使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法与流程

本发明涉及一种使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法，优选地，涉及一种能够扩增恙虫病东方体(orientiatsutsugamoshi)——恙虫病的致病菌——的多拷贝基因的碱基序列的引物，以及使用所述引物诊断恙虫病的方法。

背景技术：

恙虫病是一种急性发热性疾病，其由被恙虫病东方体感染的恙螨科幼虫感染，并且显示出以全身性血管炎为特征的临床表现。主要宿主是啮齿类动物，螨类动物既是宿主也是介体。自从1951年在韩国首次将其作为一种主要的秋热病报道以来，该病在韩国在9月至11月之间发生。尤其是，在韩国是一种常见病，因为在秋季30％的患者被诊断为恙虫病。

症状包括被受感染的螨幼虫叮咬后，经过1-3周的潜伏期后，初期症状伴有发烧、发冷、头痛和肌肉疼痛，在胸部、腹部、躯干或上下肢以及极少情况下在脸部或在手掌、足底出现红斑和丘疹。发病几天内在受感染的螨叮咬的皮肤上出现黑色痂覆盖的焦痂(eschar)，在大多数情况下，没有诸如疼痛或瘙痒的症状，焦痂的确认有助于快速诊断。

通常，该病程并不严重，并且对抗生素治疗反应良好，但是延迟诊断可能导致肺炎、急性肾衰竭、脑膜炎、脑炎、上消化道出血、多器官功能障碍综合征、甚至心肌炎或中风。这种并发症可能会导致某些患者死亡。

因此，快速准确的诊断对于改善患者的预后至关重要。

诊断恙虫病的方法包括：培养、分离来自患者的血液的恙虫病东方体、并在患者的血清中检测针对恙虫病东方体的抗体的方法。但是，通过培养菌体诊断疾病的方法需要数周以上的培养时间，对于诊断实际患者的目的并不合适。

在诊断中最常用的检查方法是间接免疫荧光抗体法(ifa)、被动血集反应(pha)和免疫色谱法(immonochromatography)。

使用这些抗体的诊断方法通常在症状发生1-2周以后被检出，因此，灵敏度非常低，且假阳性多，无助于诊断。

例如，参考图1，使用间接免疫荧光抗体法(ifa)诊断恙虫病的方法是疾病预防控制中心公开的方法之一，其在当ifaigg抗体滴度为1∶256以上时就判定为确诊恙虫病。

但是，抗体上升并被诊断可能需要数周，并且46.7％的灵敏度相对较低，如果在症状发生1周内就医，只有所有患者的42.1％可以被诊断为恙虫病，因此需要更加快速且容易判定的新的诊断方法。

作为替代的诊断方法，已经提出了基于聚合酶链反应(pcr)的检测方法。pcr是一种可以指数地扩增dna所需部分的拷贝(copy)数的分子生物学方法。不管是dna的任何部分，只要知道其序列，则可以通过pcr进行扩增。

pcr方法包括以常规方式进行的常规(conventional)pcr，从常规方法改进的并且比常规pcr方法灵敏100倍的嵌套式(nested)pcr方法、以及可以实时监测(monitoring)pcr反应并且可以在2小时的短时间内确认结果的实时定量荧光(realtime)pcr方法。

通常，在恙虫病的pcr诊断方法中，已经尝试了使用诸如46kda、57kda、groel的各种靶蛋白基因(targetproteingene)的pcr，并且主要使用嵌套式pcr和实时pcr，而不是常规pcr。在恙虫病的诊断中常规pcr的灵敏度极低，在10％内。在嵌套式pcr的情况下，可以通过进行两次pcr来提高灵敏度，但存在着比别的pcr所需的检查时间更长的缺点以及由于进行两次pcr，由基因的污染(contamination)导致假阳性率增加的缺点。

虽然有通过执行实时监测pcr反应的实时定量荧光pcr的快速诊断的方法，但是由于检查设备非常昂贵，因此难以在医疗机构中普遍使用。

因此，急需开发在显示出高灵敏度和特异性的同时通常简单且费用少的诊断方法。

技术实现要素：

技术问题

本发明是为了解决上述问题而提出的，本发明的最大目的在于，提供一种使用恙虫病东方体菌的多拷贝基因来诊断恙虫病的方法。

优选地，本发明的目的在于，提供了一种使用能够扩增多拷贝基因的碱基序列的引物对来诊断恙虫病的方法。

另外，本发明的第二个目的在于，提供了一种包括特定碱基序列的引物对。

另外，本发明的第三个目的在于，提供了一种包括由特定碱基序列组成的引物对的pcr诊断试剂盒。

优选地，本发明的目的在于，通过提供一种由灵敏度和特异性优异的特定碱基序列组成的引物对来提供一种能快速诊断恙虫病菌的pct诊断试剂盒。

问题的解决方案

为了实现上述的第一个目的，本发明公开了包括能够扩增恙虫病东方体菌的多拷贝基因的碱基序列的特定碱基序列的引物。本发明的引物包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的1种以上的碱基序列。

优选地，本发明的引物对包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的2种以上的碱基序列。

更优选地，所述引物对可以包括序列号1和序列号2的碱基序列。

为了实现本发明的第二个目的，本发明的恙虫病的诊断方法可以使用能够扩增多拷贝基因(multicopygene)的碱基序列的引物对进行检测。

所述诊断方法可以包括以下步骤：(a)从样本分离dna的步骤；(b)以所述分离的dna为模板，使用序列号1至序列号36的引物对执行pcr的步骤；以及(c)分离所述pcr产物的步骤。

为了实现本发明的第三个目的，恙虫病诊断用pcr试剂盒可以包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的引物对。

发明效果

根据本发明的包括特定碱基序列的引物对对于多拷贝基因具有高特异性。

另外，根据本发明的诊断恙虫病的方法使用包括特定碱基序列的引物对通过pcr反应以高的灵敏度和特异性进行检测，因此可以以高的可靠性快速且容易地进行临床诊断。

附图说明

图1是使用间接免疫荧光抗体法的诊断方法的检测灵敏度图。

图2是示出使用根据本发明的pcr检测方法的恙虫病诊断方法的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明。

本发明的恙虫病诊断方法是使用能够扩增恙虫病东方体菌的多拷贝基因的碱基序列的引物对进行检测。

所述多拷贝基因(multicopygene)指的是在恙虫病东方体基因内的多个位置处重复存在的基因，优选地，可包括14种tra连锁(tra-linked)基因的碱基序列，更优选地，可包括trab、trae、trac以及tcha基因的碱基序列。

另外，所述多拷贝基因是pcr的靶基因(targetgene)。

在常规的诊断方法中使用的诸如47kda、56kda、groe1-stg的靶蛋白基因只存在于整个基因中的一个位置，然而，多拷贝基因重复存在于多个位置，从而使得在执行pcr扩增碱基序列时pcr效率提高，因此可以提高恙虫病诊断的准确度。

本发明的恙虫病诊断用引物包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的1种以上的碱基序列。

另外，本发明的恙虫病诊断用引物对包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的2种以上的碱基序列。

所述引物对可以包括序列号1和序列号2的碱基序列。

通常，所述引物对指的是不具有彼此互补的碱基序列的2个引物(primer)。

引物是与特定基因序列互补的短的单链基因序列(寡核苷酸(oligonucleotide))，是dna合成的起点，并用于pcr检测、dna序列测定(dnasequencing)等。此外，引物是pcr检测的最重要的要素，它决定准确度。所述引物是根据在被恙虫病东方体(orientiatsutsugamushi)保宁菌株感染的患者血液中扩增的保宁菌株的多拷贝基因的碱基序列设计的，具有与所述多拷贝基因互补的碱基序列。

另外，所述恙虫病的诊断方法可以包括以下步骤：(a)从样本分离dna的步骤；(b)以所述分离的dna为模板，使用序列号1至序列号36的引物对执行pcr的步骤；以及(c)分离所述pcr产物的步骤。

所述(a)步骤中的dna提取可以根据该行业通常使用的方法执行，可以使用商业性销售的dna提取试剂盒执行。

上述(b)步骤中pcr使用分离的dna为模板，本发明的引物对通过使用dna聚合酶合成互补dna链来执行pcr反应。

此外，基于(b)步骤中通过引物对扩增的产物中的碱基序列，其还包括探针(probe)并且可以执行实时定量荧光(realtime)pcr反应。

所述探针是指能够与碱基序列特异性结合的由几个至数百个碱基组成的碱基片段，其被标记以确认特定核酸的存在。优选地，探针在5′-端和3′-端分别被荧光物质标记。

另外，更优选地，在所述5′-端标记的荧光物质选自由6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，fam)、六氯-6-羧基荧光素(hexachloro-6-carboxyfluorescein，hex)、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)、花青-5(cy5)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲基荧光素(6-carboxy-4′，5′-dichloro-2′，7′-dimethoxyfluorescein，6-joe)、四氯荧光素(tetrachlorofluorescein，tet)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tertramethylrhodamineisothiacyanate，texasred)、5-羧基-x-罗丹明(5-carboxy-x-rhodamine，rox)、6-羧基四甲基-罗丹明(6-carboxytetramethyl-rhodamine，tamra)组成的组，并且所述3′-端标记的荧光物质可以是6-羧基四甲基-罗丹明(6-carboxytetramethyl-rhodamine，tamra)或者是黑洞淬灭剂-1，2，3(bhq-1，2，3)，但不限于此。

所述pcr是聚合酶链反应(polymerasechainreaction)的简称，是将dna或rna的特定区域在试管内大量扩增的技术，可以使用该行业公知的包括多个成分的pcr反应混合液执行。所述pcr反应混合液除了本发明提供的pcr引物对之外还可以包括适当量的dna聚合酶、dntp、pcr缓冲溶液和水(dh2o)。

另外，pcr缓冲溶液可以包括tris-hcl、mgcl2、kcl等。

pcr通常包括三个反应步骤。第一步是dna变性步骤，通过加热将两条dna链分离为一条dna链，第二步是引物的结合步骤，在dna变性为单链和引物共存且温度降低时，引物对分别与互补链的模板dna结合，第三步是延伸反应，其在四种底物(dntp)共存的状态下通过dna聚合酶的作用延伸引物。

所述pcr可以使用普通的pcr反应，优选地，最普通的常规(conventional)pcr、同时或连续执行两次以上pcr的双重(duplex)pcr和嵌套式(nested)pcr、以及可以实时确认结果的昂贵的实时定量荧光(realtime)pcr均可使用，最优选地，可以使用常规pcr或实时定量荧光pcr。

由于实时定量荧光(realtime)pcr可以通过实时监测来确认pcr扩增产物的增加，因此不需要使用额外的电泳分析方法，并且与在终点(endpoint)确认pcr扩增产物的常规pcr方法相比，可以快速简便地分析pcr，而且污染的风险小。

实时定量荧光pcr扩增产物的检测方法使用对靶序列(targetsequence)具有特异性并且结合有荧光染料(dye)的探针(probe)，由于检测的特异性高，因此甚至相似的序列也可以区别检出。

另外，所述(c)步骤中可以根据该行业中公知的方法分离pcr产物。优选地，通过琼脂糖凝胶(agarosegel)或聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)电泳或荧光分析装置(abiprism3100geneticanalyzer-elecropherogram)进行确认。电泳后可以通过溴化乙锭(ethidiumbromide)染色来分析电泳的结果。

本发明的恙虫病诊断用pcr试剂盒可以包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的引物对。

另外，所述检测用pcr试剂盒中除了能够扩增多拷贝基因的碱基序列的引物对之外，还可以包括参与聚合酶链式反应的酶、dntp和缓冲溶液，还可以包括诸如矿物油、标准标记物、染色剂诸如溴酚蓝或者二甲苯ff的pcr用材料，其是用于执行电泳以确认pcr产物的扩增所需的成分。

下面，通过菌的检测和诊断方法对本发明进行更详细的说明。

下面的实施例仅用于详细说明本发明，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，本发明的内容和范围不受这些实施例的限制。

<实施例>

1.引物制备

基于被在韩国常见的恙虫病保宁菌株感染的患者的血液中扩增的多拷贝基因(multicopygene)来设计引物。

更优选地，根据基因库收录号am494475.1：恙虫病保宁全基因组thca基因(genbankaccessionno.am494475.1：o.tsutsugamushiboryoungcompletegenomethcagene)(保守假想蛋白)，所制备的引物为正向引物(位置14-34)和反向引物(位置171-151)，分别标记为序列号1至序列号36。

另外，所制备的探针为taqman探针(位置58-78)，并标记为序列号37和序列号38。

根据本发明的实施例制备的引物和探针如下表1表示。

[表1]

所述引物可以具有与多拷贝基因tcha、trab、trae、trbc互补的碱基序列。

另外，将所述引物分别制备成序列长度为19nt至30nt，gc含量为20％至60％，tm值为50℃至70℃。

2.样本制备

采集患者的血液样本并对其提取基因用于检测，所述患者在2007年至2008年之间到朝鲜大学医院就医，并且在当时有焦痂或丘疹，且具有例如头痛、全身无力、肌肉痛、咳嗽、恶心、腹痛等的2种以上的临床症状。

在血液样本的间接免疫荧光法(ifa)中，当恙虫病东方体的igg抗体滴度上升4倍以上时可定义为确诊恙虫病，确诊为恙虫病的52名患者的血液作为阳性对照组，诊断为恙虫病以外的其他疾病的20名患者的血液作为阴性对照组。

3.恙虫病东方体的检测

为了确认制备的引物和诊断方法的有效性，在准备的阳性对照组和阴性对照组的样本中检测dna，并进行了如图2所示的pcr。

从患者采集全血，分离血沉棕黄层，使用qiaampdna迷你试剂盒(qiagen，germany)分离dna。分离方法根据试剂盒附带的手册(manual)进行，分离的dna用作用于检测恙虫病东方体菌的模板(template)。

使用提取的dna为模板进行了常规pcr、嵌套式pcr和实时定量荧光pcr。

在这种情况下，作为实验中使用的引物，使用了具有本发明的序列号1至序列号36的碱基序列的引物，以及具有本发明的序列号37和序列号38的碱基序列的探针。

对于常规pcr和嵌套式pcr，在accupowertmpcrpremix(1utoppolymerase，250μmdntp，10mmtris-hcl(ph9.0；bioneer)中添加2μl模板dna，各1μl的10pmole/μl正向引物和反向引物，16μl的无菌三蒸水，以制备总共20μl的反应溶液，将试管充分混合，然后置于biosystemsveriti^tm96-wellthermalcycle(appliedbiosystems)，并执行pcr。

另外，对于实时定量荧光pcr，以与上述相同的方式制备包括1μl的2pmole/μl探针的反应溶液，然后在试管中充分混合，并将试管置于bioneerexicycler^tm96real-timequantitativethermalblock(appliedbionner)，并执行pcr，使用在5′-端和3′-端标记有fam(6-羧基荧光素)和bhq-1(blackholequencher-1)的探针。

pcr执行条件如表2所示。

pcr结束后，将含有0.5ng/mletbr(溴化乙锭(ethidiumbromide)，bioneer)的1.5％琼脂糖凝胶(seakemleagarose，cambrexbioscience)装入bioneer电泳装置，并且在100v(1xtea，bioneer)的条件对pcr扩增产物进行40分钟的电泳，并观察结果。

pcr检测结果显示，阴性对照组的pcr扩增产物在电泳时，在任何位置都未观察到条带(band)。通过本发明的引物对的pcr扩增产物的大小如表3所示，通过确认相应大小的条带来确认是否检测到恙虫病东方体，并确认pcr扩增产物得到的结果与间接免疫荧光法一致。

[表2]

[表3]

<对比例>

1.通过常规方法检测恙虫病东方体

为了比较本发明的引物以及诊断方法的有效性，进行了如下的对比实验。

使用了与上述从血液样本中分离的同样的模板dna，每个实验对通常用于恙虫病菌检测的靶蛋白基因56kda、47kda进行了常规pcr和嵌套式pcr，其结果如表4所示。

每个pcr中使用的引物对是根据参考文献制备或者直接设计使用，以与实施例3同样的方式进行pcr。

扩增47kda基因用的引物对是参考参考文献(jiangj，chantc，temenakjj，daschga，chingwm，richardsal.developmentofaquantitativerealtimepolymerasechainreactionassayspecificfororientiatsutsugamushi.amjtropmedhyg.2004apr；70(4)：351-6.)制备的。

另外，扩增56kda基因的引物对是参考参考文献(kimdm，yunnr，yangty，leejh，yangjt，shimsk，etal.usefulnessofnestedpcrforthediagnosisofscrubtyphusinclinicalpractice：aprospectivestudy.amjtropmedhyg.2006sep；75(3)：542-5.)制备的。

[表4]

<结果>确认恙虫病诊断方法的有效性

在使用本发明的引物的实施例3和对比例的恙虫病东方体检测的方法中，测定恙虫病东方体的检测灵敏度(sensitivity)、特异性(specificity)以及检测时间的结果如表5所示。

从表5可以看出，当以实施例3的trab基因作为靶进行常规(c)-pcr时，与对比例1的56kda、47kda基因作为靶的嵌套式(n)-pcr相比所需的时间更少。

另外，当以实施例3的trab1、trab2基因作为靶进行常规(c)-pcr时，灵敏度分别显示为82.7％和88.5％。

特别是，当将tch基因作为靶使用时，进行常规pcr(c-pcr)时的灵敏度为90.4％，进行实时定量荧光pcr(q-pcr)时，虽然检测时间只有1-2小时也显示出98.1％的灵敏度。

因此，如下表5所示，本发明的引物对实现了本发明想要实现的目的和效果。

根据上述结果，可以确认使用根据本发明的引物对的pcr检测方法可以为确认恙虫病东方体的感染提供充分的灵敏度。

[表5]

上面已经详细描述了本发明的特定部分，并且对于本领域普通技术人员而言，这些详细描述仅是正确实施的说明，本发明的范围并不限于此，本发明的实质范围由所附的权利要求书所限定。

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