对一系列病症(特别是hiv感染和白血病)的许多临床试验，已建立了包括造血细胞谱系在内的原代免疫细胞群的有效临床应用(tristens.j.等人(2011)treatingcancerwithgeneticallyengineeredtcells.trendsinbiotechnology.29(11):550-557)。然而，这些临床试验的大多数都使用了从患者本身或从相容供体获得的免疫细胞，主要是nk和t细胞，这对可用免疫细胞的数量、它们的适应性以及它们克服已经出现了绕过或减少患者免疫系统的策略的疾病的效率带来了一些限制。作为获得同种异体免疫细胞的主要进展，已通过基因编辑产生了作为“现成的”治疗产品可获得的通用免疫细胞(poirot等人(2015)multiplexgenome-editedt-cellmanufacturingplatformfor“off-the-shelf”adoptivet-cellimmunotherapiescancerres.75:3853-64)。这些通用免疫细胞是通过将特异性稀切核酸内切酶表达到源自供体的免疫细胞中可获得，具有通过双链断裂破坏它们自我识别遗传决定簇的作用。自从世纪之交出现的第一个可编程序列特异性试剂(最初称为meganucleases)以来(smith等人(2006)acombinatorialapproachtocreateartificialhomingendonucleasescleavingchosensequences.nucl.acidsres.34(22):e149)，已开发了不同类型的序列特异性核酸内切酶试剂，其提供了改善的特异性、安全性和可靠性。tale核酸酶(wo2011072246)，它们是tale结合结构域与切割催化结构域的融合体，已成功应用于原代免疫细胞，特别是来自外周血单核细胞(pbmc)的t细胞。以商品名上市的这些tale核酸酶是目前用于同时灭活源自供体的t细胞中的基因序列的那些，其具体地用于生产其中破坏了编码tcr(t细胞受体)和cd52的基因的同种异体治疗性t细胞。这些细胞可赋予有嵌合抗原受体(car)以治疗癌症患者(us2013/0315884)。tale核酸酶是非常特异的试剂，因为它们需要在强制异二聚体形式下通过配对来结合dna，以获得切割结构域fok-1的二聚化。左和右异二聚体成员各自识别约14至20bp的不同核酸序列，共同跨越30至50bp整体特异性的靶序列。已经基于细菌化脓性链球菌(s.pyogenes)的ii型原核crispr(成簇规律性间隔短回文重复)适应性免疫系统的组分开发了其他核酸内切酶试剂。这种多组分系统称为rna引导的核酸酶系统(gasiunas,barrangou等人2012；jinek,chylinski等人2012)，涉及与向导rna分子偶联的cas9或cpf1核酸内切酶家族的成员，所述向导rna分子具有将所述核酸酶驱动至某些特定基因组序列的能力(zetsche等人(2015).cpf1isasinglerna-guidedendonucleasethatprovidesimmunityinbacteriaandcanbeadaptedforgenomeeditinginmammaliancells.cell163:759-771)。这些可编程的rna引导的核酸内切酶易于产生，因为切割特异性由所述rna向导的序列决定，这可以容易地设计并且廉价地生产。crispr/cas9的特异性虽然依靠比大约10pb的tal核酸酶短的序列，但其必须位于靶向基因序列中的特定基序(pam)附近。已经使用dna单链寡核苷酸(dna向导)与argonaute蛋白质组合描述了类似的系统(gao,f.等人dna-guidedgenomeeditingusingthenatronobacteriumgregoryiargonaute(2016)doi:10.1038/nbt.3547).到目前为止，还证明了源自归巢核酸内切酶的其他核酸内切酶系统(例如：i-onui或者i-crei)在与或不与tal核酸酶(例如：megatal)或者锌-指核酸酶组合的情况下的特异性，但程度较小。同时，通过转基因t细胞受体或所谓的嵌合抗原受体(car)的遗传转移，可以赋予免疫细胞新的特异性(jena等人(2010)redirectingt-cellspecificitybyintroducingatumor-specificchimericantigenreceptor.blood.116:1035-1044)。car是重组受体，其在单个融合分子中包含与一个或多个信号转导结构域相关联的靶向部分。通常，car的结合部分由单链抗体(scfv)的抗原结合结构域组成，其包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链和重链可变片段。还已成功使用了基于受体或配体结构域的结合部分。第一代car的信号转导结构域来自cd3zeta的胞质区或fc受体γ链。已证明第一代car成功重定向t细胞的细胞毒性，然而它们未能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。来自共刺激分子(包括cd28、ox-40(cd134)、icos和4-1bb(cd137))的信号转导结构域已单独添加(第二代)或组合添加(第三代)，以增强car修饰的t细胞的存活并增加其增殖。car已经成功地使得t细胞重定向针对在来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原。使用tale核酸酶破坏其t细胞受体(tcr)的最新的工程化t细胞，其被赋予有靶向cd19恶性抗原的嵌合抗原受体(car)，所述工程化t细胞被称为“ucart19”产物，并且已在至少两位患有难治性白血病的婴儿中显示出治疗潜力(leukaemiasuccessheraldswaveofgene-editingtherapies(2015)nature527:146–147)。为了获得这些ucart19细胞，在加帽的mrna电穿孔后将tale核酸酶瞬时表达到细胞中以操作tcr基因破坏，然而使用逆转录病毒载体将编码嵌合抗原受体(carcd19)的盒随机引入基因组中。在后一种方法中，基因失活和表达嵌合抗原受体的步骤在诱导t细胞“离体”活化后独立进行。然而，工程化原代免疫细胞对这些细胞的生长/生理学并不是没有任何影响。具体地，一个主要困难是避免细胞耗尽/无反应性，这会显著降低其免疫反应和寿命。当细胞在输注到患者体内之前被人工活化时，更可能发生这种情况。当细胞被赋予过度反应性的car时也是如此。为了避免这些缺陷，本发明人已经考虑利用t细胞活化期间的一些关键基因的转录调控来表达外源基因序列，从而增加免疫细胞的治疗潜力。使用序列特异性核酸内切酶试剂，通过基因靶向插入引入在免疫细胞活化时要表达或共表达的外源基因序列，以便它们的编码序列在所述基因座处存在的内源启动子的控制下转录。作为另外一种选择，在免疫细胞活化期间不表达的基因座可用作表达盒整合的“安全港基因座”，而对基因组没有任何不良后果。根据本发明，这些细胞工程策略通常往往倾向于增强原代免疫细胞的治疗潜力，特别是通过增加它们的寿命、持久性和免疫活性，以及通过限制细胞耗尽。本发明可以作为自体同源治疗策略的一部分在来自患者的原代细胞上进行以及作为同种异体治疗策略的一部分在来自供体的原代细胞上进行。技术实现要素：非同源末端连接(nhej)和同源介导修复(hdr)是用于修复体内dna断裂的两种主要途径。后一种途径以模板依赖的方式修复断裂(hdr天然利用姐妹染色单体作为dna修复模板)。几十年来，同源重组已用于使用外源提供的供体模板利用靶向dna修饰来精确编辑基因组。使用稀切核酸内切酶在靶位置人工产生双链断裂(dsb)显著提高了同源重组的效率(例如，us8,921,332)。此外，稀切核酸内切酶与含有与断裂位点同源的dna序列的供体模板的共同递送使得基于hdr的基因编辑(如基因修正或基因插入)成为可能。然而，由于以下几种技术限制，这些技术尚未广泛用于原代免疫细胞，特别是cart细胞：难以将dna转染到导致细胞凋亡的这类细胞中，免疫细胞的寿命和代数有限，同源重组通常以低频率发生。到目前为止，序列特异性核酸内切酶试剂主要用于原代免疫细胞中，以用于使用nhej途径进行基因失活(例如，wo2013176915)。cart细胞的继承性转移代表了抵抗多种癌症的非常有希望的策略。这些疗法的临床结果与效应细胞在患者体内移植、增殖和特异性杀死肿瘤细胞的能力密切相关。当考虑输注同种异体cart细胞时，必须避免宿主抗移植物和移植物抗宿主反应以防止继承性转移的细胞的排斥，从而最大程度减小宿主的组织损伤并引起显著的抗肿瘤结果。本发明通过成功产生β2m缺陷型cart细胞提供了新型细胞工程化策略以解决上述考虑，其中已通过定点基因编辑插入编码nk抑制剂的外源序列以用于其在t细胞活化期间的表达。本发明的一个主要优点在于将这些编码nk抑制剂的外源序列置于内源启动子的控制之下，其转录活性不被免疫细胞活化作用降低。在优选方面，本发明依赖于在靶细胞中的β2m基因座进行定点基因编辑，具体地基因插入(或多基因插入)以使得所述整合的基因转录优选受所述β2m基因座的内源启动子控制，优选代替β2m表达。作为另外一种选择，本发明可以依赖于在原代免疫细胞中进行基因编辑以使整合的基因转录受内源启动子的控制，同时通过在供体模板中使用顺式调控元件(例如，2a顺式作用水解酶元件)或内部核糖体进入位点(ires)来维持天然基因的表达。在其他方面，本发明依赖于在tcr基因座或者在所选的在免疫细胞活化时上调的基因座表达嵌合抗原受体(car)。例如，通过也被引入的顺式调控元件(例如，2a顺式作用水解酶元件)或内部核糖体进入位点(ires)的分开，可以将编码car的外源序列和内源基因编码序列共转录。例如，编码car的外源序列可以置于由肿瘤微环境活化的内源基因启动子的转录控制下，所述内源基因启动子如hif1a、转录因子缺氧诱导因子或芳烃受体(ahr)，它们是在肿瘤近距离环境中分别由缺氧和异生素(异种生物，xenobiotics)诱导的基因感受器。在优选的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：在存在dna修复基质的情况下，优选置于基于aav6的载体中，通过表达序列特异性核酸酶试剂，如作为非限制性实例的talen、zfn或rna引导的核酸内切酶，在肿瘤微环境下高度转录的基因座处产生双链断裂。这种dna供体模板通常包括两个同源臂，其嵌入单个或多个开放阅读框架和调控遗传元件(终止密码子和polya序列)。编码nk抑制剂的外源序列优选包括编码非多态性i类分子或病毒逃避素(evasin)，如ul18[uniprot#f5hfb4]和ul16[也称为ulbp1-uniprot#q9bzm6]的序列、其片段或融合体。根据优选实施方式，所述外源序列编码对hla-g或hla-e或其功能变体显示出至少80％氨基酸序列同一性的多肽。可以通过使存在于所述基因座的内源编码序列缺失或对其进行修饰(敲除或敲入)将这些外源序列引入基因组，从而基因失活可以与转基因组合。取决于靶向的基因座及其在免疫细胞活性中的参与，靶向内源基因可以失活或维持其原始功能。如果靶向的基因对于免疫细胞活性是必需的，则这种插入程序可以产生单个敲入(ki)而没有基因失活。相反，如果认为靶向的基因参与免疫细胞抑制/耗尽，则设计插入程序以阻止内源基因的表达，优选通过敲除内源序列，同时使得能够表达引入的外源编码序列。在更具体的方面，本发明依赖于通过在特定基因座(如作为非限制性实例的pd1、pdl1、ctla-4、tim3、lag3、tnfa或ifng)处的靶向整合(有或没有天然基因破坏)活化car信号转导通路时以各种动力学上调靶基因表达。在甚至更具体的方面，本文描述了工程化的免疫细胞，并且优选用于输注到患者的原代免疫细胞，其包含编码il-15或il-12多肽的外源序列，其整合在pd1、cd25或cd69内源基因座上，以在这些基因座处存在的内源启动子的控制下表达。根据本发明的免疫细胞可以是[car]阳性、[car]阴性、[tcr]阳性或[tcr]阴性，其取决于治疗适应症和受体患者。在一个优选的方面，进一步使免疫细胞对同种异体移植呈[tcr]阴性。这优选通过整合编码嵌合抗原受体(car)或重组tcr或其组分的外源序列，尤其可以通过编码tcr的至少一种组分(如trac(编码tcrα的基因座))的至少一种内源序列的遗传破坏来实现。根据本发明的其他方面，除了编码nk抑制剂的之外，用编码多肽的其他外源序列转染免疫细胞，所述多肽可以结合并优选干扰il-6受体家族的细胞因子受体，如突变的gp130。具体地，本发明提供了免疫细胞，优选t细胞，其分泌可溶性突变的gp130，其针对通过干扰和理想地阻断白细胞介素-6(il-6)信号转导来减少细胞因子释放综合征(crs)。crs是一种众所周知的细胞免疫治疗并发症，其导致当转导的免疫细胞开始在体内活跃时出现的自体免疫。在il-6与其受体il-6r结合后，该复合物与gp130亚基结合，从而启动信号转导和炎症反应级联。根据具体方面，在工程化的免疫细胞中表达包含与igg1抗体的fc部分融合的gp130的细胞外结构域(sgp130fc)的二聚体蛋白，以特异性结合可溶性il-r/il-6复合物，从而实现il-6反式信号转导的部分或完全阻断。根据本发明的其他方面，可以通过作用于其他途径，特别是通过抑制作为crs的增强组分的巨噬细胞活化综合征(mas)来减轻细胞因子释放综合征(crs)。为了实现该目标，本发明包括整合编码il1和il18活化途径的拮抗剂，如il1ra和/或il18bp的外源序列。因此，本发明提供了产生治疗性细胞的方法，根据所述方法，编码il1ra和/或il18bp的外源序列在所选基因座、如本文所提供的一个所选基因座处整合。因此，本发明涉及在与nk抑制剂组合或无nk抑制剂的情况下，在免疫疗法中限制crs的多种方法，其中免疫细胞经遗传修饰以表达可溶性多肽，该多肽可结合并优选干扰il1或il18(如il1ra、il18bp)、il-6受体家族的细胞因子受体(如sgp130fc)。根据优选的方面，编码可以结合并优选干扰il1、il18或者il-6受体家族的细胞因子受体的所述可溶性多肽的这种序列被整合在内源启动子的控制下，优选地在响应于t细胞活化的一个基因座处，如选自表6、8或9中的一种，更具体地pd1、cd25或cd69基因座。载体的多核苷酸序列、包含外源编码序列和/或与内源基因座同源的序列的供体模板、与所得工程化细胞有关的序列以及允许检测所述工程化细胞的那些序列都是本发明公开的一部分。根据本发明，整合编码nk抑制剂的外源序列的基因编辑步骤可以与任何其他步骤组合，从而有助于提高工程化免疫细胞的效力或安全性。作为非限制性实例，可以通过靶向整合引入基因序列以用于生物“逻辑门”(“与(and)”或“或(or)”或“非(not)”或这些的任何组合)的组分的表达。与电子逻辑门类似，在不同基因座处表达的这些细胞组分可以交换负信号和正信号，例如，其决定免疫细胞的活化条件。这种组分包括作为非限制性实例的阳性和阴性嵌合抗原受体，其可用于控制t细胞活化以及表达它们的工程化t细胞的所得细胞毒性。根据优选的实施方式，本发明依赖于通过转染ssdna(作为非限制性实例的寡核苷酸)、dsdna(作为非限制性实例的质粒dna)和更具体地作为非限制性实例的腺相关病毒(aav)而引入序列特异性核酸内切酶试剂和/或含有所关心的基因和与靶基因同源的序列的供体模板。本发明还涉及载体、供体模板、试剂、用于识别新nk抑制剂的筛选方法和与上述方法有关的所得的工程化细胞，以及它们在治疗中的用途。附图及表格说明：图1：通过在特定免疫细胞类型中特异性活化的内源启动子的转录控制下在特定基因座处引入外源序列来工程化造血干细胞(hsc)的策略。该图列出了特定内源基因的实例，在该基因座上可以插入外源编码序列以在所期望的造血谱系中表达，如本发明所述。目标是生产离体工程化的hsc以植入患者，以便它们在体内产生免疫细胞，这些细胞将表达选择的转基因同时它们被分化成所期望的谱系。图2：实验部分中用于将il-15外源编码序列插入到cd25和pd1基因座处以及将抗cd22car外源编码序列插入在trac基因座处的供体序列的示意图。a：供体模板(命名为il-15m-cd25)，其设计用于在cd25基因座上定点插入il-15，以获得通过免疫细胞的cd25和il-15多肽的共转录。实施例中详述了序列。b：供体模板(命名为il-15m-pd1)，其设计用于在pd1基因座上定点插入il-15，以用于在pd1内源基因启动子的转录活性下获得il-15的转录。可以选择pd1的右边界和左边界序列以保持pd1内源编码序列完整或被破坏。在后一种情况下，pd1被敲除而il-15被敲入并转录。c：设计用于将嵌合抗原受体(例如：抗cd22car)定点插入tcr基因座(例如：trac)的供体模板。通常，选择左右边界以便破坏tcr，从而获得适用于同种异体移植入患者的[tcr]阴性[car]阳性工程化免疫细胞。图3：通过分别使用pd1或cd25的il-15m在pd1或cd25基因座上的靶向整合频率的流式细胞术测量，其中抗cd22car也使用trac整合到trac基因座。这些结果显示了trac基因座处的car抗cd22和在pd1或cd25基因座处的il-15编码序列两者的有效靶向整合。a：空白转染的原代t细胞。b：用图1(b和c)中描述的供体序列以及用于在tcr和pdi基因座处双重整合的特异性转染的原代t细胞。c：用图1(a和c)中描述的供体序列以及用于在tcr和cd25基因座处双重整合的特异性转染的原代t细胞。图4：实验部分中用于转染原代免疫细胞以获得图5和图6中所示结果的外源序列的示意图。图5和图6：在抗cd3/cd28非特异性活化时和在car依赖性肿瘤细胞活化(raji肿瘤细胞)时，用图4的供体模板和特异性(tcr和cd25)转染的活t细胞中，用于lngfr表达的流式细胞术测量。如图6所示，在car/肿瘤接合后，在[car抗cd22]阳性细胞中特异性诱导了lngfr表达。图7和图8：在抗cd3/cd28非特异性活化和肿瘤细胞活化(raji肿瘤细胞)时，用图4的供体模板和特异性(tcr和cd25)转染的活t细胞中，用于cd25表达的流式细胞术测量。如图8所示，在car/肿瘤接合后，在[car抗cd22]阳性细胞中特异性诱导了cd25表达。图9：实验部分中用于转染原代免疫细胞以获得图11和12中所示结果的外源序列的示意图。图10和图11：在抗cd3/cd28非特异性活化和肿瘤细胞活化(raji肿瘤细胞)时，用图9的供体模板和特异性(tcr和pd1)转染的活t细胞中，用于lngfr表达的流式细胞术测量。如图11所示，在car/肿瘤接合后，在[car抗cd22]阳性细胞中特异性诱导了lngfr表达。图12：在使用或不使用(tcr和pd1)的情况下，在抗cd3/cd28非特异性活化和肿瘤细胞活化(raji肿瘤细胞)时，用图9的供体模板转染的活t细胞中，用于内源pd1表达的流式细胞术测量。通过talen处理有效地敲除了pd1(54％中，剩余8％的pd1表达)。图13：显示使用图2(b)中描述的供体模板以及用于将il-15外源编码序列插入pd1基因座的转染的根据本发明的[car]阳性(carm)和[car]阴性工程化免疫细胞中的il-15生产的图。转录受内源性pd1启动子控制的il15在抗cd3/cd28非特异性活化和肿瘤细胞活化(raji肿瘤细胞)时被有效诱导并且分泌在培养基中。图14：显示通过根据本发明工程化的免疫细胞活化后随时间(天数)分泌的il-15的量的图。a：使用图2a(il-15m_cd25)和/或2c(carm)中描述的dna供体模板，通过在cd25基因座处整合il-15编码序列而工程化的细胞。b：使用图2b(il-15m_pd1)和/或2c(carm)中描述的dna供体模板，通过在pd1基因座处整合il-15编码序列而工程化的细胞。两个基因座处的整合显示出相似的il-15分泌谱。通过car的肿瘤特异性活化，il-15的分泌显著增加。图15：报道如实施例2中所述的存活测定(连续杀伤测定)中随时间表达cd22抗原(荧光素酶信号)的raji-luc肿瘤细胞的数目的图。已经将免疫细胞(pbmc)工程化以将il-15编码序列整合到pd1(a)或cd25基因座(b)并且在tcr基因座表达抗cd22-car(借此破坏tcr表达)。在该测定中，在被car阳性细胞部分或完全消除的同时，将肿瘤细胞定期添加到培养基中。在pd1或cd25细胞中重新表达il-15显著有助于car阳性细胞消除肿瘤细胞。图16：在实验部分中用于在pd1基因座处插入编码il-12和gp130fc的外源序列的供体序列的示意图。a：供体模板(称为il-12m-pd1)，其设计用于在pd1基因座处定点插入il-12a和il-12b编码序列(seqidno:47和48)以获得il-12a和il-12b的共转录，同时破坏pd1内源编码序列。与pd1基因座序列同源的右边界序列和左边界序列长至少100pb，优选长至少200pb，并且更优选长至少300pb并且包含seqidno:45和46。表5详述了序列。b：供体模板(称为gp130fcm-pd1)，其设计用于定点插入gp130fc编码序列(seqidno:51)，以在pd1启动子下在pd1基因座处获得转录，同时破坏pd1内源编码序列。与pd1基因座序列同源的右边界序列和左边界序列长至少100pb，优选长至少200pb，更优选长至少300pb并且包含seqidno:45和46。表5中详述了序列。图17：可以靶向mhc-i阴性t细胞以用于nk细胞攻击。[在以指定的e:t比，存在或不存在cd2/nkp46活化的nk细胞的情况下，培养[β2m]阴性t细胞。数据表明在所测试的所有e:t比，mhci阴性t细胞减少超过50％。图18：显示根据本发明的方法开展策略以获得对nk和同种异体t细胞溶胞活性具有抗性的工程化cart细胞产物的图。图19：用于分别在trac和β2m基因座双重靶向整合car和nk抑制剂的靶向整合构建体的示意图。(参见实施例3)。图20：可以被在本发明的car阳性t细胞中的β2m基因座处整合的外源序列编码的hla-e三聚体的一般结构。图21：根据实施例3中所提供的实验所获得的trac/b2m缺陷型t细胞中的car和nk抑制剂构建体的双重靶向整合。用talen处理的工程化cart细胞的流式细胞术分析和靶向整合构造。在trac/b2m缺陷型car+t细胞内记录了nk抑制剂表达。表1：来自不同病毒的isu结构域变体。表2：来自天然和人工来源的fp多肽的氨基酸序列。表3：参与免疫细胞抑制途径的基因列表，其可通过插入根据本发明的外源编码序列而有利地修饰或失活。表4：实施例1中提到的序列。表5：实施例2和实施例3中提到的序列。表6：在t细胞活化时上调的人类基因列表(car活化敏感启动子)，其中根据本发明寻求基因靶向插入以改善免疫细胞治疗潜力。表7：在免疫细胞活化期间稳定转录的基因(依赖或非依赖于t细胞活化)的选择。表8：在t细胞活化时瞬时上调的基因的选择。表9：在t细胞活化时超过24小时上调的基因的选择。表10：在免疫细胞活化时下调的基因的选择。表11：在t细胞活化时沉默的基因(安全港基因靶向的整合基因座)的选择。表12：在肿瘤耗尽的浸润淋巴细胞中上调的基因座的列表(从多个肿瘤汇编而成)，其用于根据本发明的外源编码序列的基因整合。表13：在缺氧肿瘤条件下上调的基因座的列表，其用于根据本发明的外源编码序列的基因整合。具体实施方式除非本文特别定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。使用本文所述的合适的方法和材料，与本文所述的那些类似或等同的所有方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文所提及的所有专利公开、专利申请、专利和其他参考文献将以其全部内容作为参考并入。在冲突的情况下，将以本说明书，包括定义为准。此外，除非另有说明，否则材料、方法和实施例仅是说明性的而不意欲限制。除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分说明。参见，例如，currentprotocolsinmolecularbiology(frederickm.ausubel,2000,wileyandsoninc,libraryofcongress,usa)；molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,(sambrook等人,2001,coldspringharbor,newyork:coldspringharborlaboratorypress)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.,1984)；mullis等人,美国专利no.4,683,195；nucleicacidhybridization(b.d.harries&s.j.higginseds.1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higgins主编1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney,alanr.liss,inc.,1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；b.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；theseries,methodsinenzymology(j.abelsonandm.simon主编,academicpress,inc.,newyork),具体地154和155卷(wu等人主编)和185卷,"geneexpressiontechnology"(d.goeddel主编)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.millerandm.p.calos主编,1987,coldspringharborlaboratory)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker主编,academicpress,london,1987)；handbookofexperimentalimmunology,i-iv卷(d.m.weirandc.c.blackwell主编,1986)；和manipulatingthemouseembryo,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1986)。本发明涉及一种制备用于细胞免疫疗法的原代免疫细胞的一般方法，包括将外源编码序列基因靶向整合到所述免疫细胞的染色体dna中。根据一些方面，这种整合是以这样的方式进行的，即将所述编码序列置于对所述细胞内源的至少一种启动子的转录控制之下，所述内源启动子优选地不是组成型启动子，如一种转录t细胞受体α常数(trac-ncbi基因id#28755)。根据本发明的组成型启动子是(例如)独立于car激活而具有活性的启动子—例如：当t细胞尚未激活时。通过基因靶向整合改善免疫细胞的治疗潜力使用多核苷酸序列特异性试剂(如稀切核酸内切酶)的基因编辑技术已成为将遗传修饰引入原代细胞的现有技术。然而，迄今为止它们尚未用于免疫细胞中以引入受内源启动子转录控制的外源编码序列。本发明旨在通过基因编辑技术，特别是通过基因靶向整合，来改善免疫细胞的治疗潜力。“基因靶向整合”是指任何已知的位点特异性方法，其允许将基因组序列插入、替换或修正到活细胞中。根据本发明的一个优选方面，所述基因靶向整合包括在靶基因的基因座处的同源基因重组，以导致至少一个外源核苷酸的插入或替换，所述至少一个外源核苷酸优选多个核苷酸的序列(即多核苷酸)，以及更优选编码序列。“序列特异性试剂”是指具有特异性识别基因组基因座上的所选多核苷酸序列的能力的任何活性分子，鉴于修饰所述基因组基因座，其优选至少9bp，更优选至少10bp，并且甚至更优选至少12pb的长度。根据本发明的一个优选方面，所述序列特异性试剂优选是序列特异性核酸酶试剂。“免疫细胞”是指在功能上参与先天和/或适应性免疫应答的起始和/或执行的造血来源的细胞，如通常cd3或cd4阳性细胞。根据本发明的免疫细胞可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、nk细胞、b细胞或者选自炎性t淋巴细胞、细胞毒性t淋巴细胞、调节性t淋巴细胞或辅助性t淋巴细胞的t细胞。细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和来自肿瘤，如肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞可以来自健康供体，来自诊断患有癌症的患者或来自诊断患有感染的患者。在另一个实施方式中，所述细胞是呈现不同表型特征的混合免疫细胞群的一部分，如包含cd4、cd8和cd56阳性细胞。“原代细胞”是直接取自活组织(例如,活组织检查材料)并建立了有限时间的体外生长的细胞，这意味着它们可以进行有限数量的群体倍增。原代细胞与连续致瘤或人工无限增殖化细胞系相对。这些细胞系的非限制性实例是cho-k1细胞；hek293细胞；caco2细胞；u2-os细胞；nih3t3细胞；nso细胞；sp2细胞；cho-s细胞；dg44细胞；k-562细胞，u-937细胞；mrc5细胞；imr90细胞；jurkat细胞；hepg2细胞；hela细胞；ht-1080细胞；hct-116细胞；hu-h7细胞；huvec细胞；molt4细胞。原代细胞通常用于细胞治疗，因为它们被认为功能更强以及致瘤性更低。通常，原代免疫细胞通过本领域已知的多种方法由供体或患者提供，例如，通过schwartzj等人(guidelinesontheuseoftherapeuticapheresisinclinicalpractice-evidence-basedapproachfromthewritingcommitteeoftheamericansocietyforapheresis:thesixthspecialissue(2013)jclinapher.28(3):145-284)综述的白细胞去除术技术。根据本发明的原代免疫细胞还可以从干细胞分化，如脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、造血干细胞(hsc)和诱导的多潜能干细胞(ips)。“核酸酶试剂”是指通过本身或作为复合物的亚基(如向导rna/cas9)有助于靶细胞中的核酸酶催化反应的核酸分子，优选核酸内切酶反应，优选导致核酸序列靶标的切割。本发明的核酸酶试剂通常是“序列特异性试剂”，这意味着它们可以在预定基因座处诱导细胞中的dna裂解，延伸称为“靶向基因”。被序列特异性试剂识别的核酸序列称为“靶序列”。所述靶序列通常在细胞基因组并且更广泛地在人类基因组中被选择为稀有或独特的，这可以使用软件和从人类基因组数据库获得的数据确定，如http://www.ensembl.org/index.html。“稀切核酸内切酶”是选择的序列特异性核酸内切酶试剂，前提是它们的识别序列通常为10至50个连续的碱基对，优选12至30bp，以及更优选14至20bp。根据本发明的优选方面，所述核酸内切酶试剂是编码“工程化”或“可编程”稀切核酸内切酶的核酸，如(例如)arnoulds.等人(wo2004067736)所述的归巢核酸内切酶，例如，urnovf.等人(highlyefficientendogenoushumangenecorrectionusingdesignedzinc-fingernucleases(2005)nature435:646-651)所述的锌指核酸酶(zfn)，例如，mussolino等人(anoveltalenucleasescaffoldenableshighgenomeeditingactivityincombinationwithlowtoxicity(2011)nucl.acidsres.39(21):9283-9293)所述的tale核酸酶或者例如，boissel等人(megatals:arare-cleavingnucleasearchitecturefortherapeuticgenomeengineering(2013)nucleicacidsresearch42(4):2591-2601)所述的megatal核酸酶。根据另一实施方式，核酸内切酶试剂是与rna引导的核酸内切酶一起使用的rna-向导，如尤其是cas9或cpf1，如doudna,j.和chapentier,e.(thenewfrontierofgenomeengineeringwithcrispr-cas9(2014)science346(6213):1077)的教导，其通过引用并入本文。根据本发明的优选方面，核酸内切酶试剂瞬时表达到细胞中，这意味着所述试剂不应该整合到基因组中或长期存在，如rna的情况，更具体地mrna、蛋白质或混合蛋白质和核酸的复合物(例如：核糖核蛋白)的情况。通常，核酸内切酶试剂的80％在转染30小时后被降解，优选24小时，更优选20小时。优选根据本领域熟知的技术用帽合成mrna形式的核酸内切酶以增强其稳定性，如(例如)korea.l.等人(lockednucleicacid(lna)-modifieddinucleotidemrnacapanalogue:synthesis,enzymaticincorporation,andutilization(2009)jamchemsoc.131(18):6364-5)所述。通常，用于转染免疫细胞的电穿孔步骤通常在包括平行板电极的封闭室中进行，所述平行板电极在所述平行板电极之间产生在整个处理体积内基本均一的大于100伏/厘米且小于5,000伏/厘米的脉冲电场，如wo/2004/083379中所述，其通过引用并入，尤其是从第23页第25行至第29页第11行。一种这样的电穿孔室优选具有由电极间隙平方(cm2)除以室容积(cm3)的商定义的几何因子(cm-1)，其中几何因子小于或等于0.1cm-1，其中细胞和序列特异性试剂的悬浮液处于培养基中，该培养基经过调节以便培养基的电导率范围为0.01至1.0毫西门子。通常，细胞悬浮液经历一个或多个脉冲电场。利用该方法，悬浮液的处理体积是可缩放的，并且室中的细胞的处理时间基本上是均匀的。由于其更高的特异性，已证明tale核酸酶是用于治疗应用的特别合适的序列特异性核酸酶试剂，尤其是在异二聚体形式下—即成对使用“右”单体(也称为“5'”或“正向”)和“左”单体(也称为“3””或“反向”)，如(例如)mussolino等人(facilitatetargetedgenomeeditinginhumancellswithhighspecificityandlowcytotoxicity(2014)nucl.acidsres.42(10):6762-6773)所报道的。如前所述，序列特异性试剂优选为核酸形式，如编码稀切核酸内切酶及其亚基的dna或rna形式，但它们也可以是包括多核苷酸和多肽的缀合物的一部分，如所谓的“核糖核蛋白”。可以使用试剂，如cas9或cpf1(rna引导的核酸内切酶)或argonaute(dna引导的核酸内切酶)形成这些缀合物，如最近分别通过zetsche,b.等人(cpf1isasinglerna-guidedendonucleaseofaclass2crispr-cassystem(2015)cell163(3):759–771)和通过gaof.等人(dna-guidedgenomeeditingusingthenatronobacteriumgregoryiargonaute(2016)naturebiotech)所报道的，这涉及可与它们相应的核酸酶复合的rna或dna向导。“外源序列”是指最初所选基因座处不存在的任何核苷酸或核酸序列。该序列可以与基因组序列同源或是基因组序列的拷贝，或者是引入细胞的外源序列。相反，“内源序列”是指最初在基因座处存在的细胞基因组序列。外源序列优选编码多肽，与未在该基因座处整合该外源序列的姊妹细胞相比，该多肽的表达赋予了治疗优势。为表达不同的多肽，通过根据本发明的方法插入核苷酸或多核苷酸基因编辑的内源序列被广泛称为外源编码序列。本发明的方法可以与涉及遗传转化物理的其他方法(如使用纳米颗粒的病毒转导或转染)相关联并且还可以与其他基因失活和/或转基因插入组合。根据一个方面，根据本发明的方法包括以下步骤：–提供原代免疫细胞群；–向所述原代免疫细胞的一部分中引入：i)至少一种核酸，其包含待整合在选定的内源基因座上的外源核苷酸或多核苷酸序列，以编码改善所述免疫细胞群的治疗潜力的至少一种分子；ii)特异性靶向所述选定的内源基因座的至少一种序列特异性试剂，其中所述外源核苷酸或多核苷酸序列通过靶向基因整合插入到所述内源基因座中，以便所述外源核苷酸或多核苷酸序列形成受存在于所述基因座处的内源启动子的转录控制的外源编码序列。根据该方法的一个方面，序列特异性试剂是核酸酶，并且靶向基因整合是通过同源重组或nhej至所述免疫细胞来操作的。根据本发明的其他方面，所述内源启动子经选择以在免疫细胞活化期间具有活性并且优选上调。更具体地，本发明涉及一种制备用于细胞免疫疗法的工程化原代免疫细胞的方法，所述方法包括：–提供原代免疫细胞群；–向所述原代免疫细胞的一部分中引入：i)至少一种外源核酸，其包含编码改善所述免疫细胞群的治疗潜力的至少一种分子的外源编码序列；ii)至少一种序列特异性核酸酶试剂，其特异性地靶向受免疫细胞活化期间活化的内源启动子控制的基因；其中，通过靶向同源重组将所述编码序列引入所述原代免疫细胞基因组中，以便所述编码序列置于所述基因的至少一种内源启动子的转录控制之下。“改善治疗潜力”是指与其姊妹非工程化免疫细胞相比，工程化的免疫细胞获得至少一种用于细胞治疗的有利特性。本发明所寻求的治疗特性可以是相关科学文献中提到的任何可测量的特性。通过免疫细胞对药物的耐受性、它们在体外或体内的持久性增加或者在制备治疗组合物和治疗期间更安全/更方便的操作可以更具体地反映改善的治疗潜力。通常，所述改善治疗潜力的分子是多肽，但它也可以是能够指导或抑制其他基因表达的核酸，如干扰rna或向导-rna。多肽可以直接或间接起作用，如信号转导物或转录调节剂。根据本方法的一个实施方式，通过靶向同源重组将外源序列引入内源染色体dna。因此，引入免疫细胞的外源核酸包含至少一种编码序列，以及可以在生理条件下与内源染色体序列杂交的序列。通常，这种同源序列与位于插入基因座处的内源基因序列显示出至少70％，优选80％，以及更优选90％的序列同一性。这些同源序列可位于编码序列的侧翼，以提高重组的精确度，如us6,528,313中已教导的。使用可用的软件和在线基因组数据库，有可能设计包括所述编码序列的载体，如此，所述序列被引入在精确的基因座上，受至少一种内源启动子的转录控制，所述内源启动子是内源基因的启动子。然后，优选将外源编码序列与所述内源基因“框内”插入。由外源多核苷酸序列整合产生的序列可编码许多不同类型的蛋白质，包括融合蛋白、标签蛋白或突变蛋白。融合蛋白允许向细胞中表达的蛋白质添加新的功能结构域，如可用于开启或关闭所述蛋白质活性的二聚化结构域，如caspase-9开关。标签蛋白可有利于检测工程化免疫细胞和用所述细胞治疗的患者的随访。将突变引入蛋白质可以赋予对药物或免疫耗尽剂的抗性，如下文进一步描述的。赋予对药物或免疫耗尽剂的抗性根据本方法的一个方面，整合到免疫细胞基因组基因座中的外源序列编码赋予所述免疫细胞对药物的抗性的分子。优选的外源序列的实例是赋予对如甲氨蝶呤的叶酸类似物的抗性的二氢叶酸还原酶(dhfr)的变体、赋予对如霉酚酸(mpa)或其前药霉酚酸酯(mmf)的impdh抑制剂的抗性的肌苷单磷酸脱氢酶2(impdh2)的变体、赋予对如fk506和/或csa的钙调磷酸酶抑制剂的抗性的钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(mgmt)的变体、赋予对雷帕霉素的抗性的mtor的变体(如mtormut)以及赋予对伊马替尼和格列卫的抗性的lck的变体(如lckmut)。术语“药物”在本文中用于指化合物或其衍生物，优选通常用于与癌细胞相互作用从而降低该细胞的增殖或生存状态的标准化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括(但不限于)烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺)、代谢拮抗剂(例如，嘌呤核苷抗代谢物，如氯法拉滨、氟达拉滨或2'-脱氧腺苷、甲氨蝶呤(mtx)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素)、植物来源的抗肿瘤药(例如，长春新碱、长春地辛、紫杉醇)、顺铂、卡铂、依托泊苷等。此类药剂还可以包括(但不限于)抗癌剂trimethotrixatetm(tmtx)、temozolomidetm、raltritrexedtm、s-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(nbmpr)、6-苄基胍(6-bg)、双氯亚硝基脲(bcnu)和camptothecintm或者其任何治疗性衍生物。如本文所使用的，当所述免疫细胞或免疫细胞群经修饰以使其在含有半数最大抑制浓度(ic50)的所述药物的培养基中至少在体外可以增殖时，所述免疫细胞是对所述药物“抗性或耐受的”(所述ic50是针对未修饰的细胞或细胞群确定的)。在特定实施方式中，可以通过至少一种“抗药性编码序列”的表达将所述抗药性赋予免疫细胞。所述抗药性编码序列是指赋予针对药剂的“抗性”的核酸序列，所述药剂如上述化学治疗剂之一。本发明的抗药性编码序列可编码针对抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷化剂、蒽环霉素、细胞毒性抗生素、抗免疫亲和素、它们的类似物或衍生物等的抗性(takebe,n.,s.c.zhao等人(2001)"generationofdualresistanceto4-hydroperoxycyclophosphamideandmethotrexatebyretroviraltransferofthehumanaldehydedehydrogenaseclass1geneandamutateddihydrofolatereductasegene".mol.ther.3(1):88-96)、(zielske,s.p.,j.s.reese等人(2003)"invivoselectionofmgmt(p140k)lentivirus-transducedhumannod/scidrepopulatingcellswithoutpretransplantirradiationconditioning."j.clin.invest.112(10):1561-70)、(nivens,m.c.,t.felder等人(2004)"engineeredresistancetocamptothecinandantifolatesbyretroviralcoexpressionoftyrosyldnaphosphodiesterase-iandthymidylatesynthase"cancerchemotherpharmacol53(2):107-15)、(bardenheuer,w.,k.lehmberg等人(2005)."resistancetocytarabineandgemcitabineandinvitroselectionoftransducedcellsafterretroviralexpressionofcytidinedeaminaseinhumanhematopoieticprogenitorcells".leukemia19(12):2281-8)、(kushman,m.e.,s.l.kabler等人(2007)"expressionofhumanglutathiones-transferasep1confersresistancetobenzo[a]pyreneorbenzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiolmutagenesis,macromolecularalkylationandformationofstablen2-gua-bpdeadductsinstablytransfectedv79mzcellsco-expressinghcyp1a1"carcinogenesis28(1):207-14)。根据本发明，在免疫细胞中表达这种抗药性外源序列更具体地允许将所述免疫细胞用在细胞疗法治疗方案(其中将细胞疗法与化学疗法组合)或用于先前用这些药物治疗过的患者。已鉴定了几种抗药性编码序列，其可以潜在地用于赋予根据本发明的抗药性。抗药性编码序列的一个实例可以是(例如)二氢叶酸还原酶(dhfr)的突变体或修饰形式。dhfr是一种参与调节细胞中四氢叶酸量的酶，并且对dna合成至关重要。叶酸类似物，如甲氨蝶呤(mtx)抑制dhfr，因此在临床中用作抗肿瘤剂。已描述了dhfr的不同突变体形式，其对疗法中使用的抗叶酸剂带来的抑制具有增强的抗性。在具体的实施方式中，根据本发明的抗药性编码序列可以是编码人野生型dhfr的突变体形式的核酸序列(genbank：aah71996.1)，其包含至少一种赋予对抗叶酸剂治疗(如甲氨蝶呤)的抗性的突变。在具体的实施方式中，dhfr的突变体形式在位置g15、l22、f31或f34包含至少一个突变氨基酸，优选在位置l22或f31(schweitzer等人(1990)"dihydrofolatereductaseasatherapeutictarget"fasebj4(8):2441-52；国际专利申请wo94/24277；和美国专利us6,642,043)。在具体的实施方式中，所述dhfr突变体形式包含在位置l22和f31的两个突变氨基酸。本文所述的氨基酸位置的对应关系通常以野生型dhfr多肽形式的氨基酸位置表示。在具体的实施方式中，位置15处的丝氨酸残基优选被色氨酸残基替换。在另一具体实施方式中，优选使用会破坏突变体dhfr与抗叶酸剂的结合的氨基酸，优选使用不带电荷的氨基酸残基，如苯丙氨酸或酪氨酸来替换位置22处的亮氨酸残基。在另一具体实施方式中，优选使用小的亲水性氨基酸(如丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸)替换位置31或34处的苯丙氨酸残基。抗药性编码序列的另一个实例也可以是肌苷-5'-单磷酸脱氢酶ii(impdh2)(鸟苷核苷酸的从头合成中的限速酶)的突变体或修饰形式。impdh2的突变体或修饰形式是impdh抑制剂抗性基因。impdh抑制剂可以是霉酚酸(mpa)或其前药霉酚酸酯(mmf)。突变体impdh2可以在野生型人类impdh2(genebank：np_000875.2)的map结合位点中包含至少一个(优选两个)突变，从而导致对impdh抑制剂的抗性显著增加。这些变体中的突变优选位于位置t333和/或s351(yam,p.,m.jensen等人(2006)"exvivoselectionandexpansionofcellsbasedonexpressionofamutatedinosinemonophosphatedehydrogenase2afterhivvectortransduction:effectsonlymphocytes,monocytes,andcd34+stemcells"mol.ther.14(2):236-44)(jonnalagadda,m.等人(2013)"engineeringhumantcellsforresistancetomethotrexateandmycophenolatemofetilasaninvivocellselectionstrategy."plosone8(6):e65519)。另一种抗药性编码序列是钙调磷酸酶的突变体形式。钙调磷酸酶(pp2b-ncbi：acx34092.1)是一种普遍表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其参与许多生物过程并且是t细胞活化的核心。钙调磷酸酶是由催化亚基(cna；三种同种型)和调节亚基(cnb；两种同种型)组成的异二聚体。在t细胞受体接合后，钙调磷酸酶使转录因子nfat去磷酸化，使其易位至细胞核和活性关键靶基因，如il2。与fkbp12复合的fk506或与cypa复合的环孢菌素a(csa)阻断nfat进入钙调磷酸酶的活性位点，防止其去磷酸化并借此抑制t细胞活化(brewin等人(2009)"generationofebv-specificcytotoxictcellsthatareresistanttocalcineurininhibitorsforthetreatmentofposttransplantationlymphoproliferativedisease"blood114(23):4792-803)。在具体实施方式中，所述突变体形式可在位置：v314、y341、m347、t351、w352、l354、k360包含野生型钙调磷酸酶异二聚体a的至少一个突变氨基酸，优选在位置t351和l354或者v314和y341处包含双突变。在具体的实施方式中，位置341处的缬氨酸残基可以用赖氨酸或精氨酸残基替换，位置341处的酪氨酸残基可以用苯丙氨酸残基替换；位置347处的甲硫氨酸可以用谷氨酸、精氨酸或色氨酸残基替换；位置351的苏氨酸可以用谷氨酸残基替换；位置352处的色氨酸残基可以用半胱氨酸、谷氨酸或丙氨酸残基替换，位置353处的丝氨酸可以用组氨酸或天冬酰胺残基替换，位置354处的亮氨酸可以用丙氨酸残基替换；位置360处的赖氨酸可以用丙氨酸或苯丙氨酸残基替换。在另一个具体的实施方式中，所述突变体形式可以在位置：v120、n123、l124或k125处包含野生型钙调磷酸酶异二聚体b的至少一个突变氨基酸，优选在位置l124和k125处包含双突变。在具体的实施方式中，位置120处的缬氨酸可以用丝氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基替换；位置123处的天冬酰胺可以用色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸或丝氨酸替换；位置124处的亮氨酸可以用苏氨酸残基替换；位置125处的赖氨酸可以用丙氨酸、谷氨酸、色氨酸替换，或者可以在氨基酸序列中第125位的赖氨酸后加入两个残基，如亮氨酸-精氨酸或异亮氨酸-谷氨酸。本文所述的氨基酸位置的对应关系通常以野生型人类钙调磷酸酶异二聚体b多肽(ncbi：acx34095.1)形式的氨基酸位置表示。另一种抗药性编码序列是编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hagt)的0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(mgmt-uniprotkb：p16455)。agt是一种dna修复蛋白，其赋予对烷化剂细胞毒性作用的抗性，所述烷化剂如亚硝基脲和替莫唑胺(tmz)。6-苄基鸟嘌呤(6-bg)是一种agt抑制剂，其增强亚硝基脲的毒性，并且与tmz共施用以增强该药剂的细胞毒性作用。编码agt变体的mgmt的几种突变体形式对6-bg的失活具有高度抗性，但保留了它们修复dna损伤的能力(maze,r.等人(1999)"retroviral-mediatedexpressionofthep140a,butnotp140a/g156a,mutantformofo6-methylguaninednamethyltransferaseprotectshematopoieticcellsagainsto6-benzylguaninesensitizationtochloroethylnitrosoureatreatment"j.pharmacol.exp.ther.290(3):1467-74)。在具体实施方式中，agt突变体形式可包含野生型agt位置p140的突变氨基酸。在优选的实施方式中，位置140处的所述脯氨酸被赖氨酸残基替换。另一种抗药性编码序列可以是多药抗性蛋白(mdr1)基因。该基因编码膜糖蛋白，称为p-糖蛋白(p-gp)，参与代谢副产物跨细胞膜的转运。p-gp蛋白对几种结构不相关的化学治疗剂显示出广泛的特异性。因此，通过编码mdr-1的核酸序列的表达可赋予细胞抗药性(genebanknp_000918)。另一种抗药性编码序列可有助于产生细胞毒性抗生素，如来自ble或mcra基因的那些。在暴露于相应的化学治疗剂博来霉素和丝裂霉素c时，免疫细胞中ble基因或mcra的异位表达提供了选择性优势(belcourt,m.f.(1999)“mitomycinresistanceinmammaliancellsexpressingthebacterialmitomycincresistanceproteinmcra”.pnas.96(18):10489-94)。另一种抗药性编码序列可来自基因编码的药物靶标的突变形式，如lorenzm.c.等人(1995)“tormutationsconferrapamycinresistancebypreventinginteractionwithfkbp12-rapamycin”thejournalofbiologicalchemistry270,27531-27537所述的赋予雷帕霉素抗性的mtor的突变变体(mtormut)或者leek.c.等人(2010)“lckisakeytargetofimatinibanddasatinibint-cellactivation”,leukemia,24:896–900所述的赋予格列卫抗性的lck的某些突变变体(lckmut)。如上所述，该方法的遗传修饰步骤可包含将外源核酸引入细胞的步骤，外源核酸包含编码抗药性编码序列的至少一种序列和一部分内源基因，以便在内源基因和外源核酸之间发生同源重组。在具体实施方式中，所述内源基因可以是野生型“抗药性”基因，以便在同源重组后，野生型基因被赋予药物抗性的基因的突变体形式所替换。增强体内免疫细胞的持久性根据本方法的一个方面，整合到免疫细胞基因组基因座中的外源序列编码增强免疫细胞持久性的分子，尤其是肿瘤环境中的体内持久性。“增强持久性”是指延长免疫细胞在寿命方面的存活，特别是一旦将工程化的免疫细胞注入患者体内时。例如，如果修饰细胞的平均存活明显长(长至少10％，优选20％，更优选30％，甚至更优选50％)于未修饰细胞的存活时间，则持久性得到增强。当免疫细胞是同种异体时，这尤其相关。这可以通过引入在细胞膜上或通过细胞膜异位表达和/或分泌免疫抑制多肽的编码序列来产生局部免疫保护来完成。各种这样的多肽，特别是免疫检查点的拮抗剂、来自病毒包膜的免疫抑制肽或nkg2d配体可以增强同种异体免疫细胞的持久性和/或向患者体内的植入。根据一个实施方式，由所述外源编码序列编码的免疫抑制多肽是细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4，又名cd152，genbank登录号af414120.1)的配体。所述配体多肽优选为抗ctla-4免疫球蛋白，如ctla-4aig和ctla-4big或其功能变体。根据一个实施方式，由所述外源编码序列编码的免疫抑制多肽是pd1的拮抗剂，如pd-l1(其他名称：cd274，程序性细胞死亡1配体；参考对人多肽序列q9nzq7的uniprot)，其编码290个氨基酸的i型跨膜蛋白，所述跨膜蛋白由igv样结构域、igc样结构域、疏水跨膜结构域和30个氨基酸的细胞质尾组成。pd-l1配体的这种膜-结合形式在本发明中是指天然形式(野生型)或截短形式，如(例如)通过去除胞内域或具有一个或多个突变(wangs等人,2003,jexpmed.2003；197(9):1083–1091)。值得注意的是，pd1不被认为是根据本发明的膜结合形式的pd-l1配体。根据另一实施方式，所述免疫抑制多肽处于分泌形式。通过将pd-l1的胞外域融合至免疫球蛋白的fc部分，可以产生这种重组分泌的pd-l1(或可溶性pd-l1)(hailest等人,2014,cancerimmunol.res.2(7):610–615；songmy等人,2015,gut.64(2):260-71)。这种重组pd-l1可以中和pd-1并且消除pd-1介导的t细胞抑制。pd-l1配体可与ctla4ig共表达，以进一步增强两者的持久性。根据另一实施方式，外源序列编码包含病毒env免疫抑制结构域(isu)的多肽，其衍生自(例如)hiv-1、hiv-2、siv、momulv、htlv-i、-ii、mpmv、srv-1、合胞素1或2、herv-k或felv。下表1显示了可以在本发明中表达的来自不同病毒的isu结构域的变体。表1：来自不同病毒的isu域变体根据另一实施方式，外源序列编码fp多肽，如gp41。下表2展示了来自天然和人工来源的几种fp多肽。表2：来自天然和人工来源的fp多肽的氨基酸序列根据另一实施方式，外源序列编码非人mhc同源物，特别是病毒mhc同源物，或嵌合β2m多肽，如margalita.等人(2003)“chimericβ2microglobulin/cd3ζpolypeptidesexpressedintcellsconvertmhcclassipeptideligandsintotcellactivationreceptors:apotentialtoolforspecifictargetingofpathogeniccd8+tcells”int.immunol.15(11):1379-1387所述的。根据一个实施方式，外源序列编码nkg2d配体。一些病毒(如巨细胞病毒)已获得了通过分泌能够结合nkg2d配体并阻止其表面表达的蛋白质来避免nk细胞介导的免疫监视并干扰nkg2d途径的机制(welte,s.a等人(2003)“selectiveintracellularretentionofvirallyinducednkg2dligandsbythehumancytomegalovirusul16glycoprotein”.eur.j.immunol.,33,194–203)。在肿瘤细胞中，一些机制已演变为通过分泌nkg2d配体，如ulbp2、micb或mica来逃避nkg2d响应(salihhr,antropiush,giesekef,lutzsz,kanzl等人(2003)functionalexpressionandreleaseofligandsfortheactivatingimmunoreceptornkg2dinleukemia.blood102:1389–1396)。根据一个实施方式，外源序列编码细胞因子受体，如il-12受体。il-12是熟知的免疫细胞活化的活化剂(curtisj.h.(2008)“il-12producedbydendriticcellsaugmentscd8+tcellactivationthroughtheproductionofthechemokinesccl1andccl171”.thejournalofimmunology.181(12):8576-8584)。根据一个实施方式，外源序列编码抗抑制性肽或蛋白质的抗体。所述抗体优选由免疫细胞以可溶形式分泌。在这一方面，来自鲨鱼和骆驼的纳米抗体是有利的，因为它们被构造为单链抗体(muyldermanss.(2013)“nanobodies:naturalsingle-domainantibodies”annualreviewofbiochemistry82:775-797)。它们也被认为更容易与分泌信号多肽和可溶性亲水结构域融合。当通过破坏编码β2m或另一种mhc组分的内源基因引入外源编码序列时，上述开发用于增强细胞持久性的不同方面是特别优选的。更具体的实施方式涉及nk细胞抑制剂的整合以增强本发明的工程化t细胞的持久性，其基于本说明书中详细说明的并且在图17至图21和实施例3中更具体说明的方法。具体地，本发明还提供了制备用于细胞免疫疗法的工程化原代免疫细胞的方法，所述方法包括：–提供包含t细胞，优选原代t细胞的细胞群，–向所述t细胞的一部分中引入：i)至少一种核酸，其包含在所选内源基因座处整合的外源多核苷酸序列以编码至少一种nk细胞抑制剂；ii)特异性靶向所述选定的内源基因座的至少一种序列特异性试剂，其中通过靶向基因整合将所述外源多核苷酸序列插入所述内源基因座。nk细胞抑制剂表示体内或与免疫细胞共培养时，赋予同种异体t细胞抵抗通过nk细胞的消耗的保护作用的多肽。例如，在图17的图上观察到了无nk细胞抑制剂的这种消耗。本文在实施例3中提供了nk细胞抑制剂的实例。优选地，在存在于所述基因座的内源启动子的转录控制下整合优选地包含在实施例3中所提及的序列之一的编码nk细胞抑制剂的外源多核苷酸序列以获得所述nk细胞抑制剂更持续的表达。根据本发明的优选方面，选择在免疫细胞活化期间具有活性的所述内源启动子，如表6中所列的基因座，其被认为在t细胞活化期间活性转录，至少认为对具有嵌合抗原受体(car)的t细胞的活化起反应。根据优选实施方式，在内源基因座处整合编码nk抑制剂的外源序列，通过t细胞激活，其在大于24小时内上调，如选自gzmb、tbx21、plek、chek1、slamf7、zbtb32、tigit、lag3、gzma、wee1、il12rb2、eea1和dtl中的一个。根据优选实施方式，在内源基因座处整合编码nk抑制剂的外源序列，其是组成型表达的，如在tcr基因座。根据本发明，可以有利地在表达mhci组分的插入基因座，具体地在β2m基因座，其也是组成型转录的基因座，整合编码nk抑制剂的外源序列。根据本发明，可以有利地使内源β2m内源编码序列失活，同时使整合的编码nk抑制剂的外源序列在该基因座转录。根据本发明优选的方面，包含所述编码nk抑制剂的外源序列的工程化t细胞具有如在本说明书的不同部分中所述的嵌合抗原受体(car)。可以有利地在tcr基因座处整合所述嵌合抗原受体(car)，同时优选地在β2m基因座处整合编码nk抑制剂的外源序列，借此防止或降低tcr和/或β2m两者的表达。在该方法中使用的序列特异性试剂优选地为如之前在本说明书中所述的或者本领域技术人员已知的稀切核酸内切酶。通常通过同源重组或者向所述免疫细胞的nhej来操作靶向基因整合。所述特异性核酸内切酶试剂优选地选自rna或dna引导的核酸内切酶，如cas9或cpf1、rna或dna向导、tal核酸内切酶、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶或它们的任意组合。在实施例3中所说明的本发明的一个优选实施方式中，已通过限制人t细胞中的位点外切割(offsitecleavage)将tale核酸酶优化并成功用于在β2m基因座进行基因整合。使用多肽序列seqidno:80和/或seqidno:81或者seqidno:82和/或seqidno:83—分别为右和左二聚体的tale核酸酶异二聚体，意外地获得了更好的特异性和效率。因此，本专利申请具体地涉及单独或成对编码那些特异性β2mtalen的以上多肽序列，或者包含含有以下rvd序列之一的tal重复的任何核酸内切酶序列：–hd-hd-nn-ng-nn-nn-hd-hd-ng-ng-ni-nn-hd-ng-nn–hd-hd-ni-nn-nn-hd-hd-ni-nn-ni-ni-ni-nn-ni-nn–ng-ni-nn-hd-ng-nn-ng-nn-hd-ng-hd-nn-hd-nn-hd–nn-nn-ni-ng-ni-nn-hd-hd-ng-hd-hd-ni-nn-nn-hd以及涉及编码这些多肽的任何多核苷酸和载体。此外，本发明的目标在于通过使用特异性识别或结合包含以下靶标序列seqidno:78和seqidno:79之一的β2m基因组序列的核酸内切酶，实施外源序列向t细胞基因组的整合。本发明的目标还在于通过使用特异性识别包含靶标序列seqidno:78和seqidno:79的序列的核酸内切酶，使t细胞中的β2m基因组序列失活。根据本发明，所述编码nk抑制剂的外源序列优选包含编码非多态性i类分子的序列，如hla-g或hla-e或者至少包含来自这些分子的重链的片段。根据优选方面，当在β2m内源基因座处整合时，所述外源序列导致hla-e或hla-g或其片段与β2m片段融合的表达，这通常导致hla-e或hla-g的二聚体或三聚体的表达，如图20中所示和实施例3中举例说明的。根据优选实施方式，所述外源序列编码对选自seqidno:84至90的序列显示出至少80％的氨基酸序列同一性的多肽。编码nk抑制剂的外源序列还可以包含编码病毒逃避素的序列或包含其表位的片段，如来自ul16(也称为ulbp1-uniprotref.:#q9bzm6)或者ul18的序列。考虑到改善t细胞对于过继性细胞免疫疗法的效力和适合性，优选地在β2m操作的编码nk抑制剂的外源序列向t细胞基因组的整合可以与本说明书中所述的其他外源序列插入组合。作为另外一种选择，编码nk抑制剂的外源序列还可以有利地在编码免疫检查点的基因座，如pd1或ctla4(参见本说明书中的完整列表)整合，优选地具有使这些基因失活的作用。在本发明申请的其他处描述了其他成功的基因座的多个实例，其可以适合于赋予工程化细胞其他治疗优势，如(例如)赋予在癌症疗法中常用的抗药性，如dck、hprt或糖皮质激素受体(gr)基因座。因此，本说明书公开了通过如上所述的方法可获得的工程化原代免疫细胞。这些免疫细胞可以具有以下特性：1)工程化t细胞，其包含编码nk抑制剂的外源序列，并且所述外源序列已整合受内源基因启动子的转录控制。2)根据项目1中任一项的工程化t细胞，其中在表6所列的一个基因座选择所述内源基因启动子。3)根据项目1或2中任一项的工程化t细胞，其中所述编码nk抑制剂的外源序列已在β2m基因座处整合。4)根据项目1至3中任一项的工程化t细胞，其中所述t细胞被赋予有嵌合抗原受体。5)根据项目4的工程化t细胞，其具有基因型[tcr]阴性[β2m]阴性[car]阳性6)根据项目4或5的工程化t细胞，其中编码所述car的外源序列已在tcr基因座处整合。7)根据项目1至6中任一项的工程化t细胞，其中所述t细胞是原代细胞。8)根据项目1至7中任一项的工程化t细胞用于治疗癌症或感染的用途。9)治疗有效的免疫细胞群，其包含至少30％，优选50％，更优选80％的根据项目1至8中任一项的工程化t细胞。根据本发明的优选的工程化t细胞包含多核苷酸序列，其与多核苷酸序列seqidno:68、seqidno:70、seqidno:72、seqidno:74或seqidno:76之一共有至少80％，更优选地90％，更优选地95％的同一性(如实施例3中所公开的，三聚体基质在β2m基因座的整合)。结合在本发明申请中所公开的其他基因编辑步骤，本发明的工程化t细胞的优选基因型的实例如下所示：–[car]阳性[tcr]阴性[β2m]阴性[pd1]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[β2m]阴性[dck]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[β2m]阴性[ctla4]阴性本说明书还提供了包含根据本发明的工程细胞的治疗性组合物，具体如下所示：1)根据本发明的治疗有效的免疫细胞群，其中至少30％，优选地50％，更优选地80％的细胞来源于供体，优选地一个单一供体。2)根据以上的原代免疫细胞群，其中大于50％的所述免疫细胞是tcr阴性t细胞。3)如上所述的原代免疫细胞群，其中大于50％的所述免疫细胞是car阳性细胞。4)包含如上所述的工程化免疫细胞群的药物组合物。5)用于治疗对其有需要的患者的方法，其中所述方法包括：–如前所述，制备工程化原代免疫细胞群；–可选地，纯化或分选所述工程化的原代免疫细胞；–在将所述细胞输注到所述患者体内时或之后，活化所述工程化的原代免疫细胞群。6)如上所述的方法，其中对所述患者治疗癌症。7)如上所述的方法，其中对所述患者治疗感染。本发明还提供了通过外源序列向t细胞的整合筛选候选nk抑制剂的方法，如以下所总结的：1)用于识别在t细胞中可表达的适当的编码nk抑制剂的序列的方法，其中所述方法包括至少以下步骤：–提供t细胞，其中tcr和β2m表达两者受抑制和/或失活；–在所述t细胞中，在内源启动子的控制下，在内源基因座处整合编码推定的nk抑制剂的候选序列；–在存在nk细胞的情况下，培养所得的工程化t细胞2)用于识别在t细胞中可表达的适当的编码nk抑制剂的序列的方法，其中所述方法包括至少以下步骤：–提供t细胞，其中tcr表达受抑制或失活；–通过在β2m基因座处整合编码推定的nk抑制剂的候选序列使所述t细胞中的β2m表达失活，所述推定的nk抑制剂的表达在所述β2m基因座的内源启动子的转录控制下–在存在nk细胞的情况下，培养所得的工程化t细胞3)如上所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：–赋予所述t细胞嵌合抗原受体。4)如上所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：–将所述所得的工程化t细胞的存活与不表达所述候选序列的细胞的存活相比较。–可选地，选择对nk细胞更耐受的工程细胞。增强免疫细胞的治疗活性根据本方法的一个方面，整合到免疫细胞基因组基因座中的外源序列编码增强免疫细胞治疗活性的分子。“增强治疗活性”是指相对于选定类型的靶细胞，根据本发明工程化的免疫细胞或细胞群比非工程化的细胞或细胞群更具攻击性。所述靶细胞通常属于确定类型的细胞或细胞群，优选地以共同表面标志物为特征。在本说明书中，“治疗潜力”反映了通过体外实验测量的治疗活性。通常，通过进行细胞溶胞或生长减少测量，将敏感癌细胞系(如daudi细胞)用来评价免疫细胞针对所述细胞的活性是更高还是更低。这也可以通过测量免疫细胞的脱粒水平或者趋化因子和细胞因子的产生来评估。也可以在注射肿瘤细胞的小鼠中并通过监测所得的肿瘤扩增来进行实验。当这些实验中的发育细胞数量被免疫细胞减少超过10％，优选超过20％，更优选超过30％，甚至更优选超过50％时，活性的增强被认为是显著的。根据本发明的一个方面，所述外源序列编码趋化因子或细胞因子，如il-12。表达il-12是特别有利的，因为该细胞因子在文献中被广泛提及为促进免疫细胞活化(colombom.p.等人(2002)“interleukin-12inanti-tumorimmunityandimmunotherapy”cytokinegrowthfactorrev.13(2):155-68)。根据本发明的一个优选方面，外源编码序列编码或促进作用于其他免疫细胞群体(如t调节细胞)的分泌因子，以减轻其对所述免疫细胞的抑制作用。根据本发明的一个方面，所述外源序列编码调节性t细胞活性的抑制剂，其为叉头/翼状螺旋转录因子3(foxp3)的多肽抑制剂，并且更优选为foxp3的细胞穿透肽抑制剂，如称为p60的细胞穿透肽抑制剂(casaresn.等人(2010)“apeptideinhibitoroffoxp3impairsregulatorytcellactivityandimprovesvaccineefficacyinmice.”jimmunol185(9):5150-9)。“调节性t细胞活性的抑制剂”是指由t细胞分泌的分子或所述分子的前体并且其允许t细胞逃避由调节性t细胞对其进行的下调活性。通常，这种调节性t细胞活性的抑制剂具有降低所述细胞中foxp3转录活性的作用。根据本发明的一个方面，所述外源序列编码肿瘤相关巨噬细胞(tam)的分泌的抑制剂，如ccr2/ccl2中和剂。肿瘤-相关巨噬细胞(tam)是肿瘤微环境的关键调节剂。临床病理学研究表明肿瘤中的tam积累与不良的临床结果相关。与该证据一致，实验和动物研究支持tam可以提供有利的微环境以促进肿瘤发育和进展的观点(theerawutc.等人(2014)“tumor-associatedmacrophagesasmajorplayersinthetumormicroenvironment”cancers(basel)6(3):1670–1690)。趋化因子配体2(ccl2)，也称为单核细胞趋化蛋白1(mcp1-ncbinp_002973.1)是一种属于cc趋化因子家族的小细胞因子，由巨噬细胞分泌，其在单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞上产生趋化作用。ccr2(c-c趋化因子受体类型2-ncbinp_001116513.2)是ccl2的受体。增强免疫细胞的特异性和安全性表达嵌合抗原受体(car)已经成为指导或改善原代免疫细胞(如t细胞和nk细胞)用于治疗肿瘤或感染细胞的特异性的现有技术。由这些免疫细胞表达的car特异性地靶向病理细胞表面上的抗原标记物，这进一步协助所述免疫细胞在体内破坏这些细胞(sadelainm.等人“thebasicprinciplesofchimericantigenreceptordesign”(2013)cancerdiscov.3(4):388-98)。car通常被设计为包含刺激免疫细胞以响应与特异性抗原结合的活化结构域(所谓的阳性car)，但它们也可以包含具有相反作用的抑制结构域(所谓的阴性car)(fedorov,v.d.(2014)“novelapproachestoenhancethespecificityandsafetyofengineeredtcells”cancerjournal20(2):160–165。根据存在于靶细胞表面的各种抗原，可以组合或共表达阳性和阴性car以精细调节细胞免疫特异性。通常使用具有提高的转导效率但在随机位置整合的逆转录病毒载体将编码car的基因序列引入细胞基因组中。在本文中，根据本发明，嵌合抗原受体(car)的组分可以通过靶向基因重组引入选定的基因座，更具体地在内源启动子的控制下。根据一个方面，在通过病毒载体将阳性car引入免疫细胞的同时，可以通过靶向基因插入引入阴性car，反之亦然，并且优选仅在免疫细胞活化期间是活性的。因此，抑制性(即阴性)car通过阻止免疫细胞攻击需要保存的特定细胞类型而有助于改善的特异性。还根据这一方面，所述阴性car可以是细胞凋亡car，这意味着所述car包含凋亡结构域，如fasl(cd95-ncbi：np_000034.1)或其功能变体，其转导诱导细胞死亡的信号(eberstadtm；等人"nmrstructureandmutagenesisofthefadd(mort1)death-effectordomain"(1998)nature.392(6679):941–5)。因此，根据本发明插入的外源编码序列可编码具有直接、与其他化合物组合或通过活化其他化合物而诱导细胞死亡的能力的因子。作为增强原代免疫细胞的安全性的另一种方式，外源编码序列可以编码赋予免疫细胞对药物或其他外源底物的敏感性的分子。这些分子可以是细胞色素，如来自p450家族(preissners等人(2010)“supercyp:acomprehensivedatabaseoncytochromep450enzymesincludingatoolforanalysisofcyp-druginteractions”.nucleicacidsres38(databaseissue):d237-43)，如cyp2d6-1(ncbi-np_000097.3)、cyp2d6-2(ncbi-np_001020332.2)、cyp2c9()、cyp3a4(ncbi-np_000762.2)、cyp2c19(ncbi-np_000760.1)或cyp1a2(ncbi-np_000752.2.)，其赋予免疫细胞对药物(如环磷酰胺和/或异磷酰胺)的高敏感性。根据本发明的其他方面，为控制潜在的细胞因子释放综合征(crs)，在工程化免疫细胞中引入外源序列以用于其表达，特别是体内表达，以减少il-6或il-8反式信号转导。这种外源序列可以编码(例如)针对il-6或il-8或者针对其受体il-6r或il-8r的抗体[shannon,l.等人(2014)managingcytokinereleasesyndromeassociatedwithnoveltcell-engagingtherapies.cancerj.20(2):119–122]。更具体地，可以通过干扰作为crs的一个组分的巨噬细胞活化综合征来减轻细胞因子释放综合征(crs)[lee,d.w.等人(2014)currentconceptsinthediagnosisandmanagementofcytokinereleasesyndrome.blood.124:188-195]。为了实现该目标，本发明包括整合编码il1或il18活化途径的拮抗剂的外源序列，如il1ra(uniprot#p18510)或il18bp(uniprot#o95998)或其活性片段或变体。“il1和il18活化途径的拮抗剂”表示能够干扰il1或il18的更高表达的任何多肽。因此，本发明提供了用于产生治疗性细胞的方法，其中在所选的基因座，具体地pd1、cd25或cd69整合编码il1ra或il18bp的外源序列，并且更优选地结合可选地在tcr和/或pd1基因座处整合的car的表达。优选的外源序列编码已通过药物管理局批准的拮抗剂或抗体，如以下列名称和参考文献上市的那些：–阿那白滞素(cas登记号：143090-92-0)(商标名kineret)是白介素1受体拮抗剂(il1-ra)的重组形式。阿那白滞素是il1ra的变体形式，因为它通过在其氨基末端添加单个蛋氨酸残基而不同于天然人il-1ra。阿那白滞素阻断天然存在的il-1的生物活性[kalliolias,gd.等人(2008)thefutureoftheil-1receptorantagonistanakinra:fromrheumatoidarthritistoadult-onsetstill'sdiseaseandsystemic-onsetjuvenileidiopathicarthritis.expertopininvestigdrugs.17(3):349–59]。–利纳西普(cas登记号：501081-76-1)也称为il-1trap(regeneronpharmaceuticals以商标名arcalyst上市)也是白介素1抑制剂。它是二聚体融合蛋白，由人白介素-1受体组分(il-1r1)的胞外部分的配体-结合域和结合并中和il-1的人igg1的可结晶片段部分(fc区)串联连接的il-1受体辅助蛋白(il-1racp)组成[mcdermott,m.f.,(2009)rilonaceptinthetreatmentofchronicinflammatorydisorders.drugsoftoday.45(6):423-430]。–卡那津单抗(商标名ilaris-cas登记号：914613-48-2)是靶向白介素-1β的人单克隆抗体。它与白介素-1家族的其他成员，包括白介素-1α无交叉反应性[rondeauj.m.等人(2015)themolecularmodeofactionandspeciesspecificityofcanakinumab,ahumanmonoclonalantibodyneutralizingil-1β.mabs.7(6):1151–60]。–托珠单抗(商标名actemra-cas登记号：375823-41-9)是抗白介素-6受体(il-6r)的人源化单克隆抗体[venkiteshwaran,a.(2009)tocilizumab.mabs.1(5):432–438]。–司妥昔单抗(商标名sylvant-cas登记号：541502-14-1)是抗il-6嵌合单克隆抗体或cclb8是结合至白介素-6的嵌合(由人和小鼠蛋白制成)单克隆抗体[rhee,f.等人(2010)siltuximab,anovelanti-interleukin-6monoclonalantibodyforcastleman'sdisease.journalofclinicaloncology28(23):3701–3708]。根据优选的方面，所述外源序列可以编码gp130的可溶性胞外域，如显示出与seqidno:61具有至少80％同一性的可溶性胞外域。rose-johns.[thesolubleinterleukinereceptor:advancedtherapeuticoptionsininflammation(2017)clinicalpharmacology&therapeutics,102(4):591-598]描述了gp130的此种可溶性胞外域，其可以与免疫球蛋白片段，如sgp130fc(seqidno:62)融合。如前所述，所述外源序列可通过定点突变(即使用序列特异性核酸酶试剂)稳定整合到基因组中并且置于在免疫细胞活化期间具有活性的基因座处的内源启动子的转录活性之下，如表6、8或9中所列的那些，并且优选在car活化后上调或是car依赖性的。根据更优选的实施方式，将外源序列引入car阳性免疫细胞，如表达抗cd22cart细胞多核苷酸序列(如seqidno:31)的免疫细胞。根据一些更具体的实施方式，将编码可以与il-6受体家族的细胞因子受体联合并且优选干扰il-6受体家族的细胞因子受体的多肽的所述外源序列整合在pd1、cd25或者cd69基因座上，所述il-6受体家族的细胞因子受体如所述gp130的可溶性胞外域。根据本发明，编码pd1基因座的内源序列优选被所述外源序列破坏。因此，本发明提供了在细胞免疫疗法中治疗或减少crs的方法，其中将细胞或其治疗组合物施用于患者，所述细胞经遗传修饰以分泌多肽，所述多肽包含gp130的可溶性胞外域、sgp130fc、抗il-6或抗il6r抗体、抗il-8或抗il8r抗体或其任何融合体。工程化免疫细胞的优选基因型的实例为：–[car]阳性itive[gp130]阳性itive–[car]阳性[gp130]阳性[tcr]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[gp130]阳性[pd1]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[gp130]阳性[β2m]阴性–[car]阳性[gp130]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[gp130]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[sgp130]阳性–[car]阳性[sgp130]阳性[tcr]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[sgp130]阳性[pd1]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[sgp130]阳性[β2m]阴性–[car]阳性[sgp130]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il1ra]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[il1ra]阳性–[car]阳性[il1ra]阳性[tcr]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il1ra]阳性[pd1]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il1ra]阳性[β2m]阴性–[car]阳性[il1ra]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il18bp]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il18bp]阳性[pd1]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il18bp]阳性[β2m]阴性–[car]阳性[il18bp]阳性[cd25]阴性–[car]阳性[tcr]阴性[il18bp]阳性[cd25]阴性使用aav载体改善原代免疫细胞中基因靶向插入的效率本说明书提供了如图所示的供体模板和序列特异性试剂，它们对于进行编码序列与内源启动子(具体地pd1和cd25)在框内的有效插入是有用的，并且提供了用于检测所述外源序列在所述基因座处的正确插入的方法和序列。根据本发明的供体模板通常是多核苷酸序列，其可以包括在本领域中描述的多种载体中，以在核酸内切酶试剂活化时迅速将供体模板递送到细胞核中，以通常通过nhej或同源重组获得它们向基因组中的定点插入。具体地，本发明提供了用于在pd1基因座处表达il-15(seqidno:59)的特异性供体多核苷酸，其包含以下序列中的一个或几个：–编码il-15的序列，如与seqidno:50呈现同一性的序列；–与pd1基因座同源的上游和下游(也称为左和右)序列，优选包含多核苷酸序列seqidno:45和seqidno:46；–可选地，编码il-15受体(sil-15r)的可溶形式的序列，如与seqidno:50呈现同一性的序列；–可选地，至少一个2a肽切割位点，如seqidno:53(f2a)、seqidno:54(p2a)和/或seqidno:55(t2a)中的一个。具体地，本发明提供了用于在pd1基因座处表达il-12(seqidno:58)的特异性供体多核苷酸，其包含以下序列中的一个或几个：–编码il-12a的序列，如与seqidno:47呈现同一性的序列；–与pd1基因座同源的上游和下游(也称为左和右)序列，优选包含多核苷酸序列seqidno:45和seqidno:46；–可选地，编码il-12b的序列，如与seqidno:48呈现同一性的序列；–可选地，至少一个2a肽切割位点，如seqidno:53(f2a)、seqidno:54(p2a)和/或seqidno:55(t2a)中的一个。具体地，本发明提供了用于在pd1基因座处表达可溶性gp130(seqidno:61)的特异性供体多核苷酸，其包含以下序列中的一个或几个：–编码可溶性gp130(优选与fc融合的可溶性gp130)的序列，如与seqidno:62呈现同一性的序列；–与pd1基因座同源的上游和下游(也称为左和右)序列，优选包含多核苷酸序列seqidno:45和seqidno:46；–可选地，至少一个2a肽切割位点，如seqidno:53(f2a)、seqidno:54(p2a)和/或seqidno:55(t2a)中的一个。具体地，本发明提供了用于在cd25基因座处表达il-15(seqidno:59)的特异性供体多核苷酸，其包含以下序列中的一个或几个：–编码il-15的序列，如与seqidno:50呈现同一性的序列；–与cd25基因座同源的上游和下游(也称为左和右)序列，优选包含多核苷酸序列seqidno:43和seqidno:44；–可选地，编码il-15受体(sil-15r)的可溶形式的序列，如与seqidno:50呈现同一性的序列；–可选地，至少一个2a肽切割位点，如seqidno:53(f2a)、seqidno:54(p2a)和/或seqidno:55(t2a)中的一个。具体地，本发明提供了用于在cd25基因座处表达il-12(seqidno:58)的特异性供体多核苷酸，其包含以下序列中的一个或几个：–编码il-12a的序列，如与seqidno:47呈现同一性的序列；–与cd25基因座同源的上游和下游(也称为左和右)序列，优选包含多核苷酸序列seqidno:43和seqidno:44；–可选地，编码il-12b的序列，如与seqidno:48呈现同一性的序列；–可选地，至少一个2a肽切割位点，如seqidno:53(f2a)、seqidno:54(p2a)和/或seqidno:55(t2a)中的一个。具体地，本发明提供了用于在cd25基因座处表达可溶性gp130(seqidno:61)的特异性供体多核苷酸，其包含以下序列中的一个或几个：–编码可溶性gp130(优选与fc融合的可溶性gp130)的序列，如与seqidno:62呈现同一性的序列；–与cd25基因座同源的上游和下游(也称为左和右)序列，优选包含多核苷酸序列seqidno:43和seqidno:44；–可选地，至少一个2a肽切割位点，如seqidno:53(f2a)、seqidno:54(p2a)和/或seqidno:55(t2a)中的一个。如在本文的实例中所述的，本发明人通过使用aav载体，特别是来自aav6家族的载体，显著改善了基因靶向插入人类细胞的速率。因此，本发明的一个广泛方面是人原代免疫细胞中aav载体的转导连同序列特异性核酸内切酶试剂(如tale核酸内切酶)的表达，更优选以mrna形式引入，从而增加这些细胞中的同源重组事件。根据本发明的一个方面，序列特异性核酸内切酶试剂可通过转染引入细胞，更优选通过编码所述序列特异性核酸内切酶试剂(如tale核酸酶)的mrna的电穿孔引入。仍然根据这一广泛的方面，本发明更具体地提供了将外源核酸序列插入细胞中的内源多核苷酸序列的方法，其包含至少以下步骤：–将aav载体转导到所述细胞中，该aav载体包含所述外源核酸序列和与靶向的内源dna序列同源的序列，和–诱导序列特异性核酸内切酶试剂的表达，以在插入的基因座切割所述内源序列。获得的外源核酸序列的插入可导致遗传物质的引入、内源序列的修正和替换，更优选地，相对于该基因座处的内源基因序列是“框内”的。根据本发明的另一方面，每个细胞转导了105至107、优选106至107、更优选约5.106个病毒基因组。根据本发明的另一方面，可以用蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)处理细胞，以进一步协助同源重组。作为本发明的一个目标，所述方法中使用的aav载体可以包含无启动子的外源编码序列，如本说明书中提及的任何一种，以便将其置于从本说明书中列出的基因座中选择的一个基因座处的内源启动子的控制下。作为本发明的一个目标，所述方法中使用的aav载体可包含2a肽切割位点，之后是形成外源编码序列的cdna(减去起始密码子)。作为本发明的一个目标，所述aav载体包含编码嵌合抗原受体的外源序列，特别是抗cd19car、抗cd22car、抗cd123car、抗cs1car、抗ccl1car、抗hsp70car、抗gd3car或抗ror1car。因此，本发明涵盖了设计用于实施本文所述方法的任何aav载体，特别是包含与插入的基因座同源的序列的载体，所述插入的基因座位于对表4中所提及的t细胞活化起反应的任何内源基因中。本领域已知的多种其他载体，如质粒、附加型载体、线性dna基质等也可以按照本发明的教导使用。如前所述，根据本发明使用的dna载体优选包含：(1)包含要通过同源重组而被插入的外源编码序列的所述外源核酸，和(2)编码促进所述插入的序列特异性核酸内切酶试剂的序列。根据更优选的方面，(1)所述外源核酸不包含任何启动子序列，然而(2)下的序列具有其自己的启动子。根据更优选的方面，(1)下的核酸包含内部核糖体进入位点(ires)或“自切割”2a肽，如t2a、p2a、e2a或f2a，从而使得插入外源编码序列的内源基因变成多顺反子。2a肽的ires可以在所述外源编码序列之前或之后。本发明的优选载体是衍生自aav6的载体，其包含如本文先前所述或在实验部分和图中说明的供体多核苷酸。根据本发明的载体的实例包括与序列seqidno:37(用于将编码il-15的序列整合到cd25基因座的基质)、seqidno:38(用于将编码il-15的序列整合到pd1基因座的基质)、seqidno:39(用于将编码il-12的序列整合到cd25基因座的基质)、seqidno:40(用于将编码il-12的序列整合到pd1基因座的基质)、seqidno:69(用于hlaevmaprtlfl肽的整合的基质)、seqidno:71(用于hlaevmaprtlil肽的整合的基质)、seqidno:73(用于将ul18actine肽整合到b2m基因座的基质)、seqidno:75(用于在b2m基因座插入的ul18hlacw肽的整合的基质)和seqidno:77(用于ul18_βhlag肽向β2m基因座处整合的基质)具有同一性的多核苷酸或由其组成。在内源启动子的转录控制下，免疫细胞中的基因靶向整合本发明的主要方面之一是利用免疫细胞的内源转录活性来表达改善其治疗潜力的外源序列。基于内源启动子的转录活性谱并且基于对于实施本发明有用的启动子基因座的选择，本发明提供了几种实施方式。优选的基因座是，当细胞被赋予car时，在免疫细胞活化时，特别是对car活化起反应时(car敏感性启动子)，转录活性通常很高的那些基因座。因此，本发明提供了用于产生同种异体治疗性免疫细胞的方法，其通过在tcr基因座处表达编码car的第一外源序列，借此破坏tcr表达，和在内源基因座的转录活性下表达第二外源编码序列，这优选地依赖于以下任一者：–cd3/cd28活化，如免疫磁珠，其对于(例如)促进细胞扩增是有用的；–car活化，如通过cd3zeta途径，其对于(例如)活化免疫细胞在靶标上起作用是有用的；–与疾病症状或分子标志物的出现相关的转录活性，例如，其对于在患病器官中原位活化细胞是有用的；–细胞分化，其对于在给定的分化水平下赋予细胞治疗特性或将蛋白质表达成特定谱系是有用的(见图1)，例如，在造血细胞获得它们的免疫功能时；或/和–tme(肿瘤微环境)，其对于重定向细胞活性及其扩增至特定肿瘤条件(缺氧、低葡萄糖……)，或对于预防疲劳和/或维持活化是有用的；–crs(细胞因子释放综合征)，其对于减轻与cart细胞活性相关的不良事件是有用的。本发明人已建立了内源基因的第一列表(表6)，其已发现这些基因特别适合于应用根据本发明的靶向基因重组。为了绘制该表，他们查阅了几个转录组鼠科数据库，具体地(2013)“transcriptionalinsightsintothecd8(+)tcellresponsetoinfectionandmemorytcellformation”nat.immunol..14(4):404-12中提及的来自免疫基因组计划联盟的转录组小鼠数据库，其允许在响应卵白蛋白抗原而t细胞活化时比较多种基因的转录水平。另外，因为相对于人类t细胞活化，可用数据很少，因此他们不得不从这些数据中进行外推和分析，并通过研究与人类基因相关的现有文献与人类情况进行比较。选择的基因座与编码car的序列的插入特别相关。基于表6的第一选择，他们基于其预期的表达谱进行后续的基因选择(表7至10)。另一方面，本发明人已鉴定了几乎无活性的转录基因座的选择，其对于插入表达盒以在外源启动子的转录控制下表达外源编码序列将是最合适的。这些基因座被称为“安全港基因座”，因为它们几乎是无转录活性的，特别是在t细胞活化期间。它们对于通过最大程度降低干扰免疫细胞基因组表达的风险来整合编码序列是有用的。在免疫细胞活化期间具有稳定活性的内源启动子的控制下的基因靶向插入表7中列出了与该实施方式有关的内源基因座的选择。因此，本发明的方法提供了在内源启动子控制下进行基因靶向插入的步骤，所述内源启动子在免疫细胞活化期间始终是活性的，所述内源启动子优选来自选自cd3g、rn28s1、rn18s、rn7sk、actg1、β2m、rpl18a、pabpc1、gapdh、rpl17、rpl19、rplp0、cfl1和pfn1的内源基因。“稳定活性的”是指在原代免疫细胞中观察到的这些启动子的转录活性不受免疫细胞活化时负调控作用的影响。如其他地方报道的(acuto,o.(2008)“tailoringt-cellreceptorsignalsbyproximalnegativefeedbackmechanisms”.naturereviewsimmunology8:699-712)，存在于tcr基因座的启动子在tcr接合时经受不同的负反馈机制，因此在本发明的方法期间可能不具有稳定活性或不会上调。本发明在某种程度上设计以避免使用tcr基因座作为t细胞活化期间表达的外源编码序列的可能插入位点。因此，根据本发明的一个方面，外源编码序列的靶向插入不在tcrα或tcrβ基因座进行。可以在稳定活性的内源启动子的控制下有利地在这些基因座处引入的外源编码序列的实例是编码或正调控细胞因子、趋化因子受体、赋予药物抗性的分子、共刺激配体(如4-1brl和ox40l)或分泌性抗体的生产的那些外源编码序列。依赖于免疫细胞活化或依赖于car活化的内源启动子下的基因整合如前所述，本发明的方法提供了在内源启动子控制下进行基因靶向插入的步骤，所述内源启动子的转录活性优选免疫细胞活化时被上调，该上调是瞬时的或超过10天。“免疫细胞活化”是指对于给定类型的免疫细胞，根据一般描述且通常在文献中已建立的机制产生免疫应答。例如，对于t细胞，t细胞活化的特征通常在于由下列细胞表面表达组成的变化之一：产生多种蛋白质(包括cd69、cd71和cd25(也是treg细胞的标志物)和hla-dr(人t细胞活化的标志物))、释放穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素(脱粒)或者产生细胞因子效应子ifn-γ、tnf和lt-α。根据本发明的优选实施方式，内源基因的转录活性在免疫细胞中上调，特别是响应于car的活化。car可以在免疫细胞中独立表达。“独立表达”是指car可以(例如)使用逆转录病毒载体(如慢病毒载体)从所引入的外源表达盒在免疫细胞中转录，或者通过电穿孔转染编码这种car的加帽信使rna在免疫细胞中转录。本领域已知多种方法将car表达到免疫细胞中，如，例如(ref.)所述的。转录活性上调的所述内源基因特别适合于外源序列的整合以编码细胞因子，如il-12和il-15、免疫原性肽或分泌性抗体，如抗ido1、抗il10、抗pd1、抗pdl1、抗il6或抗pge2抗体。根据本发明的一个优选实施方式，对于其转录活性响应于car活化且更优选地依赖于car活化而选择内源启动子。如本文所示，cd69、cd25和pd1是这样的基因座，其特别适合于免疫细胞被活化时要表达的外源编码序列的插入或表达，尤其是向car阳性免疫细胞中的插入。因此，本发明将把car表达至免疫细胞中的任何方法与在基因座处进行定点插入外源编码序列的步骤组合，其转录活性响应或依赖于所述car与肿瘤抗原的接合。特别是，所述方法包括以下步骤：在选自pd1、cd25和cd69启动子中的一种启动子的转录控制下，向car阳性或重组tcr阳性免疫细胞中引入编码il-12或il-15的外源序列。特别地，通过按照以下步骤可以获得car阳性细胞：将编码car的至少一种外源序列以及置于内源启动子下的另一外源序列共表达至免疫细胞(优选原代细胞，更优选原代t细胞)中，所述内源启动子的转录活性依赖于所述car，如pd1、cd25或cd71。表述“依赖于所述car”是指，通常在抗原超过细胞表面存在的car数量并且在细胞表面表达的car数量超过10个/细胞(优选超过100个，更优选超过1000个分子/细胞)的情况下，由于car与其同源抗原的接合，所述内源启动子的转录活性必须增加超过10％，优选超过20％，更优选超过50％，以及甚至更优选超过80％。因此，本发明教导了car序列的表达，优选插入在tcr基因座并且组成型表达的，而响应于或依赖于所述car与其同源抗原的接合，整合在另一基因座的另一外源序列被共表达。所述另一个基因座(例如)是cd25、pd1或cd71或在car活化时特异性转录的任何基因座。换言之，本发明提供了car和至少一种外源编码序列的共表达，所述外源序列的表达受内源启动子的控制，该内源启动子的转录活性受car活性的影响，这是为了获得赋予更好的免疫响应的工程化的免疫细胞而完成的。如先前所述，这可以通过用序列特异性核酸酶试剂以及供体模板转染细胞来进行，所述核酸酶试剂靶向特异性car依赖性的这些基因座的编码区，所述供体模板包含与所述基因组区同源的序列。所述序列特异性核酸酶试剂协助要通过同源重组或nhej来整合的供体模板。根据优选的实施方式，外源编码序列与内源基因框内整合，以便保留所述内源基因的表达。例如，在本文实验部分的至少一个实施例中，相对于cd25和cd69就是这种情况。根据优选的实施方式，外源序列破坏基因的内源编码序列以阻止其表达一种内源编码序列，特别是在这种表达对免疫细胞功能具有副作用时，如(例如)本文实验部分中pd1的情况。根据甚至更优选的实施方式，破坏内源基因序列的外源编码序列与内源启动子置于框内，从而使得其表达依赖于所述内源启动子，还如实验部分所示。本发明还涉及编码本专利申请中举例说明的不同的tal核酸酶的多核苷酸和多肽序列以及它们各自的靶标和rvd序列，所述多核苷酸和多肽序列尤其是允许在cd25基因座(seqidno:18和19)处定点插入的那些。本发明还包括用于免疫细胞转染的试剂盒，其包含编码序列特异性核酸内切酶试剂的多核苷酸以及设计成将外源序列整合在通过所述试剂靶向的基因座上的供体序列。这些试剂盒的实例是：包含编码靶向pd1基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：pd1)及含有编码il-12的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向pd1基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：pd1)及含有编码il-15的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向cd25基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：cd25)及含有编码il-12的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向cd25基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：cd25)及含有编码il-15的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向pd1基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：pd1)及含有编码可溶性gp130的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向cd25基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：cd25)及含有编码可溶性gp130的外源序列的aav载体的试剂盒，以及包括靶向表6中所列基因的核酸内切酶试剂及用于引入本说明书中提及的编码序列的供体基质的任何试剂盒。这些试剂盒的其他实例是：包含编码靶向pd1基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：pd1)及含有编码il-12的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向pd1基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：pd1)及含有编码il-15的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向cd25基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：cd25)及含有编码il-12的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向cd25基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：cd25)及含有编码il-15的外源序列的aav载体的试剂盒，包含编码靶向β2m基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：β2m)及含有编码nk抑制剂的外源序列，如含有来自hla-e或hla-g的重链的aav载体的试剂盒，包含编码靶向β2m基因座的稀切核酸内切酶的mrna(例如：β2m)及含有编码可溶性gp130的外源序列的aav载体的试剂盒，以及包括靶向表6中所列基因的核酸内切酶试剂及用于引入本说明书中提及的编码序列的供体基质的任何试剂盒。本发明还提供了用于免疫细胞转染的试剂盒，其包含编码序列特异性核酸内切酶试剂的多核苷酸和外源多核苷酸序列(优选包含在aav载体中的外源多核苷酸序列)，所述外源序列包含编码il1和il18激活途径拮抗剂的序列，如il1ra(uniprot#p18510)或il18bp(uniprot#o95998)或其活性片段或变体。根据本发明的一个方面，选择弱上调的内源基因。引入到所述转录活性弱上调的内源基因的外源编码序列可以有利地是抑制性car或凋亡car的组分，所述car的表达水平通常保持低于阳性car的表达水平。car表达的这种组合，例如用病毒载体转导的一种与根据本发明引入的另一种的组合，可以极大地改善car免疫细胞的特异性或安全性。一些内源性启动子瞬时上调，有时在免疫细胞活化后不到12小时内，如选自内源基因座spata6、itga6、rcbtb2、cd1d1、st8sia4、itgae和fam214a(表8)的那些。其他内源性启动子在免疫细胞活化后不到24小时上调，如选自内源基因座il3、il2、ccl4、il21、gp49a、nr4a3、lilrb4、cd200、cdkn1a、gzmc、nr4a2、cish、ccr8、lad1和crabp2(表9)的那些，而其他的在免疫细胞活化后超过24小时，更常见的是超过10天上调。如选自gzmb、tbx21、plek、chek1、slamf7、zbtb32、tigit、lag3、gzma、wee1、il12rb2、eea1和dtl(表9)的那些。作为另外一种选择，本发明人已发现对于根据本发明的方法，受在免疫细胞活化后下调的启动子转录控制的内源基因也可是所关心的。事实上，他们已设想编码抗凋亡因子(如bcl2家族的抗凋亡因子、bclxl、nf-kb、存活素或抗fap(成纤维细胞活化蛋白)，如car抗fap的组分)的外源编码序列可以在所述基因座引入。受在免疫细胞活化后下调的启动子转录控制的所述内源基因可以更具体地选自slc6a19、cd55、xkrx、mturn、h2-ob、cnr2、itgae、raver2、zbtb20、arrb1、abca1、tet1、slc16a5和ampd3(表10)。在肿瘤微环境(tme)条件下活化的内源启动子下的基因整合本发明的一个方面更具体地涉及在肿瘤微环境(tme)条件下防止免疫细胞耗尽的方法。免疫细胞通常会因为营养物质耗尽或肿瘤微环境中存在的分子信号而耗尽，这有助于肿瘤耐性。所述方法包括以下步骤：通过在内源启动子控制下整合外源编码序列来工程化免疫细胞，所述内源启动子在精氨酸、半胱氨酸、色氨酸和缺氧以及胞外酸中毒(乳酸积聚)下上调。这些外源序列可以编码嵌合抗原受体、白细胞介素或本说明书中其他地方给出的任何多肽，以增强免疫细胞功能或活化和/或赋予治疗优势。本发明人列出了已发现在大量耗尽的肿瘤浸润淋巴细胞(til)中上调的一些基因座，其列于表12和表13中。本发明提供以下步骤：在这些优选的基因座处整合外源编码序列以防止肿瘤微环境中免疫细胞(特别是t细胞)的耗尽。例如，编码car的外源序列可以置于由肿瘤微环境活化的内源基因启动子的转录控制下，所述内源基因启动子如hif1a、转录因子缺氧诱导因子或芳烃受体(ahr)。这些基因是在肿瘤近距离环境中分别由缺氧和异生素诱导的感受器。因此，通过在受肿瘤微环境(tme)影响的内源性t细胞启动子的控制下整合外源编码序列，并且更一般地遗传属性/回路，本发明对于改善cart细胞疗法的治疗结果是有用的。根据本发明，内源基因的上调可被“劫持”以重新表达相关外源编码序列，以改善cart细胞在某些肿瘤微环境中的抗肿瘤活性。造血干细胞(hsc)中的基因靶向插入和表达本发明的一个方面更具体地涉及将转基因插入造血干细胞(hsc)中。造血干细胞(hsc)是多能的、自更新的祖细胞，在造血过程中可以由其产生所有分化的血细胞类型。这些细胞包括免疫系统的淋巴细胞、粒细胞和巨噬细胞以及循环红细胞和血小板。经典地，hsc被认为分化成两个谱系限制的淋巴样和骨髓-红细胞、寡能祖细胞。控制hsc自更新和分化的机制被认为受多种细胞因子、趋化因子、受体和细胞内信号分子的影响。hsc的分化部分受生长因子和细胞因子的调节，所述细胞因子包括集落-刺激因子(csf)和活化胞内信号通路的白细胞介素(il)。已知下面描述的因子会影响hsc的多能性、增殖和谱系定型。hsc及其分化后代可通过特异性细胞表面谱系标记物(如分化簇(cd)蛋白和细胞因子受体)在造血干细胞中的表达来鉴定。使用hsc的基因疗法具有治疗包括免疫疾病在内的造血系统疾病的巨大潜力。在这种方法中，从患者中收集hsc，使用整合的逆转录病毒载体离体进行基因修饰，然后输注到患者内。迄今为止，逆转录病毒载体已成为hsc基因疗法的唯一有效的基因递送系统。使用整合载体将基因递送至hsc，从而允许有效递送至hsc-来源的成熟造血细胞。然而，输注到患者中的基因修饰细胞是多克隆群体，其中不同的细胞具有在不同染色体位置整合的载体前病毒，这可导致许多不利突变，这些突变可能由于这些突变的一些增殖/存活优势而扩增(powersandtrobridge(2013)“identificationofhematopoieticstemcellengraftmentgenesingenetherapystudies”jstemcellresthers3:004.doi:10.4172/2157-7633.s3-00)。通常在动员(患者接受重组人粒细胞-集落刺激因子(g-csf))后从外周血中收获hsc。使用cd34+标志物收集患者的外周血并富集hsc。然后将hsc离体培养并暴露于病毒载体。离体培养期为1至4天。在输注基因修饰的hsc之前，可以用化疗剂或辐射来治疗患者以帮助提高移植效率。将基因修饰的hsc静脉内重新输注到患者内。在最终存在于血窦和血管周围组织之前，细胞迀移到骨髓中。归巢和造血都是移植不可或缺的方面。通过归巢到达干细胞生态位的细胞将开始从每个血液谱系产生成熟的骨髓和淋巴样细胞。通过长期hsc的作用持续进行血细胞生成，所述长期hsc能够对于终生一代的患者成熟血细胞自更新，具体地常见的淋巴祖细胞，如t细胞和nk细胞的产生，所述淋巴祖细胞是用于消除感染和恶性细胞的关键免疫细胞。本发明提供在hsc中进行基因靶向插入以在内源启动子的控制下引入外源编码序列，所述内源启动子具体地是在特定造血谱系或特定分化阶段(优选在分化晚期)的细胞中特异性活化的基因的内源启动子。在先前段落中提到的离体治疗期间，可以用多核苷酸载体(供体模板)(如aav载体)转导hsc，而表达序列特异性核酸酶试剂以促进编码序列在选定基因座的插入。然后，可以将得到的工程化hsc移植到有需要的患者体内以长期体内产生包含所述外源编码序列的工程化免疫细胞。根据所选内源启动子的活性，编码序列将在某些谱系中选择性表达或响应体内免疫细胞的局部环境而选择性表达，从而提供过继免疫疗法。根据本发明的一个优选方面，将外源编码序列置于基因启动子的控制之下，所述基因启动子的转录活性在常见的淋巴祖细胞中被特异性诱导，如cd34、cd43、flt-3/flk-2、il-7rα/cd127和脑啡肽酶(neprilysin)/cd10。更优选地，将外源编码序列置于基因的启动子的控制下，该基因的启动子的转录活性在nk细胞中被特异性诱导，如cd161、cd229/slamf3、cd96、dnam-1/cd226、fcγrii/cd32、fcγrii/riii(cd32/cd16)、fcγriii(cd16)、il-2rβ、整合素α2/cd49b、kir/cd158、ncam-1/cd56、nkg2a/cd159a、nkg2c/cd159c、nkg2d/cd314、nkp30/ncr3、nkp44/ncr2、nkp46/ncr1、nkp80/klrf1、siglec-7/cd328和tigit或在t-细胞中特异性诱导，如ccr7、cd2、cd3、cd4、cd8、cd28、cd45、cd96、cd229/slamf3、dnam-1/cd226、cd25/il-2rα、l-选择素/cd62l和tigit。作为优选方面，本发明包含将编码car或其组分的外源序列引入hsc，优选地在hsc中不表达的基因的启动子的转录控制下，所述基因更优选为仅在由所述hsc产生的造血细胞中表达的基因，以及甚至更优选为仅在t细胞或nk细胞中表达的基因。hsc中的条件car表达以跨越胸腺屏障本发明的特定方面涉及通过上述工程化的hsc体内产生造血免疫细胞，如t细胞或nk细胞，从而表达外源编码序列，特别是car或其组分。例如，通过工程化的hsc生产造血car阳性细胞的一个主要障碍是免疫系统本身(特别是胸腺)对car阳性细胞的排斥。血-胸腺屏障调节循环系统和胸腺之间的物质交换，为未成熟的t细胞发育提供隔离的环境。该屏障还防止未成熟的t细胞接触外源抗原(因为在这个阶段与抗原接触会导致t细胞通过细胞凋亡而死亡)。本发明提供的一种方案是将编码car组分的序列在启动子的转录控制下置于hsc中，所述启动子在通过胸腺屏障时不会显著转录到造血细胞中。提供car进入造血细胞的条件表达并且在胸腺中具有降低的或没有显著的转录活性的基因的一个实例是lck(uniprot：p06239)。根据本发明的一个优选方面，编码car或其组分的外源序列在基因的转录控制下被引入hsc，该基因被描述为在t细胞或nk细胞中特异性表达，优选仅在这些类型的细胞中表达。因此，本发明提供了产生hsc的方法，所述hsc包含仅在选定的造血谱系中表达的外源编码序列，所述编码序列优选编码car或抗原的至少一种组分以刺激免疫系统。更广泛地，本发明提供了一种通过基因靶向插入外源编码序列来工程化hsc的方法，所述外源编码序列要在由所述hsc产生的造血细胞中选择性表达。作为优选的实施方式，由所述工程化hsc产生的所述造血细胞响应于所选择的环境因子或体内刺激，表达所述外源编码序列以改善其治疗潜力。将免疫细胞中的靶向序列插入与内源基因组序列的失活相结合本发明的一个具体关注点是在原代免疫细胞中在基因座处进行基因失活，其通过在所述基因座处整合外源编码序列，所述外源编码序列的表达改善所述工程化细胞的治疗潜力。上文已经介绍了可以根据本发明插入的相关外源编码序列的实例以及它们对细胞的治疗潜力的积极影响。以下将介绍由基因靶向插入所优选靶向的内源基因以及与它们的失活相关的优点。根据本发明的优选方面，编码序列的插入具有减少或防止参与自我和非自我识别的基因表达的效果，从而在将同种异体细胞引入受体患者后减少宿主抗移植物病(gvhd)反应或免疫排斥反应。例如，该方法中使用的序列特异性试剂之一可以减少或防止tcr在原代t细胞中的表达，如编码tcr-α或tcr-β的基因的表达。作为另一优选方面，一个基因编辑步骤是减少或防止β2m蛋白和/或参与其调节的另一蛋白(如c2ta(uniprotp33076))或参与mhc识别的另一蛋白(如hla蛋白)的表达。这使得工程化的免疫细胞在输注到患者内时具有较低的同种异体反应性。“同种异体治疗用途”是指细胞来源于供体，以便其输注到具有不同单倍型的患者中。实际上，本发明提供了获得原代细胞的有效方法，所述原代细胞可以在涉及宿主-移植物相互作用和识别的多种基因座中进行基因编辑。为了改善工程化原代细胞的活性、治疗活性的持久性，也可以编辑其他基因座，如下文详述：检查点受体和免疫细胞抑制途径的失活：根据本发明的优选方面，所插入的外源编码序列具有减少或阻止参与免疫细胞抑制途径的蛋白质表达的作用，特别是文献中称为“免疫检查点”的那些蛋白质(pardoll,d.m.(2012)theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy,naturereviewscancer,12:252-264)。在本发明的意义上，“免疫细胞抑制途径”是指免疫细胞中的任何基因表达，其导致淋巴细胞针对恶性或感染细胞的细胞毒活性降低。这可以是(例如)参与foxp3表达的基因，已知foxp3驱动t细胞上tregs的活性(调节t细胞活性)。“免疫检查点”是免疫系统中的分子，它们可以发出活化免疫细胞的信号(共刺激分子)或拒绝活化免疫细胞的信号。根据本发明，免疫检查点更具体地是指参与t细胞和抗原呈递细胞(apc)之间的配体-受体相互作用的表面蛋白，其调节t细胞对抗原的响应(由被t细胞受体(tcr)识别的肽-主要组织相容性复合物(mhc)分子复合物介导)。这些相互作用可发生在淋巴结(其中主要apc是树突细胞)或外周组织或肿瘤(其中效应子反应受到调节)中的t细胞应答起始时。结合共刺激和抑制受体两者的一个重要的膜结合配体家族是b7家族。所有b7家族成员及其已知配体属于免疫球蛋白超家族。最近确定的b7家族成员的多个受体尚未确定。与同源tnf受体家族分子结合的肿瘤坏死因子(tnf)家族成员代表了第二个调节性配体-受体对家族。当这些受体与其同源配体接合时，它们主要递送共刺激信号。调节t细胞活化的另一主要信号类别来自微环境中的可溶性细胞因子。在其他情况下，活化的t细胞上调与apc上的同源受体接合的配体，如cd40l。a2ar、腺苷a2a受体；b7rp1，b7相关蛋白1；btla，b和t淋巴细胞衰减子；gal9，半乳糖凝集素9；hvem，疱疹病毒进入介体；icos，诱导型t细胞共刺激分子；il，白细胞介素；kir，杀伤细胞免疫球蛋白样受体；lag3，淋巴细胞活化基因3；pd1，程序性细胞死亡蛋白1；pdl，pd1配体；tgfβ，转化生长因子-β；tim3，t细胞膜蛋白3。表3中列出了其他内源基因的实例，它们的表达可以被降低或抑制以开启根据本发明的工程化免疫细胞中的活化。例如，插入的外源编码序列可以具有通过工程化的免疫细胞减少或阻止选自pd1(uniprotq15116)、ctla4(uniprotp16410)、ppp2ca(uniprotp67775)、ppp2cb(uniprotp62714)、ptpn6(uniprotp29350)、ptpn22(uniprotq9y2r2)、lag3(uniprotp18627)、havcr2(uniprotq8tdq0)、btla(uniprotq7z6a9)、cd160(uniproto95971)、tigit(uniprotq495a1)、cd96(uniprotp40200)、crtam(uniproto95727)、lair1(uniprotq6gtx8)、siglec7(uniprotq9y286)、siglec9(uniprotq9y336)、cd244(uniprotq9bzw8)、tnfrsf10b(uniproto14763)、tnfrsf10a(uniproto00220)、casp8(uniprotq14790)、casp10(uniprotq92851)、casp3(uniprotp42574)、casp6(uniprotp55212)、casp7(uniprotp55210)、fadd(uniprotq13158)、fas(uniprotp25445)、tgfbrii(uniprotp37173)、tgfrbri(uniprotq15582)、smad2(uniprotq15796)、smad3(uniprotp84022)、smad4(uniprotq13485)、smad10(uniprotb7zsb5)、ski(uniprotp12755)、skil(uniprotp12757)、tgif1(uniprotq15583)、il10ra(uniprotq13651)、il10rb(uniprotq08334)、hmox2(uniprotp30519)、il6r(uniprotp08887)、il6st(uniprotp40189)、eif2ak4(uniprotq9p2k8)、csk(uniprotp41240)、pag1(uniprotq9nwq8)、sit1(uniprotq9y3p8)、foxp3(uniprotq9bzs1)、prdm1(uniprotq60636)、batf(uniprotq16520)、gucy1a2(uniprotp33402)、gucy1a3(uniprotq02108)、gucy1b2(uniprotq8bxh3)和gucy1b3(uniprotq02153)中的至少一种蛋白质的表达的效果。在编码上述蛋白质的基因中引入的基因编辑优选与cart细胞中tcr的失活组合。优选pd1和/或ctla4的失活，结合非内源性免疫抑制多肽(如pd-l1配体和/或ctla-4ig(还参见表1和2的肽))的表达。表3：参与免疫细胞抑制路径的基因列表抑制抑制性细胞因子/代谢物根据本发明的另一方面，插入的外源编码序列具有减少或阻止编码或正调控抑制性细胞因子或其代谢物或受体的基因的表达的作用，具体地tgfβ(uniprot:p01137)、tgfbr(uniprot:p37173)、il10(uniprot:p22301)、il10r(uniprot:q13651和/或q08334)、a2ar(uniprot:p29274)、gcn2(uniprot:p15442)和prdm1(uniprot:o75626)。优选其中编码il-2、il-12或il-15的序列替换至少一个上述内源基因的序列的工程化免疫细胞。诱导对化疗药物的抗性根据本发明的另一方面，插入的外源编码序列具有减少或阻止如下基因的表达的作用，所述基因负责免疫细胞对癌症或感染的标准护理治疗中使用的化合物的敏感性，所述化合物如化疗中常用的药物嘌呤核苷酸类似物(pna)或6-巯基嘌呤(6mp)和6-硫代鸟嘌呤(6tg)。减少或灭活参与这些化合物作用模式的基因(称为“药物致敏基因”)改善免疫细胞对所述化合物的抗性。药物致敏基因的实例是相对于pna(如氯吡嗪和氟达拉滨)的活性编码dck(uniprotp27707)的基因，相对于嘌呤抗代谢物(如6mp和6tg)的活性编码hprt(uniprotp00492)的基因和相对于抗叶酸药物(具体地甲氨蝶呤)的活性编码ggh(uniprotq92820)的基因。这使得细胞能够在常规抗癌化学疗法之后或与之结合使用。对免疫抑制治疗的抗性根据本发明的另一方面，插入的外源编码序列具有减少或阻止作为药物靶标的受体或蛋白质表达的效果，从而使所述细胞对免疫耗尽药物治疗具有抗性。这种靶标可以是糖皮质激素受体或抗原，以使得工程化的免疫细胞对使用如阿伦单抗(alemtuzumab)的抗体的糖皮质激素或免疫耗尽治疗具有抗性，前述抗体在许多癌症治疗中用于耗尽cd52阳性免疫细胞。另外，本发明的方法可以包含编码或调节cd52(uniprotp31358)和/或gr(糖皮质激素受体，也称为nr3c1-uniprotp04150)的表达的内源基因中的基因靶向插入。改善car阳性免疫细胞活性和存活根据本发明的另一方面，插入的外源编码序列可以具有降低或阻止表面抗原(如bcma、cs1和cd38)表达的效果，其中所述抗原是由所述免疫细胞表达的car靶向的抗原。这一实施方式可以解决car靶向存在于感染或恶性细胞表面，但也在某种程度上由免疫细胞本身表达的抗原的问题。根据优选的实施方式，将编码car或其组分之一的外源序列整合到编码被所述car靶向的抗原的基因中，以避免免疫细胞的自我破坏。工程化的免疫细胞和免疫细胞群本发明还涉及根据前述方法之一可获得的各种工程化的免疫细胞，其为分离形式或作为细胞群的一部分。根据本发明优选的方面，工程化的细胞是原代免疫细胞，如nk细胞或t细胞，它们通常是可能包括不同类型细胞的细胞群的一部分。一般而言，来源于患者或供体的群是通过白细胞分离术从pbmc(外周血单核细胞)分离的。根据本发明的优选方面，超过50％的所述群中包含的免疫细胞是tcr阴性t细胞。根据本发明更优选的方面，超过50％的所述群中包含的免疫细胞是car阳性t细胞。本发明涵盖免疫细胞，其包含不同外源编码序列和基因失活的任何组合，所述外源编码序列和基因失活已在上文中分别独立地描述。在这些组合中，特别优选的是将在内源启动子的转录控制下car的表达与在免疫细胞活化期间上调的启动子的转录控制下编码细胞因子(如il-2、il-12或il-15)的外源序列的表达组合在一起的那些，所述内源启动子在免疫细胞活化期间具有稳定活性并且优选独立于所述活化。另一优选的组合是在缺氧诱导因子1基因启动子(uniprot：q16665)的转录控制下插入编码car或其组分之一的外源序列。本发明还涉及用于治疗感染或癌症的药物组合物，其包含如前所述的工程化原代免疫细胞或免疫细胞群，并且涉及治疗对其有需要的患者的方法，其中所述方法包括：–根据如前所述的本发明的方法制备工程化的原代免疫细胞群；–可选地，纯化或分选所述工程化的原代免疫细胞；–在将所述细胞输注到所述患者体内时或之后，活化所述工程化的原代免疫细胞群。t细胞的活化和扩增无论是在遗传修饰之前还是之后，根据本发明的免疫细胞可以被活化或扩增，即使它们可以独立于抗原结合机制而活化或增殖。可以使用如(例如)美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开no.20060121005中所述的方法来活化和扩增t细胞。可以在体外或体内扩增t细胞。通常通过与刺激cd3tcr复合物和t细胞表面上的共刺激分子的试剂接触以产生t细胞的活化信号来扩增t细胞。例如，可以使用如钙离子载体a23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)或有丝分裂凝集素，如植物血凝素(pha)的化学品来产生用于t细胞的活化信号。作为非限制性实例，可以在体外刺激t细胞群，如通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗cd2抗体接触，或者通过与蛋白激酶c活化剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合刺激t细胞增殖的条件下，使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。适合t细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或rpmi培养基1640，或x-vivo7，(lonza))，其可以含有增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(il-2)、膜岛素、ifn-g、1l-4、1l-7、gm-csf、-10、-2、1l-15、tgfp和tnf-或者本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括(但不限于)表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi1640、a1m-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo1和x-vivo20，优化剂(optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使t细胞生长和扩增的细胞因子的量。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包括在实验培养中，而未包括在要输注到受试者中的细胞培养中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％co2)。已暴露于不同刺激时间的t细胞可表现出不同的特征。在另一具体实施方式中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增所述细胞。所述细胞也可以在体内扩增，例如在将所述细胞施用于受试者后在受试者的血液中扩增。治疗组合物和应用上述本发明的方法允许在约15至30天的有限时间框架内产生工程化的原代免疫细胞，优选15至20天，以及最优选18至20天，从而使得它们保持它们完全的免疫治疗潜力，特别是在细胞毒活性方面。这些细胞形成细胞群，其优选源自单个供体或患者。这些细胞群可以在封闭的培养接收器下扩增以符合最高的生产实践要求，并且可以在输注到患者体内之前冷冻，从而提供“现成的”或“即用型”治疗组合物。根据本发明，可以获得大量源自相同白细胞分离术的细胞，这对于获得足够用来治疗患者的剂量至关重要。尽管可以观察到源自不同供体的细胞群之间的差异，但是通过白细胞分离术获得的免疫细胞的数量通常为约108至1010个pbmc细胞。pbmc包含几种类型的细胞：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中30至60％为t细胞，其通常代表来自一个供体的108至109个原代t细胞。本发明的方法通常结束于工程化的细胞群，其一般达到超过约108个t-细胞，更一般超过约109个t-细胞，甚至更一般超过约1010个t-细胞，并且经常超过1011个t-细胞。因此，本发明更具体地涉及治疗有效的原代免疫细胞群，其中所述群中的细胞的至少30％，优选50％，更优选80％已根据本文所述的任一方法修饰。根据本发明，所述治疗有效的原代免疫细胞群包含免疫细胞，该免疫细胞已在来自表6所列基因中至少一种的内源启动子的转录控制下整合至少一种外源基因序列。因此，这种细胞的组合物或细胞群可用作药物；尤其用于在对其有需要的患者中治疗癌症，特别是用于治疗淋巴瘤，但也用于治疗实体瘤，如黑素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或者癌，如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌或卵巢癌。本发明更具体地涉及源自单一供体的原代tcr阴性t细胞群，其中所述群中的至少20％，优选30％，更优选50％的细胞已使用序列特异性试剂在至少两个(优选三个)不同的基因座处进行修饰。在另一方面，本发明依赖于治疗对其有需要的患者的方法，所述方法包括下列步骤中的至少一个：(a)确定存在于患者肿瘤活组织检查的表面上的特异性抗原标志物；(b)提供通过前述本发明的方法之一工程化的工程化原代免疫细胞群，其表达针对所述特异性抗原标志物的car；(c)将所述工程化原代免疫细胞的工程化群施用于所述患者。通常，所述细胞群主要包含cd4和cd8阳性免疫细胞，如t细胞，其可以经历稳健的体内t细胞扩增，并且可以在体外和体内持续延长量的时间。包括根据本发明的工程化原代免疫细胞的治疗可以是改善、治疗或预防的。它可以是自体免疫疗法的一部分，也可以是同种异体免疫疗法治疗的一部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群来自所述患者或来自人白细胞抗原(hla)相容的供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞群不是来自所述患者而是来自供体。在另一个实施方式中，根据本发明所述的分离的细胞或来源于所述分离细胞的细胞系可用于治疗液体肿瘤，优选用于治疗t细胞急性淋巴母细胞性白血病。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。使用根据本发明的工程化免疫细胞的治疗可以与一种或多种抗癌疗法组合，其选自抗体疗法、化疗、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法。根据本发明的优选实施方式，所述治疗可以施用于接受免疫抑制治疗的患者。实际上，本发明优选依赖于细胞或细胞群，已经使所述细胞或细胞群对至少一种免疫抑制剂产生抗性，原因在于编码用于这种免疫抑制剂的受体的基因被失活。在这一方面，免疫抑制治疗应有助于根据本发明的t细胞在患者体内的选择和扩增。根据本发明的细胞或细胞群的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以通过皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉内或淋巴管内注射或者腹膜内注射，将本文描述的组合物施用于患者。在一个实施方式中，本发明的细胞组合物优选通过静脉注射施用。细胞或细胞群的施用可以由每kg体重施用104-109个细胞组成，优选105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有细胞数的整数值。因此，本发明可以提供超过10个，通常超过50个，更通常超过100个且经常超过1000个剂量，该计量包含来自单个供体或患者取样的106-108个基因编辑的细胞。细胞或细胞群可以单剂量或多剂量施用。在另一实施方式中，所述有效量的细胞以单剂量施用。在另一实施方式中，所述有效量的细胞在一段时间内以不止一个剂量施用。施用时机在管理医师的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群可以从任何来源获得，如血库或供体。虽然个体需求不同，但是对于特定疾病或病症，给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定在本领域的技术范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，并发治疗的种类(如有)，治疗频率和所期望的效果的性质。在另一实施方式中，所述有效量的细胞或包含那些细胞的组合物是胃肠外施用的。所述施用可以是静脉内施用。所述施用可以通过在肿瘤内注射直接进行。在本发明的某些实施方式中，将细胞与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)施用于患者，所述相关治疗方式包括(但不限于)用药剂，如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2的治疗，对于ms患者的阿糖胞苷(也称为ara-c)或那他珠单抗治疗，或者对于银屑病患者的依法利珠单抗治疗或者对于pml患者的其他治疗。在其他实施方式中，本发明的t细胞可与化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体或其他免疫消除剂(如campath，抗cd3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、fk506，雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228，细胞因子和辐射)组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙神经素(环胞霉素和fk506)或者抑制对于生长因子所引起的信号转导重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。在其他实施方式中，将本发明的细胞组合物与骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨、外照射放射治疗(xrt)、环磷酰胺)或者抗体(如okt3或campath)的t细胞消融疗法(例如，之前、同时或之后)组合施用于患者。在另一实施方式中，在b细胞消融疗法(如与cd20反应的药剂，例如，利妥昔单抗)后，施用本发明的细胞组合物。例如，在一个实施方式中，受试者可接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在其他实施方式中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。当在根据本发明的免疫细胞或免疫细胞群中表达car时，优选的car是靶向至少一种抗原的那些，其选自cd22、cd38、cd123、cs1、hsp70、ror1、gd3和cll1。赋有car或靶向cd22的修饰的tcr的根据本发明的工程化免疫细胞优选用于治疗白血病，如急性淋巴母细胞性白血病(all)，赋有car或靶向cd38的修饰的tcr的那些优选用于治疗白血病，如t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)或多发性骨髓瘤(mm)，赋有car或靶向cd123的修饰的tcr的那些优选用于治疗白血病，如急性髓性白血病(aml)和母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(blasticplasmacytoiddendriticcellsneoplasm)(bpdcn)，赋有car或靶向cs1的修饰的tcr的那些优选用于治疗多发性骨髓瘤(mm)。本发明还涵盖了用于检测包含所需遗传插入的本发明的工程化细胞的方法，特别是通过执行以下步骤：通过使用与seqidno:36至40表示的任何序列杂交的探针或引物，使用pcr方法检测本说明书中提到的内源基因座处的外源编码序列的插入，特别是在pd1、cd25、cd69、tcr和β2m基因座处的外源编码序列的插入。还可以进行免疫学测定，以检测工程化细胞对car、gp130的表达，以及检查tcr、pd1、il-6和il-8在这些基因被敲除或它们的表达减少的细胞中的表达缺失或减少。其他定义–多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码表示，其中(例如)q表示gln或谷氨酰胺残基，r表示arg或精氨酸残基，并且d表示asp或天冬氨酸残基。–氨基酸替代是指用另一个氨基酸替换一个氨基酸残基，例如，在肽序列中用谷氨酰胺残基对精氨酸残基的替换是氨基酸替代。–核苷酸表示如下：用单字母代码表示核苷碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶且g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y代表t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。–如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)、寡核苷酸、聚合酶链反应(pcr)产生的片段和由任何连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由作为天然存在的核苷酸(如dna和rna)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)的单体或它们两者的组合组成。修饰的核苷酸可以具有糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中的改变。糖改性包括(例如)用卤素、烷基、胺和叠氮基取代一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子相似的结构取代，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其他熟知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这种键的类似物连接。核酸可以是单链的或双链的。–术语“核酸内切酶”是指能够催化dna或rna分子(优选dna分子)内的核酸之间的键水解(切割)的任何野生型或变体酶。不管其序列如何，核酸内切酶不会切割dna或rna分子，而是在特定多核苷酸序列上识别并切割dna或rna分子，所述特定多核苷酸序列还称为“靶序列”或“靶位点”。核酸内切酶当通常具有长度大于10个碱基对(bp)，更优选具有14-55bp的多核苷酸识别位点时可归类为稀切核酸内切酶。稀切核酸内切酶通过在确定的基因座处诱导dna双链断裂(dsb)而显著增加同源重组，借此允许基因修复或基因插入疗法(pingoud,a.andg.h.silva(2007).precisiongenomesurgery.nat.biotechnol.25(7):743-4)。–“dna靶”、“dna靶序列”、“靶dna序列”、“核酸靶序列”、“靶序列”或“加工位点”是指可以通过根据本发明的稀切核酸内切酶靶向并加工的多核苷酸序列。这些术语是指特定的dna位置，优选细胞中的基因组位置，但也指可独立于遗传物质主体而存在的一部分遗传物质，如作为非限制性实例的质粒、附加体、病毒、转座子或细胞器，如线粒体。作为rna引导的靶序列的非限制性实例，是可以与向导rna杂交的基因组序列，其将rna引导的核酸内切酶导向至所需的基因座。“突变”是指多核苷酸(cdna、基因)或多肽序列中至多一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、二十、二十五、三十、四十、五十或更多个核苷酸/氨基酸的置换、缺失、插入。突变可以影响基因的编码序列或其调控序列。它还可以影响基因组序列的结构或编码的mrna的结构/稳定性。“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。本发明中的“载体”包括(但不限于)病毒载体、质粒、rna载体或者可由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成的线性或环状dna或rna分子。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达(表达载体)与它们连接的核酸的那些。大量适合的载体是本领域技术人员已知的并且是可商购的。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒(aav)、冠状病毒、负链rna病毒，如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)、正链rna病毒，如小核糖核酸病毒和α病毒以及双链dna病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、禽痘和金丝雀痘)。其他病毒包括(例如)诺沃克病毒、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝dna病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤，哺乳动物c型、b型病毒、d型病毒，htlv-blv组，慢病毒，泡沫病毒(coffin,j.m.,retroviridae:thevirusesandtheirreplication,infundamentalvirology,第3版,b.n.fields等人主编,lippincott-ravenpublishers,philadelphia,1996)。–如本文所使用的，术语“基因座”是dna序列(例如，基因)进入基因组的特定物理位置。术语“基因座”可以指稀切核酸内切酶靶序列在染色体上或在感染剂的基因组序列上的特定物理位置。这种基因座可包含被根据本发明的序列特异性核酸内切酶识别和/或切割的靶序列。应理解本发明所关心的基因座不仅可以使细胞遗传物质的主体中(即染色体中)存在的核酸序列适格，而且可以使可以独立于所遗传物质主体而存在的遗传物质的一部分适格，如作为非限制性实例的质粒、附加体、病毒、转座子或细胞器，如线粒体。–术语“切割”是指多核苷酸的共价主链的断裂。切割可以通过多种方法引发，其包括(但不限于)磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且作为两个不同的单链切割事件的结果可以发生双链切割。双链dna、rna或dna/rna杂交切割可导致钝端或交错末端的产生。“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中的位置来确定同一性，所述位置可以出于比较的目的而比对。当比较序列中的位置被相同碱基占据时，则分子在该位置处是同一的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列共有的位置处相同或匹配核苷酸数目的函数。可以使用多种比对算法和/或程序来计算两条序列之间的同一性，包括fasta或blast，其作为gcg序列分析包(universityofwisconsin,madison,wis.)的一部分是可用的，并且可以利用(例如)默认设置来使用。例如，考虑了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地表现出基本相同的功能的多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。–本文所用的术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，包括非人灵长类和人。–本发明的上述书面描述提供了制造和使用本发明的方式和方法，从而使得本领域的任何技术人员都能够制造和使用本发明，这种使能性具体地为所附权利要求的主题提供，所附权利要求构成原始描述的一部分。当在本文中描述数值限制或范围时，包括终点。此外，数值限制或范围内的所有值和子范围都被明确地包括在内，如同明确写出一样。已经一般性地描述了本发明，通过参考某些具体实施例可以获得进一步的理解，这些实施例仅出于说明性目的而提供，并不意欲限制所主张保护的发明的范围。实施例实施例1：在内源基因敲除的内源启动子的控制下，在人原代t细胞中在不同基因座处的aav驱动的同源重组。简介序列特异性核酸内切酶试剂，如(cellectis,8ruedelacroixjarry,75013paris)使得能够在基因组中在所需基因座处进行双链断裂(dsb)的位点特异性诱导。通过细胞酶修复dsb主要通过两种途径发生：非同源末端连接(nhej)和同源介导修复(hdr)。adr使用同源dna片段(模板dna)，通过重组修复dsb，并且可用于引入模板dna中包含的任何基因序列。如其中所示，可以通过重组腺相关病毒(raav)与工程化的核酸酶，如一起递送所述模板dna以引入位点特异性dsb。整合基质的设计1.1在敲除了内源性pd1基因编码序列的上调基因座中插入细胞凋亡cartalen靶位点的位置已设计为位于靶向的内源性pdcd1基因(程序性细胞死亡蛋白1，称为pd1-uniprot#q15116)中。在seqidno:1和seqidno:2中给出包含talen靶标上游和下游1000bp的序列。seqidno:5给出了talen(seqid：seqidno:3和no.4)的靶序列。整合基质被设计为由以下组成：与talen位点上游的内源基因同源的序列(300bp)(seqidno:1)，随后是2a调控元件(seqidno:6)，随后是编码不含起始密码子的诱导car细胞凋亡的序列(seqidno:7)，随后是终止密码子(tag)，随后是多腺苷酸化序列(seqidno:8)，随后是与talen位点下游的内源基因同源的序列(1000bp)(seqidno:2)。随后，将插入基质克隆到无启动子的raav载体中并用于产生aav6。1.2在敲除内源基因的上调基因座中插入白细胞介素talen靶位点的位置已设计为位于靶向的内源性pdcd1基因(程序性细胞死亡蛋白1，pd1)中。在seqidno:1和seqidno:2中给出包含talen靶标上游和下游1000bp的序列。seqidno:5给出了talen的靶序列(seqid：seqidno:3和no.4)。整合基质被设计为由以下组成：与talen位点上游的内源基因同源的序列(300bp)(seqidno:1)，随后是2a调控元件(seqidno:6)，随后是编码工程化单链人il-12p35(seqidno:9)和p40(seqidno:10)亚基融合蛋白的序列，随后是终止密码子(tag)，随后是多腺苷酸化序列(seqidno:8)，随后是与talen位点下游的内源基因同源的序列(1000bp)(seqidno:2)。随后，将插入基质克隆到无启动子的raav载体中并用于产生aav6。1.3在敲除内源基因的弱表达基因座中插入细胞凋亡car—n末端插入talen靶位点的位置设计为位于尽可能接近靶向的内源性lck基因的起始密码子(lck，lck原癌基因，src家族酪氨酸激酶[智人(homosapiens)(人)])。在seqidno:11和no.12中给出了包含起始密码子上游和下游1000bp的序列。整合基质被设计为由以下组成：与起始密码子上游的内源基因同源的序列(1000bp)，随后是含有起始密码子的编码car的细胞凋亡的序列(seqidno:13)，随后是2a调控元件(seqidno:8)，随后是与起始密码子下游的内源基因同源的序列(1000bp)(seqidno:12)。随后，将插入基质克隆到无启动子的raav载体中并用于产生aav6。1.4在敲除内源基因的弱表达基因座中插入细胞凋亡car—c末端插入talen靶位点的位置设计为位于尽可能接近靶向的内源性lck基因的终止密码子(lck，lck原癌基因，src家族酪氨酸激酶[智人(homosapiens)(人)])。在seqidno:14和no.15中给出了包含终止密码子上游和下游1000bp的序列。整合基质被设计为由以下组成：与终止密码子上游的内源基因同源的序列(1000bp)，随后是2a调控元件(seqidno:8)，随后是无起始密码子的编码诱导car的细胞凋亡的序列(seqidno:7)，随后是终止密码子(tag)，随后是与终止密码子下游的内源基因同源的序列(1000bp)(seqidno:15)。随后，将插入基质克隆到无启动子的raav载体中并用于产生aav6。序列特异性核酸酶试剂在转导细胞中的表达使用mmessagemmachinet7ultra试剂盒(thermofisherscientific,grandisland,ny)合成mrna，将每个talen克隆到t7启动子的下游，使用rneasy柱(qiagen,valencia,ca)进行纯化并且在“cytoporationmediumt”(harvardapparatus,hollistonma)中进行洗脱。在补充有20ng/ml人il-2(miltenyibiotech,sandiego,ca)、5％人ab血清(geminibio-products,westsanfrancisco,ca)和dynabeads人t-活化剂cd3/cd28(thermofisherscientific,grandisland,ny，以1:1的珠：细胞比)的x-vivo-15培养基(lonza,basel,switzerland)中从由alameda(alameda,ca)提供的全外周血中收集人t细胞并且活化。3天后除去珠，并在0.4cm间隙比色皿中在200μl最终体积的“cytoporationmediumt”(btxharvardapparatus,holliston,massachusetts)中，使用cytopulse(btxharvardapparatus,holliston,ma)在3,000v/cm下施加两个0.1ms脉冲，随后在325v/cm下施加四个0.2ms脉冲，用两种适当的中的每一种的10μgmrna电穿孔5×106个细胞。立即将细胞稀释于含有20ng/mlil-2的x-vivo-15培养基中，并且在37℃、5％co2下培育。两小时后，在3×105个病毒基因组(vg)/细胞下，将细胞与aav6颗粒培育(37℃，16小时)。将细胞传代并维持在补充有5％人ab血清和20ng/mlil-2的x-vivo-15培养基中，直到通过流式细胞术检查各个插入的基因序列的表达。表4：实施例1中提到的序列实施例2：t细胞中-介导的il-15和car编码基质的双靶向整合材料x-vivo-15得自lonza(cat#be04-418q)，il-2获自miltenyibiotech(cat#130-097-748)，人血清ab获自seralab(cat#gem-100-318)，人t活化剂cd3/cd28获自lifetechnology(cat#11132d)，qbend10-apc获自r&dsystems(cat#fab7227a)，vioblue-标记的抗cd3、pe-标记的抗lngfr、apc-标记的抗cd25和pe-标记的抗pd1获自miltenyi(分别为cat#130-094-363、130-112-790、130-109-021和130-104-892)，48孔处理板(cytoone,cat#cc7682-7548)，人il-15quantikineelisa试剂盒获自r&dsystems(cat#_s1500)，one-glo获自promega(cat#e6110)。含有不同基质的aav6批次获自virovek，pbmc细胞获自allcells(cat#pb004f)并且在来自atcc的raji细胞(cat#ccl-86)的荧光虫荧光素酶编码慢病毒颗粒转导后获得raji-荧光素酶细胞。方法2.1-转染-转导如下进行trac和pd1或cd25基因座的双重靶向整合。首先，将pbmc细胞解冻，洗涤，重悬浮并在x-vivo-15完全培养基(x-vivo-15，5％ab血清，20ng/mlil-2)中培养。一天后，通过dynabeads人t活化剂cd3/cd28将细胞活化(25ul珠/1e6cd3阳性细胞)，并且在存在5％co2的情况下，在37℃，在x-vivo完全培养基中以1e6个细胞/ml的密度培养3天。在转导-转染当天，首先通过磁分离(easysep)使细胞去珠，在cytoporation缓冲液t(btxharvardapparatus,holliston,massachusetts)中洗涤两次，并且以28e6个细胞/ml的最终浓度重悬浮于相同溶液中。在存在或不存在15μg编码cd25或pd1(分别为seqidno:18和19以及seqidno:20和21)的臂的mrna的条件下，在200μl的最终体积中，将细胞悬浮液与5μg编码trac臂(seqidno:16和17)的mrna混合。是tale核酸酶的标准形式，由tale与fok-1融合而成。使用pulseagile技术，在0.4cm间隙比色皿和终体积为200μl的cytoporation缓冲液t(btxharvardapparatus,holliston,massachusetts)中，通过在3,000v/cm下施加两个0.1ms脉冲，然后在325v/cm下施加四个0.2ms脉冲，进行转染。然后，将电穿孔的细胞立即转移到含有1ml预热的x-vivo-15无血清培养基的12孔板中，并在37℃下培育15分钟。然后，在48孔常规处理板中，在存在包含供体基质的aav6颗粒(moi＝3e5vg/细胞)条件下，在250μl相同培养基中将细胞浓缩至8e6个细胞/ml。在30℃培养2小时后，向细胞悬浮液中加入250μl补充有10％ab血清和40ng/mlil-2的xvivo-15培养基，并将混合物在相同培养条件下培育24小时。一天之后，以1e6个细胞/ml将细胞接种在完全x-vivo-15培养基中并且在存在5％co2的情况下在37℃下培养。2.2-δlngfr的活化依赖性表达和il15的分泌从前面描述的转染-转导过程中回收工程化t细胞，并且以1e6个细胞/ml单独接种或者在存在raji细胞(e:t＝1:1)或dynabeads(12.5ul/1e6细胞)的情况下接种在100μl终体积的完全x-vivo-15培养基中。将细胞培养48小时，然后回收、标记并通过流式细胞术分析。用两组独立的抗体标记细胞。第一组抗体，旨在检测δlngfr、car和cd3细胞的存在，在于qbend10-apc(稀释1/10)、vioblue-标记的抗cd3(稀释1/25)和pe-标记的抗δlngfr(稀释1/25)中。第二组抗体，旨在检测内源性cd25和pd1的表达，在于apc-标记的抗cd25(稀释1/25)和vioblue-标记的抗pd1(稀释1/25)中。将相同的实验装备用于研究培养基中的il-15分泌。将细胞混合物共培养2天、4天、7天和10天，然后使用il-15特异性elisa试剂盒收集并分析上清液。2.3-连续杀伤测定为了评价工程化cart细胞的抗肿瘤活性，进行了连续杀伤测定。该测定的原理是通过每日添加恒定量的肿瘤细胞来每天激发cart细胞的抗肿瘤活性。由于稳定整合在肿瘤细胞系中的荧光素酶标志物，可以通过发光读数监测肿瘤细胞的增殖、控制和复发。通常，在总体积为1ml的xvivo5％ab、20ng/ulil-2中，以不同的e:t比(e:t＝5:1或1:1)将cart细胞混合到2.5×105个raji-luc肿瘤细胞的悬浮液中。将混合物培育24小时，然后使用one-glo试剂确定25ul细胞悬浮液的发光性。然后，将细胞混合物离心，弃去旧培养基并且替换1ml含有2.5×105个raji-luc细胞的新鲜完全x-vivo-15培养基，并且将得到的细胞混合物培育24小时。将该规程重复4天。实验和结果本实施例描述了通过在调控pd1和cd25基因的内源性t细胞启动子的控制下整合il-15/可溶性il-15受体α异二聚体(il15/sil15rα)表达盒改善cart细胞疗法的治疗结果的方法。因为已知两种基因在cart细胞的肿瘤结合时均被上调，所以它们可被劫持以便仅在肿瘤附近才重新表达il-il15/sil15rα。本方法旨在减少il15/sil15rα全身分泌的潜在副作用，同时保持其降低活化诱导的t细胞死亡(aicd)、促进t细胞存活、增强t细胞抗肿瘤活性和逆转t细胞无反应性的能力。开发以将il15/sil15rα整合到pd1和cd25基因座的方法在于在存在由aav6载体化的dna修复基质的情况下使用talen在两个基因座处产生双链断裂。该基质由嵌入il15/sil15rα编码区的两个同源臂组成，该编码区由2a顺式作用元件和调控元件(终止密码子和polya序列)分开。基于靶向的基因座及其对t细胞活性的参与，靶向的内源基因可以通过特定的基质设计失活或不失活。当cd25基因被认为是靶向的基因座时，设计插入基质以敲入(ki)il15/sil15rα而不使cd25失活，因为该基因的蛋白质产物被认为是t细胞功能必需的。相比之下，由于pd1参与t细胞抑制/t细胞耗尽，因此设计插入基质以防止其表达，同时使得能够表达和分泌il15/sil15rα。为了说明这种方法并证明原代t细胞中双靶向插入的可行性，设计了三种不同的基质(图2a、图2b和图2c)。由seqidno:36所表示的名为carm的第一个被设计为在存在trac(seqidno:16和17)的情况下，在trac基因座处插入抗cd22carcdna。第二个il-15_cd25m(seqidno:37)被设计使用cd25(seqidno:18和19)，将由2a顺式作用元件分开的il15、sil15rα和名为δlngfrcdna的表面标志物整合在刚好在cd25内源编码序列的终止密码子之前。第三个il-15_pd1m(seqidno:38)含有相同的表达盒并且被设计使用pd1(seqidno:20和21)整合在pd1开放阅读框的中间。这三种基质含有其他2a顺式作用元件，其位于上游表达盒中，以能够共表达il15/sil15rα和具有靶向的内源基因的car。首先，我们通过使用编码il15/sil15rα基质的aav6之一(seqidno:41；pcls30519)与编码car的基质一起转导t细胞，随后转染相应的评价t细胞中双靶向插入的效率。在存在编码trac(seqidno:22和23)及pd1(seqidno:24和25)或(seqidno:26和27)的mrna的情况下，aav6-辅助的基质载体化使得能够在多达46％的工程化t细胞中表达抗cd22car(图3)。为了确定在cd25和pd1基因座处il15m整合的程度，用抗cd3/cd28包被的珠或用表达cd22的raji肿瘤细胞活化工程化的t细胞。活化后2天，回收细胞并使用lngfr表达作为il15/sil15rα分泌替代物，通过facs进行分析(图4和图5)。我们的结果显示抗cd3/cd28包被的珠诱导含有il-15m_cd25或il-15m_pd1的t细胞表达δlngfr，其不依赖于抗cd22car的存在(图4a-b)。然而，肿瘤细胞仅诱导通过carm和il-15m两者处理的t细胞表达δlngfr。这表明通过car的肿瘤细胞接合可以特异性诱导δlngfr的表达(图5和图6)。如所期望的，内源性cd25基因仍在活化处理的t细胞中表达(图7和图8)，而pd1表达严重受损(图12)。为了验证δlngfr的表达与培养基中il15的分泌相关，在存在表达cd22的raji肿瘤细胞的情况下，将表达抗cd22car和δlngfr的t细胞(e:t比＝1:1)培育总计10天。在第2、4、7和10天回收上清液，并且通过elisa测定定量il15的存在。我们的结果表明il15仅由通过carm和il15m基质两者与其相应的一起共处理的t细胞在培养基中分泌(图13)。相对于静息t细胞，用这些基质中的任一种处理的t细胞都不能分泌任何显著水平的il15。有趣的是，发现il-15分泌水平是短暂的，最大峰值集中在第4天(图14)。为了评估分泌的il-15(seqidno:59)的水平是否可以影响cart细胞活性，以5:1的e:t比在存在肿瘤细胞的情况下将cart细胞共培养4天。通过造粒并将它们重新悬浮在缺少il-2且含有新鲜肿瘤细胞的培养基中，每天激发它们的抗肿瘤活性。通过测量表达荧光素酶的剩余raji肿瘤细胞的发光性，每天监测cart细胞的抗肿瘤活性。我们的结果表明，在所考虑的所有时间点，共表达il-15的cart细胞比缺乏il15的那些具有更高的抗肿瘤活性(图15)。因此，总的来说，我们的结果表明我们开发了一种允许在trac和cd25或pd1基因座处同时靶向插入car和il15cdna的方法。这种双重靶向插入导致了抗cd22car的稳健表达和培养基中il15的分泌。分泌的il15的水平足以增强cart细胞的活性。表5：实施例2和实施例3中提到的序列。表5(续)：实施例2和实施例3中提到的序列。表5(续)：实施例2和实施例3中提到的序列。实施例3：原代t细胞中，在b2m和trac基因座处nk抑制剂和car编码基质的-介导的双重靶向整合本实施例描述了通过延长它们的体内持久性，改善cart细胞疗法的治疗结果的方法。所述方法在于在存在在trac基因座递送car和在b2m基因座递送nk抑制剂的aav6修复载体的情况下，b2m和tcr的同时介导的敲除。该方法防止cart细胞以非特异性和tcr-介导的方式攻击宿主组织(移植物抗宿主攻击)并转移宿主t-和nk-细胞-介导的cart细胞的消耗。开发在b2m基因座处整合nk抑制剂的方法在于在存在由aav6载体化的dna修复基质的情况下使用在第一b2m外显子之一中产生双链断裂。该基质由嵌入nk抑制剂编码序列的两个b2m同源臂组成，该编码序列由2a顺式作用元件和调控元件(终止密码子和polya序列)分开。由于当在同种异体背景中转移时，cart细胞表面上的b2m表达可能促进它们的消耗，因此设计了修复基质的插入以使b2m失活并促进nk抑制剂的表达。为了说明这种方法并证明原代t细胞中双重靶向插入的可行性，设计了两种不同的基质(图19)。名为carm的第一个(seqidno31)被设计为在存在trac(seqidno16和17)的情况下，在trac基因座处插入抗cd22carcdna。第二个(hlaem)在两种变体(seqidno69和71)下被设计为使用b2m(seqidno80和81或者82和83—分别为右二聚体和左二聚体)将单链蛋白整合到b2m开放阅读框的中间，所述单链蛋白包括b2m、hlae和hlag肽部分的融合。所述两种基质含有其他2a顺式作用元件，其位于上游表达盒中，以能够共表达单链b2m-hlae-hlag肽和具有靶向的内源基因的car。表5中列出了多核苷酸和多肽序列。我们通过用trac和b2m转染它们并随后用编码抗cd22car和单链b2m-hlae-hlag肽的aav6修复基质转导它们来评价t细胞中双重靶向插入的效率。这种处理导致大于88％的tcr和hla-abc双重敲除，导致在双重敲除群体中约68％的抗cd22car的表达和在双重敲除的表达car的t细胞中约68％的hlae的表达。总体来说，该方法使得能够产生约40％的tcr/hla-abc阴性，car/hlae阳性t细胞(图21)。可以测定这些工程细胞对nk和同种异体反应性t细胞攻击的抗性。相同工程方法可以用于产生具有除hlae之外的nk细胞抑制剂的tcr/hla-abc阴性，car阳性t细胞并评价它们对nk细胞攻击的耐受性。可以对如图18所示的一系列具有不同的nk细胞抑制剂的tcr/hla-abc阴性，car阳性t细胞进行这种评价。该方法可以在于(例如)用trac和b2m转染t细胞并随后用编码car，如抗cd22car的aav6修复基质和编码不同的nk抑制剂的修复基质文库(或集合)转导它们：–包含vmaprtlfl肽的hlae三聚体基质(seqidno:68)，其可以在b2m基因座插入(seqidno:69)，–包含vmaprtlil肽的hlae三聚体基质(seqidno:70)，其可以在b2m基因座插入(seqidno:71)，–ul18三聚体基质_actine肽(seqidno:72)，其可以在b2m基因座插入(seqidno:73)，–ul18三聚体基质_hlacw肽(seqidno:74)，其可以在b2m基因座插入(seqidno:75)，–ul18三聚体基质_hlag(seqidno:76)，其可以在b2m基因座插入(seqidno:77)，三聚体还可以包含hlag肽，其可以用于形成这些三聚体，如选自下列的三聚体：hlag1(seqidno:84)hlag2(seqidno:85)hlag3(seqidno:86)hlag4(seqidno:87)hlag5(seqidno:88)hlag6(seqidno:89)hlag7(seqidno:90)hlae或hlag三聚体还可以包含选自下列(非限制性实例)的g肽(如图20所示)：肽1vmaprtlil肽2vmaprtlll肽3vmaprtlvl肽4amaprtlil肽5vmaprslil肽6vmaprslll肽7vmaprtlfl肽8vmaprilil肽9yllprrgprl肽10αilrl将所得的tcr阴性car和nk抑制剂阳性t细胞文库在存在nk细胞的情况下培养，并且可以回收剩余的活细胞并通过高通量dna序列分析以识别负责对nk细胞攻击的抗性的nk抑制剂。表6：对t细胞活化起反应的优选的人内源基因基因座表7：在免疫细胞活化期间具有稳定活性的优选的内源基因(依赖或非依赖于t细胞活化)的选择。符号基因说明cd3gcd3γrn28s128s核糖体rnarn18s18s核糖体rnarn7skrna，7sk，核actg1肌动蛋白，γ，细胞质1b2mβ-2微球蛋白rpl18a核糖体蛋白l18apabpc1多聚(a)结合蛋白，细胞质1gapdh甘油醛-3-磷酸脱氢酶rpl19核糖体蛋白l19rpl17核糖体蛋白l17rplp0核糖体蛋白，大，p0cfl1丝切蛋白1，非肌肉pfn1前纤维蛋白1表8：在t细胞活化时瞬时上调的基因的选择。表9：在t细胞活化时超过24小时上调的基因的选择。表10：在免疫细胞活化时下调的基因的选择。表11：在t细胞活化时沉默的人基因(安全港基因靶向的整合基因座)的选择。符号基因说明zfp640锌指蛋白640loc100038422未表征的loc100038422zfp600锌指蛋白600serpinb3a丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂，进化枝b(卵清蛋白)，成员3atas2r106味觉受体，2型，成员106magea3黑素瘤抗原，家族a，3omt2a卵母细胞成熟，αcpxcr1cpx染色体区，候选物1hsf3热冲击转录因子3pbsnprobasinsbp精胺结合蛋白wfdc6bwap四-二硫化物核心结构域6bmeiob减数分裂特异的，具有ob域dnm3os动力蛋白3，相反链skint11上皮内t细胞的选择和维持11表12：在肿瘤耗尽的浸润淋巴细胞(从多个肿瘤汇编而成)中上调的基因座的列表，其用于根据本发明的外源编码序列的基因整合基因名称uniprotid(人)cxcl13o43927tnfrsf1bp20333rgs2p41220tigitq495a1cd27p26842tnfrsf9q12933slaq13239inpp5fq01968xcl2q9ubd3hla-dmap28067fam3cq92520warsp23381eif3lq9y262kcnk5o95279tmbim6p55061cd200p41217c3h7ao60880sh2d1ao60880atp1b3p54709thadaq6yhu6park7q99497egr2p11161fdft1p37268crtamo95727ifi16q16666表13：在缺氧肿瘤条件下上调的基因座的列表，其用于根据本发明的外源编码序列的基因整合。序列表<110>塞勒克提斯公司（cellectis）<120>用于改善的免疫细胞疗法的nk抑制剂基因的靶向基因整合<130>p81604915pct02<150>pct/ep2017/076798<151>2017-10-19<150>pct/ep2018/053343<151>2018-02-09<160>90<170>patentinversion3.5<210>1<211>1000<212>dna<213>人工序列<220><223>pd1左同源<400>1ccaagccctgaccctggcaggcatatgtttcaggaggtccttgtcttgggagcccagggt60cgggggccccgtgtctgtccacatccgagtcaatggcccatctcgtctctgaagcatctt120tgctgtgagctctagtccccactgtcttgctggaaaatgtggaggccccactgcccactg180cccagggcagcaatgcccataccacgtggtcccagctccgagcttgtcctgaaaaggggg240caaagactggaccctgagcctgccaaggggccacactcctcccagggctggggtctccat300gggcagccccccacccacccagaccagttacactcccctgtgccagagcagtgcagacag360gaccaggccaggatgcccaagggtcaggggctggggatgggtagcccccaaacagccctt420tctgggggaactggcctcaacggggaagggggtgaaggctcttagtaggaaatcagggag480acccaagtcagagccaggtgctgtgcagaagctgcagcctcacgtagaaggaagaggctc540tgcagtggaggccagtgcccatccccgggtggcagaggccccagcagagacttctcaatg600acattccagctggggtggcccttccagagcccttgctgcccgagggatgtgagcaggtgg660ccggggaggctttgtggggccacccagccccttcctcacctctctccatctctcagactc720cccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaagg780ggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactg840gtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcag900ccagcccggccaggactgccg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