用作抗微生物剂及用于治疗癌症的肽及其药物组合物的制作方法

发明领域

本发明涉及化合物和药物组合物，其作为抗微生物剂在由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌和真菌引起的感染的治疗中应用。本发明也涉及化合物和药物组合物，其在癌症特别是乳癌的治疗中的应用。本文公开的化合物为赤拟谷盗(triboliumcastaneum)的防御素3来源的肽。

发明背景

抗菌肽(amps)是新的抗生素药剂的有希望候选，因为它们具有与常规抗生素相比不同的作用机制。它们是用于对抗抗生素耐药性的发展的优秀药剂。抗微生物肽推动细胞死亡的速度是有助于耐药性发展的可能性的减少的一个追加因素。而且，这些肽也能够与常规抗生素协同作用，增强和提高它们的治疗活性。

抗菌肽具有较小的尺寸，通常含正电荷，而亲水性与疏水性残基的比赋予其亲水又亲油的两亲特征。所述疏水性和阳离子特性的组合允许其与微生物膜进行静电作用，而微生物膜通常具有富含脂质的阴离子表面。

这些肽形成了从细菌到脊椎动物，以及真菌，昆虫和植物的所有的活生物体的先天免疫的一部分，但程度不相同。而在无脊椎动物中，这些肽构成了它们的免疫系统的主要防御工具，在脊椎动物中，它们也通过趋化活性，促炎信号和帮助痊愈过程而调节适应性免疫。

赤拟谷盗(triboliumcastaneum)为习性出没于储藏的食品的昆虫，并为用于研究发育生物学，进化，免疫等的模式生物。

contreras等.，2015的文献公开了鞘翅目赤拟谷盗(t.castaneum)(tc)的防御素的片段针对苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)(bt)的抗微生物效果。在该细菌的昆虫致病性毒素cry3aa和cry3ba的存在下，昆虫的幼虫产生了诱导赤拟谷盗(t.castaneum)的防御素2和3(tcdef2和tcdef3)的表达的免疫应答。所述文献公开了具有29个氨基酸的tcdef2的肽片段tcdef3-pep，其具有针对大肠杆菌(escherichiacoli)，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和白色念珠菌(candidaalbicans)的抗微生物活性，其中，对金黄色葡萄球菌(s.aureus)的敏感性尤其显著。肽tcdef3-pep对应于标记为本发明的seqidno：2的序列。

rajamuthiah等.，2015的文献公开了具有针对金黄色葡萄球菌的活性的抗微生物肽。作者公开了从赤拟谷盗(t.castaneum)获得的具有抗菌活性的肽(xm_968482，其编码肽xp_973575.3)。尽管作者的这篇文章指的是防御素1，在图1a中示出的氨基酸序列对应于赤拟谷盗(t.castaneum)的防御素3。

tonk等.，2015的文献公开了赤拟谷盗(t.castaneum)的防御素针对革兰氏阳性菌的抗微生物活性。所述三个防御素(def1，def2和def3)具有针对黄褐微球菌(micrococcusluteus)和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)的活性，而只有def1和def2具有针对表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermis)的活性。作者检验了所述防御素的针对金黄色葡萄球菌的活性，观察到针对该生物的抗微生物活性的缺乏(所述文献中的图2)。

五种具有最高死亡的癌症为肺癌，肝癌，结直肠癌，胃癌和乳癌。特别是乳癌，在欧洲具有最高的发生率(458,718例，总病例的13％)和全世界第二高的发生率(170万例，总病例的12％)，并分别占据死亡方面的第三和第五位。

乳腺癌呈现的肿瘤具有广泛的异质性，导致需要不同的分类系统：组织学，分子标志物和功能。从临床角度而言最广泛使用的分类为与分子标志物相关的，所述分子标志物包括：雌激素受体(er)，孕激素受体(pr)，和人表皮生长因子2(her2)。根据这些标志物的存在或不存在，乳腺肿瘤可以被分入四种基本亚型：er或pr阳性和her2阴性([er+|pr+]her2-)，er或pr阳性和her2阳性([er+|pr+]her2+)，er和pr阴性和her2阳性([er-|pr-]her2+)也作为her2阳性为人所知，最后，er和pr阴性和her2阴性([er-|pr-]her2-)也作为三阴性乳癌(tnbc)为人所知，三阴性乳癌(tnbc)为具有最差的预后的最凶险的形式。

乳癌的治疗需要对于每个患者个体化的多种学科的方法，结合了外科手术，放疗，化学疗法和激素治疗。三阴性乳癌表现出许多另外的问题，因为它缺乏受体的缘故，它对激素疗法没有响应，它关联了比其他乳腺肿瘤高4倍的扩散风险，复发的风险高峰在第一和第三年之间观察到，并具有在头一个五年出现的最多死亡。化学疗法是唯一改善tnbc的后果的治疗，但它对健康细胞的高细胞毒性和出现化学抵抗而已引导进行研究其他治疗选择，如分子靶向疗法。遗憾的是，这些疗法大多数关联了肿瘤细胞耐药性的获得，而所述获得限制了治疗的功效。一种期待的改进可能是开发出选择性杀死肿瘤细胞或限制它们的增殖，且不受已知的耐药性机制影响的针对三阴性乳癌的新药物。

发明详述

在具有抗微生物活性的产品范围内，本领域现状的问题为找到赤拟谷盗(t.castaneum)的防御素3来源的肽，其与本领域现有报道的赤拟谷盗(t.castaneum)的防御素3来源的肽相比具有改进的抗微生物活性。

本发明解决了所述问题，提供了本领域现有技术中未报道过的肽及其药物组合物，该新肽及其药物组合物具有意料不到的效果，并显示了与本领域现有公开的赤拟谷盗(t.castaneum)防御素3的其他来源的肽具有的抗微生物活性相比更高的针对金黄色葡萄球菌(s.aureus)的活性。

具有序列seqidno：1的肽有31个氨基酸，与contreras等.，2015公开的肽tcdef3-pep相比，每一末端有一个附加的氨基酸，这成为所述两种肽之间的结构差异。

在rajamuthiah等.，2015文献中公开的肽被命名为tca1，表现出针对金黄色葡萄球菌的活性，但它的序列具有44个氨基酸而不是seqidno：1的31个氨基酸。

在具有针对癌症的活性的产品的范围内，本领域现有的问题在于提供应用于癌症治疗中有效的化合物。

本发明解决了所述问题，提供包括序列seqidno：1的肽及其药物组合物，其在癌症的治疗中应用有效。这种在癌症治疗中的新用途以前在本领域现有技术中未被记载。

在本说明书中，术语“pask”是指以序列seqidno：1确定的肽。因此，在本说明书中，术语和表达“pask”、“由序列seqidno：1组成的肽”和“序列seqidno：1”可互换。

在本说明书中，术语“tcdef3-pep”是指以序列seqidno：2确定的肽。因此，本说明书中，术语和表达“tcdef3-pep”、“由序列seqidno：2组成的肽”和“序列seqidno：2”可互换。

肽和包含所述肽的药物组合物

本发明提供了由序列seqidno：1组成的肽。

在一个实施方式中，本发明提供了由序列seqidno：1和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体组成的药物组合物。

在一个实施方式中，所述载体选自由以下组成的组：

选自由脂质，纳米乳剂，聚合物胶束(polymermycelles)，sck纳米颗粒，脂质体，纳米凝胶，水凝胶，脂聚物(lipoplexes)，多聚物(polyplexes)组成的组的有机纳米颗粒；选自由白蛋白，纤维素，壳聚糖，藻酸盐，明胶，聚-ε-己内酯(pcl)，羟乙基淀粉(hes；mea)，聚乙醇酸酯(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物，聚丙交酯(pla)，聚d，1-丙交酯-乙交酯共聚物(plga)，聚乙二醇(peg)，n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(hpma)；phpma)和葡聚糖组成的组的聚合物；选自由聚醚-羟胺(peham)，聚酰胺-胺(pamam)，聚酯胺，聚丙烯亚胺和聚丙三醇组成的组的树枝状聚合物；选自由碳纳米管，聚d，1-丙交酯-乙交酯共聚物(plga)纳米纤维，聚乙二醇(peg)纳米纤维，壳聚糖纳米纤维，聚(乙烯醇)(pva)纳米纤维，聚丙交酯(pla)纳米纤维，聚环氧乙烷纳米纤维和聚-ε-己内酯(pcl)纳米纤维组成的组的纳米纤维；以及选自由金纳米颗粒，金属氧化物纳米颗粒，氧化钛纳米颗粒，氧化铂纳米颗粒，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(spio-nps)，基于金刚石的纳米颗粒和qd纳米颗粒组成的组的无机纳米颗粒。

在本说明书中，术语“纳米乳剂”是指两种不互溶液体的利用将分散的液滴稳定的乳化剂的异质性混合物。

在本说明书中，术语“聚合物胶束”指在存在被亲水冠包围的疏水性核的水介质中自组装的两亲性共聚物链。聚合物胶束包括聚离子复合体(pic)和聚合物-金属复合体胶束。

缩略语“sck”指“壳交联结型(shellcross-linkedknedel-like)”，在本说明书中，术语“sck纳米颗粒”是指在聚合物胶束中的在外壳中具有选择性交联的自组装的两亲性共聚物链。

在本说明书中，术语“脂聚物”是指由核酸(dna/rna)和阳离子脂质形成的复合体。包括聚乙二醇化(pegylated)的脂聚物。

在本说明书中，术语“多聚物”是指由核酸(dna/rna)和聚合物形成的复合体。包括聚乙二醇化的多聚物。

在本说明书中，术语“碳纳米管”是指具有单壁或多壁的圆柱形石墨片。

缩略语“spio-nps”指″超顺磁性氧化铁纳米颗粒″。

缩略语“qd”指“量子点(quantumdot)″，在本说明书中，术语″qd纳米颗粒”是指半导体无机纳米颗粒，广泛在成像技术中用作荧光剂。

在一个实施方式中，所述药物组合物包括有效量的存在序列seqidno：1的肽。

用于本发明的目的，有效量被定义为提供患者的情况的可识别客观改善(例如，由熟练观察者认可)的化合物的量，其中，所述患者经用包含所述量的化合物的物组合物治疗。

用于本发明的目的，药学上可接受的赋形剂为惰性成分，例如但不限于：助溶剂，表面活性剂，油，润湿剂，润肤剂，防腐剂，稳定剂和抗氧化剂。所述赋形剂或载体可以为例如稀释剂。所述药物组合物可以为结晶，粉末，颗粒，压实的固体，液态，溶液，悬浮液，酏剂，糖浆，乳剂，霜剂，凝胶，滴剂，雾剂，蒸汽或粉碎的形式。常规技术能够用于制备所述药物组合物。例如，所述药物组合物可以包含在胶囊，片剂，丸剂，长圆形丸剂，泡，包膜，注射器，药筒，喷雾或其他容器中。

本发明的药物组合物可以单独施用，或与其他活性成分组合。

本发明的药物组合物可以从各种方式施用至受试者，取决于治疗为局部或全身，并取决于要治疗的区域。因此，例如，本发明的药物组合物可以通过眼，阴道，直肠，鼻内，口服途径，通过吸入或肠外施用至受试者无论是由皮内，皮下，肌内，腹膜内，直肠内，动脉内，淋巴内，静脉内，鞘内，眼内，颅内，或气管内途径。如采用肠外施用，通常通过注射进行。用于注射的溶液可以以各种方式制备，如液体溶液或悬浮液，适合溶解或在注射前被放在悬浮液中的固体形式，或作为乳剂。肠外施用的其他形式使用延长或持续释放系统从而获得恒定的剂量。用于肠外施用的制剂包括水性或非水无菌溶液，悬浮液和乳剂，也能够包含缓冲剂和稀释剂或其他添加剂。非水溶剂可举例：丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和用于注射的有机酯如油酸乙酯。水溶剂可举例：水，水溶液，乳剂或悬浮液，其中包括盐水溶液和缓冲液。肠外载体可举例：氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，氯化钠和葡萄糖等。也可以存在防腐剂及其他添加剂，如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，惰性气体等。局部施用的制剂能够包括乳膏剂，乳液，凝胶，滴剂，栓剂，气雾剂，液体和粉末。也可能需要某些常规的药品载体，水基、油基、增稠剂等。用于口服施用的组合物可包括粉末或颗粒，在水或非水介质中的悬浮液或溶液，胶囊或片剂。优选包括增稠剂，芳香剂，稀释剂，乳化剂，分散剂等。

本发明的药物组合物可以以单或多剂量施用。

在一个实施方式中，所述药物组合物也包括抗生素剂。

在一个实施方式中，所述抗生素剂选自由夫西地酸(fusidicacid)，胂凡纳明(arsphenamine)，克林霉素(clindamycin)，氯霉素(chloramphenicol)，乙胺丁醇(ethambutol)，磷霉素(fosfomycin)，呋喃唑酮(furazolidone)，异烟肼(isoniazid)，林可霉素(lincomycin)，利奈唑胺(linezolid)，甲硝哒唑(metronidazol)，莫匹罗星(mupirocin)，呋喃妥因(nitrofurantoin)，吡嗪酰胺(pirazinamid)，平板霉素(platensimycin)，奎奴普丁(quinupristin)，利福平(rifampicin)和替硝唑(tinidazol)组成的组，或是选自以下类的抗生素：氨基糖苷类(aminoglucosides)，安沙霉素类(ansamycins)，碳头孢烯类(carbacefem)，碳青霉烯类(carbapenem)，头孢菌素类(cephalosporins)，糖肽类(glycopeptides)，大环内酯类(macrolides)，单环-内酰胺类(monobactamics)，青霉素类(penicillins)，多肽类(polypeptides)，喹诺酮类(quinolones)，磺胺类(sulfonamides)和四环素类(tetracyclins)。

作为药物和抗微生物剂应用的肽或药物组合物

在一个实施方式中，本发明提供了作为药物应用的由序列seqidno：1组成的肽或药物组合物。

在一个实施方式中，本发明涉及作为抗微生物药物应用的肽或药物组合物。

在优选的实施方式中，本发明涉及所述由seqidno：1组成的肽或包含其的药物组合物，其用作用于治疗由革兰氏阳性菌，革兰氏阴性细菌和真菌引起的感染的抗微生物药物。

在优选的实施方式中，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。

在优选的实施方式中，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌。

在优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌。

肽或药物组合物在癌症的治疗中应用

在一个实施方式中，本发明提供了包含序列seqidno：1的肽，或包含所述肽和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物，所述肽或药物组合物在癌症的治疗中应用。

在一个实施方式中，所述药物组合物包括有效量的包含序列seqidno：1的肽。

药学上可接受的赋形剂为惰性成分，例如但不限于：助溶剂，表面活性剂，油，润湿剂，润肤剂，防腐剂，稳定剂和抗氧化剂。所述赋形剂或载体可以为例如稀释剂。所述药物组合物可以为结晶，粉末，颗粒，压实的固体，液态，溶液，悬浮液，酏剂，糖浆，乳剂，霜剂，凝胶，滴剂，雾剂，蒸汽或粉碎的形式。常规技术能够用于制备所述药物组合物。例如，所述药物组合物可以包含在胶囊，片剂，丸剂，长圆形丸剂，泡，包膜，注射器，药筒，喷雾或其他容器中。

所述药物组合物可以单独施用，或与其他活性成分组合。

所述药物组合物可以从不同方式施用至受试者，取决于治疗为局部或全身，并取决于要治疗的区域。因此，例如，所述药物组合物可以经眼，阴道，直肠，鼻内，口服，通过吸入或肠外而施用至受试者，无论由皮内，皮下，肌注，腹腔内，直肠内，动脉内，淋巴内，静脉内，鞘内，眼内，颅内和气管内。如采用肠外施用，通常通过注射进行。用于注射的溶液可以以各种方式制备，如液体溶液或悬浮液，适合溶解或在注射前被放在悬浮液中的固体形式，或作为乳剂。肠外施用的其他形式使用延长或持续释放系统以获得恒定的剂量。用于肠外施用的制剂包括水性或非水无菌溶液，悬浮液和乳剂，也能够包含缓冲剂和稀释剂或其他添加剂。非水溶剂可举例：丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和用于注射的有机酯如油酸乙酯。水溶剂可举例：水，水溶液，乳剂或悬浮液，其中包括盐水溶液和缓冲液。肠外载体可举例：氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，氯化钠和葡萄糖等。也可以存在防腐剂及其他添加剂，如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，惰性气体等。局部施用的制剂能够包括乳膏剂，乳液，凝胶，滴剂，栓剂，气雾剂，液体和粉末。也可能需要某些常规的药品载体，水基、油基、增稠剂等。用于口服施用的组合物可包括粉末或颗粒，在水或非水介质中的悬浮液或溶液，胶囊或片剂。优选包括增稠剂，芳香剂，稀释剂，乳化剂，分散剂等。

药物组合物可以以单或多剂量施用。

在具体实施方式中，本发明提供了包括序列seqidno：1的肽，或含有包含序列seqidno：1的肽和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物，所述肽或药物组合物在癌症的治疗中应用。

在一个实施方式中，所述癌症选自由乳癌(breastcancer)，针对抗her2疗法有抗性的乳癌，乳腺癌(breastcarcinoma)，乳腺腺癌(breastadenocarcinoma)，胃癌，胃腺癌，结肠癌，结肠腺癌，胰癌，胰腺癌，肾细胞癌，肾透明细胞癌，卵巢癌，卵巢腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，肺癌，肺腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，甲状腺癌，转移性乳头状甲状腺癌，甲状腺滤泡性癌，膀胱癌，移行细胞癌的所述膀胱，前列腺癌，中枢神经系统胶质谱系癌(胶质瘤)，肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，人尤因肉瘤，子宫内膜基质肉瘤，骨肉瘤，横纹肌肉瘤，黑素瘤，胚胎癌，成神经细胞瘤，成神经管细胞瘤，成视网膜细胞瘤，肾母细胞瘤，肝母细胞瘤，血液癌症，b-细胞或t-细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤，b-细胞或t-细胞非霍奇金淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，b-细胞或t-细胞淋巴瘤，和多发性骨髓瘤组成的组。

在优选的实施方式中，所述癌症为乳癌。

在更优选的实施方式中，所述乳癌为三阴性乳癌。

本发明的肽与异质性肿瘤细胞有效地相互作用，使其发挥它们的固有抗癌活性或与其他治疗药剂协同作用，并表现出与其他治疗药剂相比更低的发展耐药性的可能性。

在一个实施方式中，所述肽或药物组合物用于与利用化疗剂的治疗，利用免疫治疗剂的治疗，或放射治疗进行组合而治疗癌症。

在一个实施方式中，所述化疗剂选自由阿纳托唑(anastrozol)，卡培他滨(capecitabine)，卡铂(carboplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)，环磷酰胺(ciclophosphamide)，顺铂(cisplatin)，多西他赛(docetaxel)，多柔比星(doxorubicin)，艾日布林(eribulin)，氟维司群(fulvestrant)，咪喹莫特(imiquimod)，来曲唑(letrozol)，紫杉醇(paclitaxel)，罗米地辛(romidepsin)，曲西立宾(triciribine)，依西美坦(exemestane)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracyl)和吉西他滨(gemcitabine)组成的组。

在一个实施方式中，所述免疫治疗剂选自由多韦替尼(dovitinib)，伊匹木单抗(ipilimumab)，拉帕替尼(lapatinib)，margetuximab，来那替尼(neratinib)，纳武单抗(nivolumab)，奥拉帕尼(olaparib)，帕博西尼(palbociclib)，帕博利珠单抗(pembrolizumab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，芦可替尼(ruxolitinib)，曲妥珠单抗(trastuzumab)和维利帕尼(veliparib)组成的组。

在癌症的治疗中应用的所述药物组合物的一个实施方式中，所述载体选自由以下组成的组：选自由脂质，纳米乳剂，聚合物胶束，sck纳米颗粒，脂质体，纳米凝胶，水凝胶，脂聚物，多聚物组成的组的有机纳米颗粒；选自由纤维素，壳聚糖，藻酸盐，明胶，聚-ε-己内酯(pcl)，羟乙基淀粉(hes；mea)，聚乙醇酸酯(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物，聚丙交酯(pla)，聚d，1-丙交酯-乙交酯(plga)，聚乙二醇(peg)，n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(hpma)；phpma)和葡聚糖组成的组的聚合物；选自由聚醚-羟胺(peham)，聚酰胺-胺(pamam)，聚酯胺，聚丙烯亚胺和聚丙三醇组成的组的树枝状聚合物；选自由碳纳米管，聚d，1-丙交酯-乙交酯共聚物(plga)纳米纤维，聚乙二醇(peg)纳米纤维，壳聚糖纳米纤维，聚乙烯醇(pva)纳米纤维，聚丙交酯(pla)纳米纤维，聚环氧乙烷纳米纤维和聚-ε-己内酯(pcl)纳米纤维组成的组的纳米纤维；以及，选自由金纳米颗粒，金属氧化物纳米颗粒，氧化钛纳米颗粒，氧化铂纳米颗粒，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(spio-nps)，基于金刚石的纳米颗粒和qd纳米颗粒组成的组的无机纳米颗粒。

在一个实施方式中，在癌症的治疗中应用的药物组合物进一步包括化疗剂或免疫治疗剂。

在优选的实施方式中，与所述组合的每一成员的个体施用相比，所述肽和化疗剂或免疫治疗剂的组合实现更加改善的癌症治疗。

在一个实施方式中，所述化疗剂选自由阿纳托唑，卡培他滨，卡铂，奥沙利铂，环磷酰胺，顺铂，多西他赛，多柔比星，艾日布林，氟维司群，咪喹莫特，来曲唑，紫杉醇，罗米地辛，曲西立宾，依西美坦，5-氟尿嘧啶和吉西他滨组成的组。

在一个实施方式中，所述免疫治疗剂选自由多韦替尼，伊匹木单抗，拉帕替尼，margetuximab，来那替尼，纳武单抗，奥拉帕尼，帕博西尼，帕博利珠单抗，帕妥珠单抗，芦可替尼，曲妥珠单抗和维利帕尼组成的组。

实施例3和4的结果显示，pask(由序列seqidno：1组成的肽)抑制肿瘤生长和增殖，调节细胞周期的进展，影响三阴性乳癌细胞的g1/s期转变。p53肿瘤抑制蛋白通常响应基因毒性应激而介导细胞周期的中断和凋亡。mda-mb-231细胞具有特异性突变，使p53在它们中失去功能。因此，利用pask进行的三阴性乳癌细胞的生长和增殖的抑制并不依赖p53，这使得极大的期待肽pask对于在其中p53经常发生突变的乳腺肿瘤中的治疗应用。

定义

在本说明书中，术语“癌症”可以涵盖所有的种类的致癌和/或癌性生长过程。在一些实施例中，癌症包括原发性肿瘤，以及具有恶性转化的转移性组织或细胞，组织或器官。在一些实施例中，所述癌症涵盖癌症所有的组织病理学和阶段，如侵袭/严重的阶段。在一些实施例中，所述癌症包括复发和/或耐药性癌症。术语“癌症”和“肿瘤”可以不区分地使用。

除另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域技术人员习惯理解的相同含义。在本发明的范围中，可以使用与本文描述的方法和材料相似和等同的方法和材料。

在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”、“其包括”及其变体是非限制性的，因此不应排除其他技术特征。

在整个说明书和权利要求书中，术语“由......组成”或“其由......组成”，特别是当与生物学序列有关时，是指本发明的化合物以精确的方式限制于由特定序列确定的片段中。

附图说明

图1.肽hbd-3、tcdef3-pep和pask针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。阴性对照(a)和阳性对照hbd-3(b)的在流式细胞仪窗获得的荧光图。肽tcdef3-pep(c)和pask(d)的在流式细胞仪窗获得的荧光图。在纵坐标中，fitc指荧光素并表明融入有sybrgreen的细胞。在横坐标中，percp-cy5.5-a指蛋白质多甲藻素-叶绿素，并与捕获了碘化丙啶的细胞相对应。窗p2显示活细胞，p3显示死细胞。

图2.在肽hbd-3、tcdef3-pep和pask之间针对金黄色葡萄球菌的细胞毒性比较。活性在25μg/ml的浓度两个重复中测量。显示为阴性对照(对照)，阳性对照hbd-3、tcdef3-pep和pask的活性。所述图显示了对于两个重复的平均值与相应的标准差。

图3.肽tcdef3-pep和pask针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。点代表两个重复的平均值与相应的标准差。用于肽tcdef3-pep的数据从contreras等.，2015获得。

图4.由肽引起的在金黄色葡萄球菌中的损伤的图像，通过扫描电子显微镜获得。示出了非用肽处理(a-b)，和用hbd-3(c-d)，tcdef3-pep(e-f)和pask(g-h)在25μg/ml浓度处理1小时的细胞。连续的箭头表明膜中的破裂和凸出。不连续的箭头表明细胞质碎片。刻度上显示的数字是3μm(a)，2μm(b)，4μm(c)，2μm(d)，4μm(e)，500nm(f)，2μm(g)和2μm(h)。

图5.通过扫描电子显微镜获得的生物膜图像由用tcdef3-pep(a)和pask(b)在25μg/ml浓度处理1h的金黄色葡萄球菌细胞产生。刻度上显示的数字为1μm(a，上图)，2μm(a，中图)，4μm(a，下图)，4μm(b，上图)，2μm(中图)和3μm(下图)。

图6.由肽引起的在金黄色葡萄球菌中的损伤的图像，通过透射电子显微镜获得。示出了非用肽处理(a-b)，和用hbd-3(c-d)，tcdef3-pep(e-f)和pask(g-h)在25μg/ml浓度处理1小时的细胞。表明了细胞质和细胞壁碎片(6)，肽聚糖的畸形，膜脱落和变薄(4)，细胞溶化(5)，细胞质形成空泡(7)，分裂隔膜的畸形(8)和一些仅在用肽pask处理细胞中出现的高电致密结构(9)。刻度上显示的数字是200nm(a)，100nm(b)，600nm(c)，200nm(d)，400nm(e)，200nm(f)，600nm(g)和200nm(h)。

图7.通过透射电子显微镜获得的生物膜图像，由用肽tcdef3-pep(a)和pask(b)在25μg/ml浓度处理1h的金黄色葡萄球菌细胞产生。刻度上显示的数字是400nm(a，左)，400nm(a，右)，400nm(b，左)，400nm(b，右)

图8.对于肽pask在三阴性乳癌细胞的两种细胞系，一种是人(mda-mb-231)一种是小鼠(4t1)，以及正常小鼠乳腺上皮细胞(hc-11)系中的细胞毒效果，通过mts试验确定。结果显示的为在0.5％胎牛血清温育24h。在三个情况下，肽pask在大约200μm(700μg/ml)浓度引起约50％的细胞死亡。

图9.肽pask抑制在人三阴性乳癌细胞(mda-mb-231)中的细胞增殖。细胞用俄勒冈绿温育。细胞增殖分析采用流式细胞术对于用俄勒冈绿荧光团标记的肿瘤细胞进行。示出非增殖性的对照(黑色的区域为峰值)，细胞非用肽处理白色的区域为峰值)和用50μm(200μg/ml)的肽pask处理(灰色的区域为峰值)的细胞的结果。

图10.肽pask针对mda-mb-231肿瘤细胞的细胞毒活性。流式细胞仪中获得的活和死细胞的图，对照(a)和用pask处理(b)。在纵坐标中，ssc-a(侧向散射)指选择的群体中的细胞的粒度。在横坐标中，percp-cy5.5-a指多甲藻素-叶绿素蛋白质，并与捕获了碘化丙啶的细胞相对应。活性在200μg/ml的浓度的两个重复中测量。活力图示出两个重复的平均和它们相应的标准差(c)。

图11.肽pask针对mda-mb-231肿瘤细胞的抗增殖活性。细胞周期进展的分析使用软件modfitlt，a)对照，b)pask(100μg/ml)。对于细胞周期的各种阶段检测细胞分布，重复两次。c)在细胞周期的每个阶段观察到的细胞的百分比图，示出了两个重复的平均和它们相应的标准差。星号表明在处理之间差异有统计学意义(学生t检验，p≤0.05)。d)细胞周期的概要图，示出由肽pask的作用影响的阶段。

图12.针对在差异蛋白质组学分析的对照和施用的重复中获得的蛋白质的定量测量，用软件markerview1.3进行判别分析。分析了8个样品(对照的4个重复(样品c1-c4)和用pask处理的4个重复(样品p1-p4))。

图13.根据分子功能的差异蛋白簇。以施用/对照比计，具有降低的丰度(a)和提高的丰度(b)的蛋白质簇。在uniprot(http：//www.uniprot.org)中执行。

图14.由pask引起的在mda-mb-231肿瘤细胞中的损伤的图像，通过扫描电子显微镜获得。示出了非用肽pask处理(a-b)，经用pask在100μg/ml的浓度处理72小时(d-f)的细胞。示出了在非经处理的细胞中的膜(1)及其扩张(5)。示出了经用pask处理的细胞的膜(2)和内陷和凸出(3)。刻度上显示的数字是10μm(a)，5μm(b)，10μm(c)，50μm(d)，10μm(e)和10μm(f)。

图15.由pask引起的在mda-mb-231肿瘤细胞中的损伤的图像，通过透射电子显微镜细胞获得。示出了非用肽pask处理(a-b)，经用pask在100μg/ml的浓度处理72小时(d-f)的细胞。示出了在非经处理的细胞中的膜(1)及其扩张(5)。示出了经用pask处理的细胞的膜(2)，内陷和凸出(3)和膜破裂和小泡及细胞质碎片(4)。刻度上显示的数字为2μm(a)，2μm(b)，2μm(c)，2μm(d)，1μm(e)，2μm(f)。

图16.在mda-mb-231细胞中，肽pask与多柔比星，紫杉醇，顺铂和5-氟尿嘧啶的组合处理的细胞毒效果。将在100μg/ml浓度的pask与各种化疗剂组合施用72h后，利用mts试验获得的细胞活力图。a)与多柔比星(0.10，0.25，0.50，1和2μm)的组合：4个重复的平均与相应的标准差。b)与紫杉醇(0.0001，0.001，0.01，1，10，100μm)的组合：4个重复的平均与相应的标准差。c)与顺铂(5，10，20，30，40，50，65和100μm)的组合：3个重复的平均与相应的标准差。d)与5-氟尿嘧啶(2，8，20，40，80，400，1000μm)的组合：4个重复的平均与相应的标准差。星号表明在处理之间差异有统计学意义(学生t检验，*p≤0.05和**p≤0.01)。

图17.用多柔比星和顺铂和以及两者与pask组合处理的mda-mb-231细胞的ec50的比较。a)利用多柔比星处理，和多柔比星与pask组合处理的ec50。b)利用紫杉醇处理，和紫杉醇与pask组合处理的ec50。c)利用顺铂处理，和顺铂与pask组合处理的ec50。d)利用5-氟尿嘧啶处理，和5-氟尿嘧啶与pask组合处理的ec50。3个重复的平均与相应的标准差。星号表明在处理之间在ec50中存在统计上的显著差异(学生t检验，*p≤0.05**p≤0.01)。ec50用在线软件https：//www.aatbio.com获得。

具体实施方式

材料和方法

使用的肽

本发明中使用的合成肽为：tcdef3-pep和pask，赤拟谷盗(t.castaneum)防御素3的片段，和人防御素hbd-3(peptanova)。

金黄色葡萄球菌金黄亚种(staphylococcusaureussubsp.aureus)的细菌菌株

使用的株为金黄色葡萄球菌金黄亚种的cect4013，公众可获得地保存于西班牙典型培养物保藏中心(cect)。

人乳腺肿瘤细胞系mda-mb-231

所述人乳腺肿瘤细胞系mda-mb-231被使用并鉴定为其细胞系公众可获得地保存于美国典型培养物保藏中心(atcc)。细胞补充胎牛血清10％，青霉素和链霉素1％和两性霉素b(fungizone)0.1％在75cm²培养瓶中进行培养，并维持在37℃、含有5％co2的气氛中。

样品的制备

将mda-mb-231细胞以密度的5x10⁴细胞每孔培养在6孔的皿中，其中添加了200μl或400μl的pask(终浓度100μg/ml和200μg/ml)，或在相应的对照中为相同体积的培养基(使用了溶剂以稀释所述肽)。将细胞在37℃温育72h。

用于金黄色葡萄球菌细胞的流式细胞术

从将金黄色葡萄球菌细胞在液体培养基lb(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％和nacl1％)在37℃在搅拌下培养过夜开始，在新液体培养基中获得等分试样并允许其生长到达到在600nm(od600)的光学密度为0.5，对在流式细胞仪中检测的最适条件。等分试样用5x10⁶cfu/100μl浓度的金黄色葡萄球菌制备，向其中添加了10，15，20和25μg/ml的pask，25μg/ml的tcdef3-pep和水(阴性对照)，使用了溶剂以稀释所述肽。混合物在37℃温育8h，并用染色所有的细胞的荧光染料sybrgreen(invitrogen)(25μl的sybrgreen25x溶液，在水中)，和染色死细胞的碘化丙啶(sigma)(10μl的碘化丙啶1mg/ml)进行标记。最后，采用流式细胞术，以设备bdfacsverse(bectondickinson)分析由肽引起的细胞死亡，来自巴伦西亚大学对于研究支持中心服务的细胞培养和流式细胞术部分。所述试验一式两份进行。

流式细胞仪使得细胞一个一个地通过针头，产成液体的细线并检测激光束(在使用的设备中氩气发射激光器在488nm)与细胞如何相互作用，这取决于入射光如何偏离和被激发的荧光染料发射的荧光。结果以用分析程序bdfacssuitev1.0.5.3841(bectondickinson)获得的图呈现。首先，用参数fsc(正向散射，forwardscatter)和ssc(侧向散射，sidescatter)获得对照图，以找到所有的细胞事件。这些参数分别提供了所述细胞的大小和粒度。然后，用参数ssc和fitc(指示所述细胞含有sybrgreen的荧光参数)获得第二张图，以区分细胞与可能存在于样品中的其他粒子。最后，用荧光参数fitc和percpcy5.5(指示用碘化丙啶染色的细胞)获得第三张图，以区分只被sybrgreen染色的细胞，与那些被碘化丙啶染色的已死的细胞。

对于人乳腺肿瘤细胞mda-mb-231的流式细胞术

为了估计细胞活力，将细胞系mda-mb-231的细胞用0.5μl的用于将死细胞染色的荧光染料碘化丙啶(pi)1mg/ml(sigma-aldrich)的1∶1000稀释液温育。

对于细胞系分析，使用了cycletest^tmplusdna试剂盒(sigma-aldrich)。使用柠檬酸盐缓冲液(含有柠檬酸钠，蔗糖和二甲基亚砜(dmso))进行两次洗涤，将每次的样品于300xg离心5min，并进行最后一次洗涤使得细胞数量被调整为5x10⁵，并在400xg离心5min，然后添加250μl的溶液a(在具有精胺四盐酸盐的洗涤剂缓冲液中含有胰蛋白酶)，200μl的溶液b(在具有精胺四盐酸盐的柠檬酸盐的稳定缓冲液中含有胰蛋白酶和核糖核酸酶a的抑制剂)和200μl的溶液c(包括pi和具有精胺四盐酸盐的稳定缓冲液)，在每一溶液的添加之间留有在室温中的10min的间隔，并将最后一个在过滤前在冷室和暗处中进行。用设备bdfacsverse(bectondickinson)进行由肽产生的细胞死亡，以及细胞的细胞周期的阶段的分析。细胞周期建模用软件modfitlt，版本3.3.11进行。所述试验一式两份进行。

mts方法

细胞活力采用mts方法确定。将在37℃中，大气加湿气氛，10％co2，96孔板中培养至密度5x10³细胞/孔的mda-mb-231细胞，用不同浓度的肽pask温育24h。然后向每孔添加20μlmts/pms(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基芬基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑/吩嗪硫酸甲酯)溶液，并在暗处温育2h后，在读板仪中读取490nm的吸光度。根据算式(1-e/c)×100计算了细胞数量的减少百分比，其中，e为用肽处理的细胞的吸光度，c为对照细胞的样品的吸光度。

金黄色葡萄球菌细胞的扫描电子显微镜

细胞以与用于流式细胞术技术中同样的方式制备，并进行了相同的等分试样和处理。样品在37℃温育1h。细菌用karnosky(2.5％多聚甲醛和0.5戊二醛)在4℃固定2h。在洗涤(离心和除去上清)后，再将它们用2％四氧化锇固定一个2h，再次洗涤并用0.2μm滤器过滤。然后将细胞在梯度乙醇系列(30°，50°，70°，90°，100°)中脱水，每级10min。为了实现临界点干燥，将乙醇替换为液态co2，提高温度以加速蒸发，压力被慢慢降低以保全细菌的精确形状。最后，用金钯进行遮光2min，在设备feg-semhitachis4800中在10kv观察结果。

人乳腺肿瘤细胞mda-mb-231的扫描电子显微镜

对mda-mb-231细胞而言，对照或用100μg/ml的pask处理如在“样品的制备”部分表明的那样制备，细胞用karnosky(2.5％多聚甲醛和0.5％戊二醛)在4℃固定2h。在洗涤(离心和除去上清)后，再将它们用2％四氧化锇固定一个2h，再次洗涤并用0.2μm滤器过滤。然后将细胞在梯度乙醇系列(30°，50°，70°，90°，100°)中脱水，每级10min。为了实现临界点干燥，将乙醇替换为液态co2，将温度提高以加速蒸发，压力被慢慢降低以保全细胞的精确形状。最后，用金钯进行遮光2min，在设备feg-semhitachis4800中在10kv观察结果。

金黄色葡萄球菌细胞和人乳腺肿瘤细胞mda-mb-231的透射电子显微镜

在用乙醇梯度脱水的系列中只接触了90°级，除此以外，样品以对于扫描电子显微镜同样的方式制备。然后将样品以4个步骤放入树脂中：乙醇96°-树脂lr-白色2∶1(20h)，乙醇100°-树脂2∶1(20h)，乙醇100°-树脂1∶2(20h)和100％树脂(在60℃，24h)。在样品包含在树脂中后，将块制备用于在设备leicauc6ultracutmicrotome中进行60nm的超薄切片。最后，将切片与铅进行对比，结果在设备temjeol-jem1010中在70kv观察。

实施例1.肽pask针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的分析

在本实施例中，将肽pask的抗微生物活性与相比肽tcdef3-pep的抗微生物活性进行比较。肽tcdef3-pep针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性被记载在contreras等.，2015中。

采用流式细胞术确定肽pask的抗微生物活性。技术基于被细胞的光散射及荧光染料的使用，从而在活和死细胞之间甄别。所有的细胞对荧光染料sybrgreen都可渗透，而只有死细胞对碘化丙啶是可渗透的，因为后者需要细菌膜被破坏以渗透入该细胞。因此使用这两种荧光染料提供了测定有活力的细胞的方法，从有碘化丙啶在内的死细胞的增加来定量细胞活力的损伤。

在用25μg/ml的肽tcdef3-pep和pask温育金黄色葡萄球菌的cect4013株的细胞后，测定死细胞的百分比。作为阳性对照，使用相同浓度的人防御素hbd-3，其具有针对许多种类的微生物包括金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。图1a-1d示出在流式细胞仪的窗中获得的荧光的相应的图。窗p2显示活细胞，窗p3显示死细胞。

图2显示了对于用每种肽处理的和对照的细胞，对死细胞的百分比和标准差(sd)的两个重复的分析。hbd-3和tcdef3-pep的细胞毒性分别为约70％和55％。然而，肽pask表现出几近于100％的细胞死亡百分比。在3种肽相对于阴性对照，肽pask也相对于tcdef3-pep和hbd-3中，死亡经双尾学生t检验判明为具有统计学意义，p≤0.05(图2)。

对抗微生物活性而言，也在与之前的试验相同的条件下对更低浓度，10，15和20μg/ml的肽pask进行了分析。图3示出在所述浓度的细胞死亡的百分比。可以看到，在肽tcdef3-pep显示的死亡百分比为9.2％的10μg/ml浓度中(contreras等.，2015)，肽pask已经显示了接近100％的细胞毒性。

实施例2.肽tcdef3-pep和pask对金黄色葡萄球菌的形态的影响

扫描电子显微镜

使用提供高分辨率的图像的扫描电子显微镜，以观察看到由肽引起的对细菌膜的损伤。细胞的金黄色葡萄球菌cect4013用浓度为25μg/ml的肽hbd-3、tcdef3-pep和pask处理1h，并使用扫描电子显微镜分析(图4)。在没有处理的细胞中，观察到典型的金黄色葡萄球菌的圆状和均匀形态，具有完整的膜，而在经处理的细胞中可以见到各种种类的形态学改变。用hbd-3处理的细胞的图像显示结构损伤和膜的溶化(连续的箭头)，以及的细胞质内容的重要释放(不连续的箭头)。在用肽tcdef3处理的细胞中，在细菌膜中观察到凸出(连续的箭头)和一些细胞质碎片(不连续的箭头)，尽管比利用hbd-3处理的扩散小。最后，用肽pask处理的细胞显示出膜的不规则的形态学(连续箭头)和完全的细胞崩解，以及随后的细胞质碎片释放(不连续箭头)。通过这种处理，观察到了小于金黄色葡萄球菌的细胞的小的圆状的结构。

通过扫描电子显微镜获得的用肽处理的细胞的图像显示了细菌中的生物膜的形成(图5)。排除了表多糖的形成是由缺乏营养物质或培养基的其他特征而引起，因为用hbd-3处理(阳性对照)和那些载有水(阴性对照)的样品利用相同的培养基生长，而没有形成生物膜(图4)。

透射电子显微镜

使用高分辨率的图像的透射电子显微镜，以观察由肽在细菌内引起的超微结构损伤。将金黄色葡萄球菌cect4013的细胞用肽hbd-3、tcdef3-pep和pask在25μg/ml浓度处理1h，并使用透射电子显微镜分析(图6)。在没有处理的细胞中，观察到完整的细胞质膜(3)和肽聚糖壁(2)，这是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌特有的，以及没有畸形的分裂隔膜(1)，而在经处理的细胞中观察到了不同种类的改变。用hbd-3处理的细胞的图像显示了膜的畸形(4)和溶化(5)，以及细胞质内容的重要释放，脱落的壁残体(6)和细胞质的空泡形成(7)。用肽tcdef3-pep处理的细胞显示了在细菌膜中的畸形和凸出(4)，一些细胞质碎片和脱落的壁残体(6)。最后，用肽pask处理的细胞显示了膜的脱落，畸形和变薄(4)，细胞质碎片的逸出(6)和分裂隔膜的畸形和抑制(8)。观察到小尺寸的圆状结构(9)。这些结构显示出与细胞不同的电致密度，及细胞质膜和肽聚糖壁的缺乏。在透射电子显微镜获得的图像中也观察到由用肽处理的细胞形成的生物膜(图7)，而在用人防御素hbd-3处理的细胞中没有观察到(图6)。

实施例3.肽pask的细胞毒和抗增殖活性的分析

肽pask的细胞毒效果在三阴性乳癌细胞的两种细胞系，一种是人(mda-mb-231)一种是小鼠(4t1)，以及正常小鼠乳腺上皮细胞(hc-11)系中进行了研究。为此，进行了基于使用从四氮唑来源的化合物的细胞活力mts分析，所述化合物在活细胞中被还原而形成可溶性的有色产物。

在不同时间(3h，24h和48h)，存在不同浓度(0.5％和10％)的胎牛血清的检验下测试了各种浓度(5μg/ml至700μg/ml)的肽，因为如已报道的那样，血清影响抗微生物肽的活性。获得的结果显示，对于在检验中为0.5％的胎牛血清浓度并温育24h的情况下，肽pask表现出的细胞毒活性在研究的三阴性癌症细胞的两种细胞系中，以及在正常乳腺上皮细胞系中为剂量依赖性，在所述三种情况下，在大约200μm(700μg/ml)浓度中引起细胞中的约50％死亡(图8)。这些数据证实，肽pask在高浓度在哺乳动物细胞中表现出细胞毒活性。然而，在约100μm(400μg/ml)的肽浓度的范围中，pask对于人三阴性乳癌细胞(mda-mb-231)导致了更显著的细胞毒性。

采用流式细胞术对用荧光团俄勒冈绿标记的肿瘤细胞进行细胞增殖分析，随后用50μm(200μg/ml)浓度的肽pask处理或使用水作为对照。该分析允许探讨pask在组合治疗方法中的用途。将意在抑制肿瘤生长和维持的治疗药剂与能够刺激患者免疫应答药剂在癌症的治疗中组合使用，是可替换仅基于细胞毒药剂的常规方法的治疗途径，用于降低在癌症治疗中与细胞毒药剂的独占使用相关的两个主要问题的影响：非特异性毒性和耐药性的出现。

试剂俄勒冈绿(oregongreen)与细胞的游离氨基共价结合，在每一次细胞分裂中付与分配在子细胞之间的相等的同质荧光。因为细胞荧光强度大约随着每一次细胞分裂而减半，因此与细胞的初始荧光强度相比，在利用肽处理后的和在非经处理的对照细胞中的最终荧光强度提供了关于在每一情况下出现过多少细胞分裂周期的信息。图9显示了获得的结果。用肽pask处理的细胞比非经处理的细胞显示更大的荧光强度，表明肽抑制人三阴性乳癌细胞的增殖。

实施例4.肽pask的细胞毒和抗增殖活性的分析

在本实施例中，通过流式细胞术评估肽pask的细胞毒和抗增殖活性，进行细胞活力的分析和细胞周期的分析。在用200μg/ml(细胞活力试验)和100μg/ml(细胞周期分析的)的pask处理肿瘤细胞mda-mb-231后，确定了有活力的细胞的百分比，以及增殖发生停止的细胞周期的阶段。

图10a和10b显示了关于显示在图中的基于碘化丙啶(pi)的荧光的细胞活力的图，获得自流式细胞术(区p3与死细胞相对应)。在对照试验中(图10a)获得了98％的细胞活力，而在用pask处理中(图10b)细胞活力为93％。

图10c显示了针对用pask处理和针对对照细胞的活细胞的百分比和标准差(sd)的两个重复的分析。利用200μg/ml浓度的肽pask的死亡百分比对于mda-mb-231细胞为约5％，与对照相比具有统计学意义。

图11a和11b显示了采用流式细胞术检测碘化丙啶的荧光而获得的在细胞周期的每个阶段发现的细胞分布的图。关于对照细胞和在经用pask处理的细胞中观察到如下分布：在g1期中分别为52.0％和57.9％，在s期中分别为40.0％和33.2％，和在g2期中分别为8.0％和9.0％。

图11c显示了对于用pask处理的和对于对照的细胞在细胞周期的每个阶段，g1，s和g2的细胞的百分比，及两个重复的分析的标准差(sd)。使用双尾学生t检验进行比较，研究在对照细胞和用肽处理的细胞之间的周期的每个阶段是否有统计学意义的差异。图11d为细胞周期的概要示意，显示了被肽pask的作用影响的阶段。

肽pask显示出抗增殖活性，因为经处理的细胞呈现细胞的百分比在s期中具有统计学意义减少，在g1期中增加，尽管后者缺乏统计学显著性(图11c和11d)。

实施例5.在用肽pask处理的三阴性乳癌细胞中的差异蛋白质组学分析

通过swath进行差异蛋白质组学分析，以确定肽发挥针对三阴性乳癌细胞mda-mb-231的抗增殖活性但不杀死细胞的分子机制。

分析了八个样品(对照的4个重复和用pask处理的4个重复)识别了共计1,571种蛋白质(fdr1％)。使用软件markerview1.3对定量的数据进行了判别分析，获得两种明确区分的组，即对照重复和处理重复(图12)。

对于两种条件(对照和施用)进行了学生t检验(p≤0.05)后，在共计1,571个定量蛋白质(fdr1％)中的31个有差异表达。其中，与对照相比，在施用中有24个降低了丰度的和7个提高了的(分别在表1中为无阴影和阴影的)。

表1在经用肽pask处理的和未处理的mda-mb-231细胞中的蛋白差异表达。与对照样品相比，在经处理的样品中，无阴影和有阴影的蛋白质分别降低和提高了它们的丰度(学生t检验，p≤0.05)。t表示经处理的样品，c表示对照样品。

此外，将差异蛋白质在uniprot中归组入功能簇，其中，簇在以在施用/对照比计具有降低的丰度和提高的丰度的蛋白质两者中均以描述性形式显示。图13示出了根据分子功能的分配。在具有降低的丰度的蛋白质之间，大多数的功能对应于结合蛋白质(91.7％)，其显示催化活性(33.3％)，以及结构分子活性(16.7％)，分子功能调节剂(12.5％)以及最终，转录共激活因子，转运蛋白和翻译起始因子(4.2％)(图13a)。另一方面，在具有提高的丰度的蛋白质之间大多数也为结合蛋白质(85.7％)，它们具有催化活性(71.4％)，具有抗氧化活性和酶调控活性，每一种(28.6％)，并最终具有电子运输活性(14.3％)(图13b)。

差异蛋白质组学分析的结果证实，肽pask作用于细胞内靶点。在具有统计学意义的差异表达的31种蛋白质中，在用肽处理的mda-mb-231细胞中有24个降低了它们的表达，有7个提高了(表1)。这些都是具有致癌能力的蛋白，其中一些的被记载为在各种种类的肿瘤细胞中为过表达，并且其参与例如，在小泡的运输，信号转导和凋亡中，在代谢途径的改变，dna修复，转录或转录后调控和翻译过程，扩散相关的细胞粘附和运动，和对氧化应激的反应中。

关于细胞周期的调节，在经用pask处理的细胞中表达降低的24种蛋白质中，真核翻译起始因子3b(eif3b)，核糖体蛋白质s13和l5(分别为rps13和rpsl5)和la相关蛋白蛋白1(larpl)脱颖而出。eif3为组织在与亚单位40s相关的许多真核转导起始因子之间的相互作用网络的蛋白复合体，而亚单位40s参加参与翻译的各种反应。它也具有其他调控功能，如重新启动多顺反子mrna的翻译，并作为针对控制蛋白合成的激酶蛋白质的受体。有报道显示：eif3b表达的下调引起细胞积累在阶段g0/g1中，显著降低在s期中的肿瘤细胞数量，表明eif3b可能与dna复制的抑制，导致更低的细胞生长速度相关。

核糖体蛋白质s13和l5分别形成核糖体的亚单位40s和60s的部分。前面已经描述过，rps13在胃癌细胞中的过表达促进生长和从细胞周期的g1期至s期的转变，而当rps13在所述细胞中下调时，停止在g1期中的细胞数量提高。据记载，rpl5的丢失阻止核糖体的生物发生和蛋白合成。该丢失不导致细胞周期的完全关闭，但强烈抑制其进展。因此，eif3b和rpl5两者的减少将诱导一个独立于p53的对于细胞周期的控制点。这些结果与在实施例4中在肽pask的抗增殖活性分析中获得的那些一致，那些结果显示在s期中的mda-mb-231细胞显著减少(图11c)，这表明了一个独立于p53的细胞周期控制，因为如上所述，mda-mb-231细胞具有发生了突变的非功能性的p53基因。

在用肽pask处理的细胞中三个具有提高的丰度的蛋白质为谷胱甘肽过氧化物酶1(gpx1)，硫氧还蛋白还原酶1(txnrd1)和硫化物：醌氧化还原酶(sulphide：quinoneoxidoreductase，sqrdl)。所述三种蛋白质参与对氧化应激的响应，并通常在肿瘤细胞中过表达。由于针对氧化的保护激活生存基因和抑制凋亡，所述蛋白质的过表达可能是mda-mb-231细胞对肽pask抗癌活性的反应。

实施例6.肽pask对三阴性乳癌细胞的形态的影响

扫描电子显微镜和透射电子显微镜都提供高分辨率图像，用于看到由肽pask在肿瘤细胞的膜和内部引起的形态学和超微结构变化。mda-mb-231细胞用浓度100μg/ml的肽pask处理72h，使用扫描电子显微镜(图14)和透射电子显微镜(图15)分析。图像显示，肽pask诱导了mda-mb-231肿瘤细胞中的显著形态学变化。在扫描电子显微镜和透射电子显微镜的非经处理的细胞两者中显示了圆状形状，具有连续和完整的膜和人细胞的典型绒毛(1)。然而，在经用pask处理的细胞中观察到不规则的膜，其中绒毛表现为正在破裂而形成正在崩溃的结构(2)。此外，观察到高度明显的内陷(3)和膜的完全破裂，在某些情况下重新发生环化而形成具有细胞质残基的小泡(4)。尽管非经处理的细胞也显示出似乎是膜扩张，但膜为连续的(5)，而不是像在经处理的细胞中那样中断。这些结果清楚地表明，肽pask具有膜溶性作用机制。

实施例7.用肽pask与化疗剂的组合处理在三阴性乳癌细胞中的细胞毒效果的分析

在本实施例中，将mda-mb-231三阴性乳癌细胞以7.5x10³细胞每孔的密度，和50μl体积的补充胎牛血清10％的培养基dmem/f-12接种在96孔平板中，并允许在37℃在含有5％co2的气氛中温育24h，以促进细胞粘附。用化疗剂或与pask的组合处理通过每孔总体积100μl，含有5％胎牛血清以限制所述肽的归因于血清蛋白酶的降解而进行。细胞在37℃温育72h。

对于mts试验，每一孔添加10μl的mts溶液并允许在37℃温育3h。用设备perkinelmerwallac1420victor2微孔板读板仪测量在490nm的吸光度。

在经用肽pask处理的和未处理的mda-mb-231三阴性乳癌细胞中的差异蛋白质组学分析揭示，蛋白质urod，asna1，tm9sf4和larp1显著减少。在本领域现有技术中有记载，所述蛋白质表达的减少增加了肿瘤细胞对各种化疗剂的敏感性。为了确定pask是否使mda-mb-231细胞对化疗剂敏感，分析了在100μg/ml浓度的肽pask(在该浓度，肽本身具有具有统计学意义的3％至10％的细胞毒性)，与各种浓度的化疗剂多柔比星(0.10，0.25，0.50，1和2μm)，紫杉醇(0.0001，0.001，0.01，1，10，100μm)，顺铂(5，10，20，30，40，50，65和100μm)和5-氟尿嘧啶(2，8，20，40，80，400，1000μm)组合处理的细胞毒效果，采用mts比色法分析细胞活力。

图16a示出用于在用多柔比星和多柔比星与pask的组合处理细胞后的4个重复分析获得的百分比细胞活力和标准差(sd)。观察到在所有测试的多柔比星的浓度下，与仅用多柔比星处理细胞比，在用多柔比星与pask组合处理的细胞毒性中具有统计学意义的增加。

图16b示出用于在用紫杉醇和紫杉醇与pask的组合处理细胞后的4个重复分析获得的百分比细胞活力和标准差(sd)。在这种情况下，仅当紫杉醇浓度为0.001μm时，与仅用紫杉醇处理相比，在紫杉醇与pask的组合处理中观察到细胞毒性的差异有统计学意义。

图16c示出用于在用顺铂和顺铂与pask的组合处理细胞后的3个重复分析获得的百分比细胞活力和标准差(sd)。观察到在所有测试的顺铂的浓度下，与仅用顺铂处理细胞比，在用顺铂与pask组合处理的细胞毒性中的增加具有统计学意义。

图16d示出用于在用5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶与pask的组合处理细胞后的4个重复分析获得的百分比细胞活力和标准差(sd)。在这种情况下，与在5-氟尿嘧啶的三个浓度(8，20和40μm)下仅用5-氟尿嘧啶处理相比，在5-氟尿嘧啶与pask的组合处理中观察到细胞毒性的差异有统计学意义。

在图17a中，对于利用多柔比星处理观察到ec50＝0.407±0.033μm，而对于利用多柔比星与pask组合处理，观察到ec50＝0.077±0.026μm。示出了3个重复的分析的平均以及它们的标准差(sd)，确定与仅用多柔比星处理相比，用多柔比星与pask组合处理在ec50中的减少具有统计学意义。

在图17b中，对于紫杉醇处理观察到ec50＝0.008±0.005μm，而对于利用紫杉醇与pask组合处理，观察到ec50＝0.003±0.002μm。示出了3个重复分析的平均以及它们的标准差(sd)，确定与仅用紫杉醇处理相比，用紫杉醇与pask组合处理在ec50中的减少没有统计学意义。

在图17c中，对于顺铂处理观察到ec50＝168.16±53.89μm，而对于利用顺铂与pask组合处理，观察到ec50＝22.50±4.29μm。示出了3个重复的分析的平均以及它们的标准差(sd)，确定与仅用顺铂处理相比，用顺铂与pask组合处理在ec50中的减少具有统计学意义。

最后，在图17d中，对于用5-氟尿嘧啶处理观察到ec50＝25.34±4.33μm，而对于用5-氟尿嘧啶与pask组合处理，观察到ec50＝12.22±2.72μm。示出了3个重复的分析的平均以及它们的标准差(sd)，确定与仅用5-氟尿嘧啶处理相比，用5-氟尿嘧啶与pask组合处理在ec50中的减少具有统计学意义。

序列表中的自由文本

seqidno：1

赤拟谷盗(triboliumcastaneum)防御素3；pask片段

seqidno：2

赤拟谷盗(triboliumcastaneum)防御素3；tcdef3-pep片段

参考文献

-contreras，e.，benito-jardón，m.，lópez-galiano，m.j.，real，m.d.andrausell，c.(2015).triboliumcastaneumimmunedefensegenesaredifferentiallyexpressedinresponsetobacillusthuringiensistoxinssharingcommonreceptormoleculesandexhibitingdisparatetoxicity.developmentalandcomparativeimmunology.50，139-145.

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