ROR2抑制剂及其在治疗和/或预防软骨缺失中的用途的制作方法

本发明涉及软骨缺失(cartilageloss)的治疗和/或预防，该软骨缺失例如在骨关节炎、软骨缺损(chondraldefect)、骨软骨缺损或创伤中发生的软骨缺失。因此，本发明涉及骨关节炎的治疗，并且涉及骨关节炎中的一种或多种症状的改善。本发明还涉及促进软骨修复，例如，通过促进新的软骨生长和软骨分化和/或通过减少或预防软骨降解。本发明指向ror2抑制剂的用途，且特别是抗ror2抗体或靶向ror2的sirna在这些病症的治疗中的用途。本发明还涉及ror2抑制剂在增强自体细胞制剂在体内产生软骨的能力的方法中的用途。本发明还涉及用于软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的诊断和预测方法，该方法涉及确定ror2的表达水平和/或活性。

背景技术：

骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种关节疾病，其特征是关节软骨破裂，关节软骨即这样的组织：覆盖长骨的末端从而允许无摩擦的关节运动和骨骼变化，包括使支撑软骨的骨骼增厚以及在关节边缘处的过度骨形成(骨赘)。oa影响多至1/3的45岁以上人群，是世界范围内慢性残疾的主要病因，并且耗费西方国家gdp的1％至2％。oa通常由病理性慢性机械损伤引起，病理性慢性机械损伤例如体重超重、关节错位、或关节不稳，例如韧带和半月板病变。炎症有时作为组织损伤的结果存在出现于在oa关节中但是并不驱使疾病发展，且事实上，缺少编码炎症细胞因子il-6和il-1或趋化因子受体cxcr2的基因的小鼠更容易患oa(clementsetal.,2003；hoogeetal.,2005；sherwoodetal.,2013)。

除了骨关节炎之外，软骨缺失也是炎性关节炎(例如类风湿性关节炎或银屑病关节炎)的失能结果。在这种情况下，即使我们采用当前的抗炎疗法来设法控制炎症，如果已经出现了软骨损伤，那么患者将仍会经历诸如关节痛和活动能力丧失的症状，并且，与炎症无关，由于最初的软骨缺失，在病理生物力学的驱使下，关节损伤将进一步发展。

在所有关节镜手术的60％中发现了软骨缺损，这可能会有慢性疼痛并可能导致骨关节炎。当前的治疗方法仅导致像在微骨折的情况下的仅仅暂时的改善，或者像自体软骨细胞移植的情况，细胞产物的自体性质阻碍了扩大规模，这意味着复杂的手术，并使生产成本不适合常规应用。

软骨再生治疗气管软化是可取的，其中，由于创伤或炎症，气管软骨塌陷从而阻碍了呼吸。在出现破坏耳朵或鼻子的创伤、烧伤或炎性状况后，软骨再生对重建该组织也可以是有用的。

关节软骨是由软骨细胞组成的无血管组织，软骨细胞分泌大量的富含糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)的胞外基质，该胞外基质主要由蛋白聚糖aggrecan和ii型胶原蛋白组成。在静息状态下，软骨具有极低的更替率。然而，在受伤后，内平衡机制被调动，包括上调软骨转录因子sox-9及其转录靶标col2a1和acan(其编码软骨胞外基质ii型胶原蛋白和aggrecan的主要成分)。在有利的条件下，这种响应恢复软骨完整性并抵消有害的刺激(buckwalteretal.,2004；sherwoodetal.,2014)。如果受伤过于严重且是持续的(肥胖、创伤、错位)，或者如果因为遗传因素或年龄，内平衡响应是有缺陷的，则软骨缺失占上风并发展。进一步的软骨缺失是由胞外基质降解酶(例如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，mmp)和聚蛋白多糖酶adamts-4和adamts-5)的活化介导的((nagaseandkashiwagi,2003；glassonetal.,2005；stantonetal.,2005)。

许多触发这种对受伤的内平衡响应的信号在胚胎骨骼发育中也起着重要作用((dell’accioetal.,2008a；sherwoodetal.,2014)。特别是wnt信号转导不仅对关节特化和发展必不可少(hartmannandtabin,2001；guoetal.,2004)，而且通过有助于成骨分化且阻断成软骨分化来控制骨骼祖细胞的分化和命运(hilletal.,2005)。wnt是一个具有19种多效性形态发生素的家族，在与其称为卷曲蛋白(frizzled，fzd)的受体结合后，wnt通过以下多种通路发出信号：“经典”β连环蛋白依赖性通路(βcatenin-dependentpathway)，以及一些鲜为人知的“非经典”通路，“非经典”通路之一是涉及共受体ror2的平面细胞极性(planarcellpolarity，pcp)通路(yamamotoetal.,2008；gaoetal.,2011)。在经典通路中，“经典”wnt(例如wnt1)与fzd受体的接合导致fzd及其共受体lrp-5或lrp-6的二聚化、胞质β-连环蛋白的累积，然后胞质β-连环蛋白转移至细胞核，与tcf/lef1转录因子结合，并激活靶标基因的转录。在wntpcp通路中，通过“非经典”wnt(例如wnt-5a)的fzd接合导致与共受体ror2(酪氨酸激酶受体)的异源二聚化、细胞内的分子vangl2的磷酸化以及与由经典wnt信号转导驱动的那些事件不同的下游事件(gaoetal.,2011)。

wnt信号转导在软骨中起着双重作用。在成人软骨中，最表层的细胞层由祖细胞组成，该祖细胞在整个生命中都提供软骨细胞(kozhemyakinaetal.,2015)。经典wnt信号转导通过预防其早熟的软骨细胞的分化来维持该祖细胞群((deckeretal.,2014)。然而，在成熟的软骨细胞中，典型wnt信号转导促进了一种称为软骨细胞肥大(chondrocytehypertrophy)的终末分化的形式(enomoto-iwamotoetal.,2002)。在骨骼发育过程中，软骨细胞肥大先于软骨钙化且最后被骨骼取代。在生理条件下，关节软骨细胞对肥大具有抵抗力。在oa期间，机械损伤触发了异位软骨细胞肥大，进而驱使软骨破裂和oa发展((saitoetal.,2010；yangetal.,2010)。依此进行，与经典wnt激活增加相关的等位基因变体与发展oa的风险较高相关(loughlinetal.,2004；loriesetal.,2006；kerkhofetal.,2008；luytenetal.,2009；betancourtetal.,2012)。由于wnt信号转导的这种双重作用(一个好处：维持必要的祖细胞群和一种病理)，迄今为止，靶向oa中的经典wnt信号转导一直令人失望。

对由ror2介导的wntpcp通路在骨骼生物学中的作用研究较少。在胚胎发育过程中，ror2主要在包括肋骨前部和预期关节软骨的永久性软骨中表达，但也在生长板和其他器官(例如真皮和胚胎端脑)中表达(dechiaraetal.,2000；al-shawietal.,2001)。发育过程中ror2的缺失导致长骨较短以及软骨钙化、软骨肥大和软骨内骨形成的延迟(dechiaraetal.,2000)。在人类中，ror2的缺失导致robinow综合征(robinowsyndrome)，这是一种侏儒症，并且近似地对小鼠中的ror2缺失的表型进行了表型模拟(afzaletal.,2000；schwabeetal.,2004)。

还已经观察到，从oa对象中分离出的培养的间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)比从健康对照个体中分离出的msc表达的ror2的水平更高(dickinsonetal.2017)。在同一研究中，发现与非oa细胞相比，来自oa对象的msc产生的软骨具有更高水平的ii型胶原蛋白。

因此，ror2在成人软骨中特别是在oa背景下的作用尚不清楚。

在临床中，oa通常通过管理与oa相关的疼痛和炎症来治疗。例如，可以给患有oa的对象开出非阿片类镇痛药，例如扑热息痛(paracetamol)、或非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatorydrug，nsaid)。然而，许多oa对象患有严重的疼痛和炎症，并且需要用甾体(steroid)和/或阿片类镇痛药(例如可待因(codeine)或曲马多(tramadol))来进行治疗，这些药与许多不良反应有关，包括头痛、头晕、困倦、疲倦感、便秘、腹泻、恶心、呕吐和胃痛等。在一些情况下，对象可能变得依赖阿片类镇痛药而具有有害后果。消除疼痛并不能恢复关节完整性：实际上，疼痛的功能是预防过度使用已经受损的关节。因此，在临床试验中，测试强效止痛药(例如阻断ngf/trka信号转导)的功效对部分患者导致加速的非常严重的关节破坏。因此，对于患有软骨缺失的患者，只进行疼痛控制并非是合适的选择。此外，缓解疼痛并不能改善骨关节炎的其他失能症状，例如关节活动性降低和肌无力。

用于治疗oa的较不常见的方法包括向受影响的关节注射透明质酸(据信可改善关节润滑作用)或富血小板血浆(plateletrichplasma，prp)，该富血小板血浆具有一定浓度的生长因子和细胞因子并被提出会刺激局部愈合)。然而，这些治疗方法中的任一种的临床证据都很薄弱，且疗效迄今为止尚未得到令人信服的证明。

因此，仍然需要改进的oa新疗法，特别是能够促进软骨修复和/或减轻与oa相关的疼痛的疗法。

技术实现要素：

本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：(i)损伤后软骨中的ror2上调；(ii)ror2活性驱使软骨破裂；(iii)ror2阻断改善小鼠oa的症状和结构结果，包括oa相关的疼痛的持续缓解和(iv)人软骨细胞中的ror2阻断促进人软骨的体内形成。

就这一点而言，本发明人已经证明，来自关节表面的ror2表达在出生后缺失且在成年期由于损伤而被重新激活。此外，在oa中，发现由于局部发炎和机械应激，ror2在软骨中上调。ror2激活导致软骨胞外基质的缺失和软骨细胞分化。ror2阻断足以使mc3h10t1/2间充质干细胞系进行成软骨分化，支持软骨胞外基质产生并抑制软骨降解酶adamts-4和adamts-5的表达。

重要的是，治疗方案中的ror2沉默保护了小鼠免受不稳定诱导的oa之害，改善了结构结果并持续缓解了疼痛。最后，ror2阻断改善了人软骨类器官植入裸鼠后的体内分化和胞外基质产生。

因此，一方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的ror2抑制剂，其中该ror2抑制剂选自由针对ror2的寡核苷酸、抗ror2抗体或其片段、ror2蛋白的可溶性片段组成的组。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是单链的或双链的。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包括dna或rna。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是短干扰rna(shortinterferingrna，sirna)。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是双链rna(doublestrandedrna，dsrna)。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)。

在一个实施方式中，本发明的shrna包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：

(i)5'gguucacgacugcgaauccaggaccugga3’(seqidno:15)，包含seqidno:15的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(ii)5'aagaccauuaccgccacuggcguccuguu3’(seqidno:16)，包含seqidno:16的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'auggauuacagaggaacggcaagcaccac3’(seqidno:17)，包含seqidno:17的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iv)5'aagcagaaggcaucugcguccacaccgca3’(seqidno:18)，包含seqidno:18的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(v)5'ccuugagcaugaucuucagcuacuguucc3’(seqidno:19)，包含seqidno:19的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及

(vi)与seqidno:15-19中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含seqidno:15-19的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是微rna(microrna，mirna)。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是包含向导序列的向导rna，该向导序列与内源性ror2基因内的位点杂交并使crispr-cas酶靶标向于所述位点。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸的长度为10-35个核苷酸。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸是反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,aon)。

在一个实施方式中，本发明的sirna包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

(i)5'aagucuacaaaggucaccugu3’(seqidno:1)，包含seqidno:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'aagucuacaaaggucaccuguccugucuc3’(seqidno:2)，包含seqidno:2的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'aaacaggugaccuuuguagac3’(seqidno:3)，包含seqidno:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iv)5'aaacaggugaccuguagacccugucuc3’(seqidno:4)，包含seqidno:4的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及

(v)与seqidno:1-4中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含seqidno:1-4中的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在一个实施方式中，本发明的sirna包括序列：

(i)5'aagucuacaaaggucaccugu3’(seqidno:1)，包含seqidno:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；和/或

(ii)5'aaacaggugaccuuuguagac3’(seqidno:3)，包含seqidno:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在一个实施方式中，sirna与运载体缀合或被封装在胞外囊泡、脂质体或树状聚合物内。该运载体可以选自由去端肽胶原(atelocollagen)、诸如胆固醇的脂质、生物聚合物、以及诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒组成的组。

在一个实施方式中，抗ror2抗体是阻断抗体。

在一个实施方式中，抗ror2抗体是:(a)完整的抗ror2抗体；或(b)选自由以下组成的组的抗ror2抗体的片段：

(i)fv片段，可选地其中fv片段是单链fv片段或二硫键键合的fv片段；和

(ii)fab片段；可选地其中fab样片段是fab′片段或f(ab′)2片段。

在一个实施方式中，抗ror2抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

在一个实施方式中，抗ror2抗体是单克隆抗体。

在一个实施方式中，用于治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的用途的ror2抑制剂是包括ror2蛋白的胞外结构域的全部或一部分的ror2蛋白的可溶性片段。

本发明还提供一种ror2抑制剂，该ror2抑制剂是包括ror2蛋白的胞外结构域的全部或一部分的ror2蛋白的可溶性片段。

胞外结构域可以包含与seqidno:10具有至少50％同一性的多肽。ror2蛋白的可溶性片段还可以包括膜锚(membraneanchor)。膜锚可以连接至胞外结构域的c端。膜锚可以通过接头(linker)连接至ror2蛋白的胞外结构域。膜锚可以是糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，gpi)锚。

ror2蛋白的可溶性片段还包括亲和标签(affinitytag)。亲和标签可以在胞外结构域或膜锚的c端。亲和标签可以选自由以下组成的组：myc/his标签、myc标签、his标签、谷胱甘肽s-转移酶(glutathiones-transferase，gst)标签、麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein，mbp)标签、strepii标签、flag标签、碱性磷酸酶标签、噬菌体t7表位标签(t7标签)、钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide，cbp)标签、半乳糖结合蛋白(galactosebindingprotein,gbp)标签、人流感血凝素(humaninfluenzahemagglutinin，ha)标签及其组合。

ror2蛋白的可溶性片段还包括切割标签(cleavagetag)，该切割标签布置为允许从ror2蛋白的可溶性片段中切割亲和标签。切割标签可以在胞外结构域或膜锚的c端并且在亲和标签的n端。切割标签可以选自由以下组成的组：肠激酶切割标签、烟草蚀刻病毒蛋白酶切割位点、凝血酶切割标签、xa因子(factorxa，fxa)切割标签、人鼻病毒(humanrhinovirus，hrv)3c蛋白酶(“prescission”)切割标签及其组合。

在另一方面,本发明提供针对ror2的短干扰rna(sirna)，其中sirna包含选自由以下组成的组的序列：

(i)5'aagucuacaaaggucaccugu3’(seqidno:1)，包含seqidno:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'aagucuacaaaggucaccuguccugucuc3’(seqidno:2)，包含seqidno:2的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'aaacaggugaccuuuguagac3’(seqidno:3)，包含seqidno:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iv)5'aaacaggugaccuguagacccugucuc3’(seqidno:4)，包含seqidno:4的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及

(v)与seqidno:1-4中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含seqidno:1-4中的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在一个实施方式中，本发明的sirna包括序列:

(i)5'aagucuacaaaggucaccugu3’(seqidno:1)，包含seqidno:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；和/或

(ii)5'aaacaggugaccuuuguagac3’(seqidno:3)，包含seqidno:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在一个实施方式中，本发明的sirna的长度为10-35个核苷酸。

在另一方面，本发明提供了本发明的sirna作为药物的用途。

在另一方面,本发明提供包含本发明的ror2蛋白的胞外结构域的可溶性ror2蛋白作为药物的用途。

在另一方面,本发明提供了本发明的sirna用于治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的用途。

本发明的sirna可以与运载体缀合或被封装在脂质体内。该运载体可以选自由去端肽胶原、诸如胆固醇的脂质、生物聚合物、以及诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒组成的组。

在另一方面,本发明提供了一种载体，该载体包含编码如本文所定义的ror2抑制剂的核苷酸序列或本发明的sirna。载体可以选自由慢病毒载体、逆转录病毒载体、和腺相关病毒(adeno-associatedviral，aav)载体组成的组。

在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的载体的分离的细胞。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所定义的ror2抑制剂、本发明的sirna、本发明的载体、或本发明的分离的细胞、以及药学上可接受的运载体或赋形剂。

在另一方面，本发明提供了本发明的分离的细胞或本发明的药物组合物作为药物的用途。

在另一方面,本发明提供了本发明的分离的细胞或本发明的药物组合物用于治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解中的用途。

在另一方面,本发明提供了一种治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的方法，该方法包括向有此需要的个体施用如本文所定义的ror2抑制剂、本发明的sirna、本发明的载体、本发明的分离的细胞或本发明的药物组合物。

在本发明的方法的一个实施方式中，ror2抑制剂、sirna、载体、分离的细胞或药物组合物的施用促进软骨修复。

在一个实施方式中，本发明的方法改善骨关节炎的一种或多种症状。

在本发明的方法的一个实施方式中，ror2抑制剂、sirna、载体、分离的细胞或药物组合物抑制剂减轻与骨关节炎相关的疼痛。

在另一方面,本发明提供了如本文所定义的ror2抑制剂、本发明的sirna、根据本发明的载体、本发明的分离的细胞或本发明的药物组合物在制备用于治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的药物中的用途。

在另一方面,本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的sirna以及一种或多种运载体、以及可选地用于使sirna缀合至运载体的说明书，可选地其中该运载体选自由去端肽胶原、诸如胆固醇的脂质、生物聚合物、以及诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒组成的组。

在另一方面,本发明提供一种诊断患有软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的对象的方法或用于预测对象对软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨的易感性增加的方法，该方法包括步骤：

(i)确定先前从对象获得的样品中的ror2的表达水平和/或活性。

在一个实施方式中，本发明的诊断方法或预测方法还包括步骤：

(ii)将步骤(i)中确定的ror2的表达水平和/或活性与一个或多个参考值进行比较。

在一个实施方式中，一个或多个参考值是选自从健康对照对象获得的样品中的ror2的表达水平和/或活性。先前已经可以确定健康对照对象没有显示出软骨损缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解。在一个实施方式中，该一个或多个参考值可能已在先前确定。在一个实施方式中，该一个或多个参考值被存储在计算机可读介质上。

在一个实施方式中，本发明的诊断方法或预测方法还包括向对象施用ror2抑制剂的步骤。ror2抑制剂可以选自由针对ror2的寡核苷酸、抗ror2抗体或其片段、ror2蛋白的可溶性片段组成的组。

在一个实施方式中，本发明的诊断方法或预测方法还包括向对象施用本发明的ror2抑制剂、本发明的针对ror2的sirna、本发明的载体、本发明的分离的细胞和/或本发明的药物组合物的步骤。

在本发明的诊断方法或预测方法中，如果ror2的表达水平和/或活性水平比该一个或多个参考值高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，则对象可以被诊断为患有软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解，或对象被预测为对软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的易感性增加；或如果ror2的表达水平和/或活性水平是该一个或多个参考值的至少1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、5.0倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍，则该对象可以被诊断为患有软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解，或该对象被预测为对软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的易感性增加。

在本发明的诊断方法或预测方法中，步骤(i)中确定的ror2活性可以选自：

(a)ror2诱导的wnt-β-连环蛋白信号转导的抑制；

(b)ror2酪氨酸磷酸化；

(c)一个或多个ror2下游靶标的磷酸化，可选地其中ror2下游靶标是14-3-3β支架蛋白；

(d)一个或多个ror2靶标基因的表达，可选地其中ror2靶标基因选自由ctgf、yap、taz和wnt5a组成的组；

(e)ror2形成受体复合物的能力；以及

(f)(a)至(e)的任意组合。

在一个实施方式中，本发明的诊断方法或预测方法还包括确定一种或多种ror2靶标基因的表达水平。ror2靶标基因可以选自由ctgf、yap、taz和wnt5a组成的组。

在本发明的诊断方法或预测方法中，样品可以是外周血样品、软骨组织样品、滑液样品或关节内样品。

本发明的诊断方法或预测方法中的任何方法可以在离体或体外对先前从对象获得的样品进行。因此，在一个实施方式中，本发明的诊断方法或预测方法是一种离体方法或体外方法。

附图说明

图1.ror2在正常软骨中是不可检测到的，在骨关节炎中上调。(a)在交配后(dayspostcoitum，dpc)18.5天的阶段，小鼠胚胎的关节软骨的最表层软骨中的ror2的检测；(b)在通过内侧半月板失稳术(dmm)诱导骨关节炎后一周，出生后的小鼠中的ror2的检测；(c)人关节软骨中ror2表达的检测；(d)证实ror2在人软骨和滑膜中表达的蛋白质印迹(westernblot)。

图2.ror2过表达抑制软骨细胞分化。(a)在hek293细胞中进行的萤光素酶测定的结果，该结果示出了与wnt-5a共同刺激增强了ror2抑制wnt-3a诱导的wnt信号转导的激活的能力；(b)在mc3h10t1/2细胞中进行的萤光素酶测定的结果，该结果示出了ror2过表达抑制wnt信号转导；(c)荧光素酶测定的结果，该结果示出了ror2过表达没有抑制gsk3β抑制剂bio激活wnt信号转导的能力；(d)在存在和不存在ror2的情况下bmp-2诱导的mc3h10t1/2细胞进行的软骨细胞分化的比较(如通过糖胺聚糖的阿尔辛蓝染色测量的)；(e)软骨细胞分化标志物col2a1和acan的表达水平的比较。

图3.ror2功能缺失支持软骨细胞分化。

(a)响应于sirna诱导的ror2沉默的体外ror2表达水平；(b)响应于针对ror2mrna的shrna-慢病毒的ror2mrna表达水平；(c)响应于针对ror2mrna的shrna-慢病毒的ror2蛋白表达水平；(d)如通过阿尔辛蓝染色所评估的，ror2的sirna沉默足以驱使mc3h10t1/2细胞进行软骨细胞分化(在没有bmp-2的情况下)；(e)如通过阿尔辛蓝染色所评估的，ror2的shrna-慢病毒沉默足以驱使mc3h10t1/2细胞进行软骨细胞分化(在没有bmp-2的情况下)；(f)ror2的sirna沉默导致acan(聚蛋白多糖)mrna表达的诱导；(g)ror2的shrna-慢病毒沉默强烈抑制了关键软骨降解酶adamts-4和adamts-5的表达；(h)萤光素酶测定，该测定示出了ror2沉默没有导致萤光素酶测定报告基因的活化通过wnt-3a增加。

图4.ror2体内沉默导致了骨关节炎的症状和结构特征的改善。(a)蛋白质印迹，该蛋白质印迹示出了去端肽胶原-ror2-sirna抑制ror2蛋白表达；(b)免疫荧光染色，该免疫荧光染色示出了去端肽胶原-ror2-sirna沉默诱导了ror2靶标蛋白ctgf的下调；(c)与施用了去端肽胶原-乱序(scrambled)-sirna的对照小鼠相比，对患有外科手术诱导的半月板韧带损伤(menisco-ligamentinjury，mli)的骨骼成熟小鼠(骨关节炎模型)的一个后肢进行去端肽胶原-ror2-sirna治疗导致了显著降低的负重疼痛。手术后6周，即在施用去端肽胶原-ror2-sirna13天后，治疗组每个后肢的负重恢复到50％，表明负重时无疼痛；(d)如通过骨体积/组织体积比(bv/tv)测量的，ror2的sirna沉默显著降低了软骨下骨硬化；(e)番红o染色强度的组织形态计量学分析示出了治疗组中糖胺聚糖(gag)的保留显著增加/降解显著减少；(f)番红o染色(即gag存在)与骨关节炎肢体承受的体重百分比之间的相关性。

图5.ror2沉默支持人软骨类器官的体内形成。ror2的shrna-慢病毒沉默导致了人软骨类器官(通过在裸鼠中异位植入人关节软骨细胞而产生)中的gag含量显著增加。

具体实施方式

术语“包括”(含有、包含)应被理解为具有其在本领域的正常含义，即包括所陈述的特征或一组特征，但该术语不排除也存在所陈述的任何其他特征或一组特征。术语“由...组成”也应被理解为具有其在本领域中的正常含义，即，包括所陈述的特征或一组特征，而排除了其他特征。在使用“包括”或“包含”的每一个实施方式中，本发明提供了进一步的实施方式，其中使用了“由...组成”或“由...构成”。因此，对“包括”的每一个公开都应被视为对“由...组成”的公开。

ror2

ror家族受体酪氨酸激酶形成受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，rtk)的小的子亚家族，其特征是保守的、独特的结构域架构。在整个动物界，rorrtk在进化上都是保守的，并充当wnt配体的替代受体和共受体。

ror2基因编码受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ror2)、酪氨酸激酶和i型跨膜蛋白(也称为酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ror2、神经营养性酪氨酸激酶相关2型受体(neurotrophictyrosinekinasereceptor-related2，ntrkr2))。

在人类中，ror2基因的突变引起两种不同的发育综合征：隐性robinow综合症(robinowsyndrome，rrs；mim268310)和显性b1型短指症(brachydactylytypeb1，bdb1；mim113000)。

ror2蛋白是完整的膜蛋白，包括胞外部分、跨膜结构域和细胞内部分。术语“ror2蛋白的胞外部分”和“ror2蛋白的胞外结构域”在本文中可以互换使用。ror2蛋白的胞外部分/结构域也可以称为ror2蛋白的“ecd”。通常，ror2的胞外部分包括(从n端起)：信号肽、免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)结构域、富含半胱氨酸结构域(cysteinerichdomain，crd)和kringle结构域。kringle结构域的c端是跨膜结构域，其后是细胞内部分。ror2的细胞内部分通常包括(从n端起)：酪氨酸激酶结构域、富含第一丝氨酸/苏氨酸(ser/thr)结构域、富含脯氨酸的结构域和第二富含ser/thr结构域。胞外部分的ig结构域、crd和kringle结构域中的每个结构域均可能介导蛋白质-蛋白质相互作用，例如与ror2的活化配体诸如wnt家族成员的相互作用。特别地，已知crd结合wnt家族的活化配体。

人ror2蛋白的一个示例具有以下氨基酸序列：

margsalprrpllcipavwaaaalllsvsrtsgevevldpndplgpldgqdgpiptlkgyflnflepvnnitivqgqtailhckvagnpppnvrwlkndapvvqeprriiirkteygsrlriqdldttdtgyyqcvatngmktitatgvlfvrlgpthspnhnfqddyhedgfcqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtsthlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlesdlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaancmrigipaerlgryhqcyngsgmdyrgtasttksghqcqpwalqhphshhlsstdfpelggghaycrnpggqmegpwcftqnknvrmelcdvpscsprdsskmgilyilvpsiaiplviaclfflvcmcrnkqkasastpqrrqlmaspsqdmemplinqhkqaklkeislsavrfmeelgedrfgkvykghlfgpapgeqtqavaiktlkdkaegplreefrheamlrarlqhpnvvcllgvvtkdqplsmifsycshgdlheflvmrsphsdvgstdddrtvksaleppdfvhlvaqiaagmeylsshhvvhkdlatrnvlvydklnvkisdlglfrevyaadyykllgnsllpirwmapeaimygkfsidsdiwsygvvlwevfsyglqpycgysnqdvvemirnrqvlpcpddcpawvyalmiecwnefpsrrprfkdihsrlrawgnlsnynssaqtsgasnttqtsslstspvsnvsnaryvgpkqkappfpqpqfipmkgqirpmvpppqlyipvngyqpvpaygaylpnfypvqipmqmapqqvppqmvpkpsshhsgsgststgyvttapsntsmadraallsegaddtqnapedgaqstvqeaeeeeegsvpetellgdcdtlqvdeaqvqlea

(seqidno:5)

在seqidno:5的氨基酸序列内，以下氨基酸残基对应于ror2的结构域，如下表1所示。

编码ror2的人cdna的一个示例具有以下核苷酸序列：

ggacgcatcgtagaaaggggtggtggcgcccgaccccgcgccccggcccgaagctctgagggcttcccggcccccactgcctgcggcatggcccggggctcggcgctcccgcggcggccgctgctgtgcatcccggccgtctgggcggccgccgcgcttctgctctcagtgtcccggacttcaggtgaagtggaggttctggatccgaacgaccctttaggaccccttgatgggcaggacggcccgattccaactctgaaaggttactttctgaattttctggagccagtaaacaatatcaccattgtccaaggccagacggcaattctgcactgcaaggtggcaggaaacccaccccctaacgtgcggtggctaaagaatgatgccccggtggtgcaggagccgcggcggatcatcatccggaagacagaatatggttcacgactgcgaatccaggacctggacacgacagacactggctactaccagtgcgtggccaccaacgggatgaagaccattaccgccactggcgtcctgtttgtgcggctgggtccaacgcacagcccaaatcataactttcaggatgattaccacgaggatgggttctgccagccttaccggggaattgcctgtgcacgcttcattggcaaccggaccatttatgtggactcgcttcagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagcggccttcaccatgatcggcacgtctacgcacctgtcggaccagtgctcacagttcgccatcccatccttctgccacttcgtgtttcctctgtgcgacgcgcgctcccgggcacccaagccgcgtgagctgtgccgcgacgagtgcgaggtgctggagagcgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggcttcagctgcccaagtgtgaggcgctgcccatgcctgagagccccgacgctgccaactgcatgcgcattggcatcccagccgagaggctgggccgctaccatcagtgctataacggctcaggcatggattacagaggaacggcaagcaccaccaagtcaggccaccagtgccagccgtgggccctgcagcacccccacagccaccacctgtccagcacagacttccctgagcttggaggggggcacgcctactgccggaaccccggaggccagatggagggcccctggtgctttacgcagaataaaaacgtacgcatggaactgtgtgacgtaccctcgtgtagtccccgagacagcagcaagatggggattctgtacatcttggtccccagcatcgcaattccactggtcatcgcttgccttttcttcttggtttgcatgtgccggaataagcagaaggcatctgcgtccacaccgcagcggcgacagctgatggcctcgcccagccaagacatggaaatgcccctcattaaccagcacaaacaggccaaactcaaagagatcagcctgtctgcggtgaggttcatggaggagctgggagaggaccggtttgggaaagtctacaaaggtcacctgttcggccctgccccgggggagcagacccaggctgtggccatcaaaacgctgaaggacaaagcggaggggcccctgcgggaggagttccggcatgaggctatgctgcgagcacggctgcaacaccccaacgtcgtctgcctgctgggcgtggtgaccaaggaccagcccctgagcatgatcttcagctactgttcgcacggcgacctccacgaattcctggtcatgcgctcgccgcactcggacgtgggcagcaccgatgatgaccgcacggtgaagtccgccctggagccccccgacttcgtgcaccttgtggcacagatcgcggcggggatggagtacctatccagccaccacgtggttcacaaggacctggccacccgcaatgtgctagtgtacgacaagctgaacgtgaagatctcagacttgggcctcttccgagaggtgtatgccgccgattactacaagctgctggggaactcgctgctgcctatccgctggatggccccagaggccatcatgtacggcaagttctccatcgactcagacatctggtcctacggtgtggtcctgtgggaggtcttcagctacggcctgcagccctactgcgggtattccaaccaggatgtggtggagatgatccggaaccggcaggtgctgccttgccccgatgactgtcccgcctgggtgtatgccctcatgatcgagtgctggaacgagttccccagccggcggccccgcttcaaggacatccacagccggctccgagcctggggcaacctttccaactacaacagctcggcgcagacctcgggggccagcaacaccacgcagaccagctccctgagcaccagcccagtgagcaatgtgagcaacgcccgctacgtggggcccaagcagaaggccccgcccttcccacagccccagttcatccccatgaagggccagatcagacccatggtgcccccgccgcagctctacatccccgtcaacggctaccagccggtgccggcctatggggcctacctgcccaacttctacccggtgcagatcccaatgcagatggccccgcagcaggtgcctcctcagatggtccccaagcccagctcacaccacagtggcagtggctccaccagcacaggctacgtcaccacggccccctccaacacatccatggcagacagggcagccctgctctcagagggcgctgatgacacacagaacgccccagaagatggggcccagagcaccgtgcaggaagcagaggaggaggaggaaggctctgtcccagagactgagctgctgggggactgtgacactctgcaggtggacgaggcccaagtccagctggaagcttgagtggcaccagggcccagggttcggggatagaagccccgccgagaccccacagggacctcagtcacctttgagaagacaccatactcagcaatcacaagagcccgccggccagtgggcttgtttgcagactgggtgaggtggagccctgctcctctctgtcctctgacacagctgccctgcctaggagcacccaagccaggcagggggtctggcagcacggcgtcctggggagcaggacacatggtcatccccagggctgtatacattgattctggtggtagactggtagtgagcagcaaatgcctttcaagaaaataggtggcagcttcactccatgtcatatatggagtgaatatttcaaaacgttgggaataagggcctgcaaaaggca

(seqidno:6)

示例人ror2蛋白的胞外部分具有以下氨基酸序列：

margsalprrpllcipavwaaaalllsvsrtsgevevldpndplgpldgqdgpiptlkgyflnflepvnnitivqgqtailhckvagnpppnvrwlkndapvvqeprriiirkteygsrlriqdldttdtgyyqcvatngmktitatgvlfvrlgpthspnhnfqddyhedgfcqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtsthlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlesdlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaancmrigipaerlgryhqcyngsgmdyrgtasttksghqcqpwalqhphshhlsstdfpelggghaycrnpggqmegpwcftqnknvrmelcdvpscsprdsskmgily

(seqidno:10)

seqidno:10的ror2胞外部分可以由以下核苷酸序列编码：

atggcccggggctcggcgctcccgcggcggccgctgctgtgcatcccggccgtctgggcggccgccgcgcttctgctctcagtgtcccggacttcaggtgaagtggaggttctggatccgaacgaccctttaggaccccttgatgggcaggacggcccgattccaactctgaaaggttactttctgaattttctggagccagtaaacaatatcaccattgtccaaggccagacggcaattctgcactgcaaggtggcaggaaacccaccccctaacgtgcggtggctaaagaatgatgccccggtggtgcaggagccgcggcggatcatcatccggaagacagaatatggttcacgactgcgaatccaggacctggacacgacagacactggctactaccagtgcgtggccaccaacgggatgaagaccattaccgccactggcgtcctgtttgtgcggctgggtccaacgcacagcccaaatcataactttcaggatgattaccacgaggatgggttctgccagccttaccggggaattgcctgtgcacgcttcattggcaaccggaccatttatgtggactcgcttcagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagcggccttcaccatgatcggcacgtctacgcacctgtcggaccagtgctcacagttcgccatcccatccttctgccacttcgtgtttcctctgtgcgacgcgcgctcccgggcacccaagccgcgtgagctgtgccgcgacgagtgcgaggtgctggagagcgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggcttcagctgcccaagtgtgaggcgctgcccatgcctgagagccccgacgctgccaactgcatgcgcattggcatcccagccgagaggctgggccgctaccatcagtgctataacggctcaggcatggattacagaggaacggcaagcaccaccaagtcaggccaccagtgccagccgtgggccctgcagcacccccacagccaccacctgtccagcacagacttccctgagcttggaggggggcacgcctactgccggaaccccggaggccagatggagggcccctggtgctttacgcagaataaaaacgtacgcatggaactgtgtgacgtaccctcgtgtagtccccgagacagcagcaagatggggattctgtac

(seqidno:11)

示例人ror2蛋白的crd具有以下氨基酸序列：

cqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtsthlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlesdlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaan

(seqidno:12)

seqidno:12的crd结构域可以由以下核苷酸序列编码：

ctgccagccttaccggggaattgcctgtgcacgcttcattggcaaccggaccatttatgtggactcgcttcagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagcggccttcaccatgatcggcacgtctacgcacctgtcggaccagtgctcacagttcgccatcccatccttctgccacttcgtgtttcctctgtgcgacgcgcgctcccgggcacccaagccgcgtgagctgtgccgcgacgagtgcgaggtgctggagagcgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggcttcagctgcccaagtgtgaggcgctgcccatgcctgagagccccgacgctgccaac

(seqidno:13)

小鼠ror2蛋白的一个示例具有以下氨基酸序列：

margwvrpsrvplcaravwtaaalllwtpwtagevedseaidtlgqpdgpdsplptlkgyflnflepvnnitivqgqtailhckvagnpppnvrwlkndapvvqeprrviirkteygsrlriqdldttdtgyyqcvatnglktitatgvlyvrlgpthspnhnfqdddqedgfcqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtstqlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlendlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaancmrigipaerlgryhqcyngsgadyrgmasttksghqcqpwalqhphshrlsstefpelggghaycrnpggqvegpwcftqnknvrvelcdvppcsprdgskmgilyilvpsiaiplviaclfflvcmcrnkqkasastpqrrqlmaspsqdmemplisqhkqaklkeislstvrfmeelgedrfgkvykghlfgpapgeptqavaiktlkdkaegplreefrqeamlrarlqhpnivcllgvvtkdqplsmifsycshgdlheflvmrsphsdvgstdddrtvksaleppdfvhvvaqiaagmeflsshhvvhkdlatrnvlvydklnvrisdlglfrevysadyyklmgnsllpirwmspeavmygkfsidsdiwsygvvlwevfsyglqpycgysnqdvvemirsrqvlpcpddcpawvyalmiecwnefpsrrprfkdihsrlrswgnlsnynssaqtsgasnttqtsslstspvsnvsnarymapkqkaqpfpqpqfipmkgqirplvppaqlyipvngyqpvpaygaylpnfypvqipmqmapqqvppqmvpkpsshhsgsgststgyvttapsntsvadraallsegtedaqniaedvaqspvqeaeeeeegsvpetellgdndtlqvteaahvqlea

(seqidno:7)

编码ror2的小鼠cdna的一个示例具有以下核苷酸序列：

atggctcggggctgggtgcggccgagccgtgtgcctctgtgcgcccgggccgtctggacggctgcggcgctcctgctctggacaccctggacggcaggtgaagtggaagattcggaggcaatcgacaccttgggacaacctgatggaccggacagcccacttcccactctgaaaggctactttctgaattttctggagccagtcaacaatatcaccattgttcagggccagacggcaatcctgcactgcaaggtggcgggaaacccacctcccaatgtgcggtggctgaagaatgatgccccggttgtgcaagagccacgaagggtcgtcatccggaagacagaatacggctcccggctgcggatccaagacctggacacaacagacacaggctactaccagtgtgtggctaccaacgggctgaagaccatcactgccactggggttctatatgtgcggctcggtccgacgcacagcccgaaccacaattttcaggatgacgatcaggaagatggcttctgccagccgtaccgagggatcgcttgtgcgcgcttcattgggaaccggactatttatgtggactccctccagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagctgccttcaccatgatcggcacctccacgcaactgtcagaccagtgttcacagtttgccatcccatccttctgccacttcgtcttccctctgtgcgacgcatgctcccgggcgcccaagcctcgcgaactgtgccgggatgaatgtgaggtgctggagaacgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggctccagctgcccaagtgcgaagcgctgcccatgcccgagagcccggatgctgcgaactgcatgcgcatcgggatccccgcggagaggctgggtcgctaccaccagtgctacaacggctccggcgccgattacagggggatggccagtaccaccaagtcaggccaccagtgtcagccttgggctctgcagcacccccacagccatcgcctatccagcacggaattccctgagctgggaggaggccatgcctactgccggaaccccgggggccagatggaaggcccgtggtgctttacgcagaataaaaacgtacgcgtggaactgtgtgacgtacccccgtgtagtccccgatatggcagcaagatggggattctgtacatcctggtccccagcattgctatccccctggtcatcgcttgcctgttcttcctcgtctgcatgtgccgcaacaaacagaaggcttcggcctccaccccacagcgccggcagctgatggcctctcccagccaggacatggagatgccactcatcagccagcacaaacaggccaaactcaaagagatcagcttgtccacagtgaggttcatggaggagctcggggaggaccggtttggcaaggtctacaaaggccacctgttcgggcctgccccaggagaaccaacccaggccgtggccatcaagacgctgaaagacaaggctgaggggcccctgcgggaggagttccggcaagaggcgatgctccgggcccgactgcagcaccccaacatcgtctgtctcctaggcgtcgtgaccaaggaccaacccttgagcatgatcttcagctactgttcccatggcgaccttcatgaattcctggtcatgcgctcgccgcactccgatgtgggcagcaccgatgacgaccgcacagtgaagtcagccctggagcccccggacttcgtgcacgtggtggcgcagatcgctgcggggatggagttcctgtccagccaccacgtgtgccataaggacctggccacacgcaatgtgctggtgtacgacaagctgaacgtgaggatctcagacttgggcctcttccgtgaggtatactccgcagattactacaaactcatgggcaattcactgctgcccatccgctggatgtcccccgaggccgtcatgtatggaaagttctccatcgactctgacatctggtcctacggtgtggtcctctgggaggtctttagctacggcctgcagccctactgtgggtactccaaccaggacgtggtggagatgatccggagccggcaggtgctgccctgcccggatgactgccccgcctgggtctatgccctcatgattgaatgctggaatgagttcccaagccggaggccccgctttaaggacatccacagccggctccggtcctggggcaacctatccaactataatagttccgcgcagacctcaggagccagcaacaccacacagaccagctccctgagcaccagccccgtaagcaatgtgagcaatgcccgctatatggcccccaagcagaaggcccagcccttcccacagcctcagttcatccccatgaagggtcagatcagacccttggtgccccccgcacagctgtacatcccggtgaacggctatcagccggtaccggcatacggggcctacctgcccaacttctacccagtccagatccccatgcagatggccccacagcaggtgccccctcagatggtccccaagccgagctcacaccacagtggcagcggctccaccagcactggctacgtcaccacggcgccctccaatacatctgtggcggacagggcggccctactctctgagggcaccgaggatgtacagaacatcgcggaagacgtggcccagagccctgtgcaggaagcagaggaggaggaggaggggtctgtccctgagactgaactcctgggagacaatgacacgctccaggtgaccgaggcggctcatgtccagcttgaagcctga

(seqidno:8)

已经显示ror2受体结合参与多种信号转导通路(包括wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16)的分泌的细胞外糖蛋白的wnt家族的成员。wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16可以激活ror-2依赖性信号转导(gaoetal.,(2011)dev.cell20:163–176)。已经显示wnt5a诱导u2os人成骨细胞中的ror2同源二聚化和酪氨酸磷酸化。此外，在存在wnt5a的情况下，观察到ror2底物14-3-3β支架蛋白的磷酸化增加，表明了wnt5a结合引起了ror2信号级联的活化(liuetal.2008)。wnt5a/ror2信号转导通路抑制经典wnt-β-连环蛋白信号转导(由受体卷曲蛋白介导)。

ror2靶向编码结缔组织生长因子的ctgf基因。ror2还靶向分别编码yes相关蛋白(yes-associatedprotein，yap)、taz和wnt5a蛋白的yap、taz和wnt5a基因(parketal.(2015)cell162:780–794)。单体ror2也可以与其他蛋白质相互作用，以形成能够进行下游信号转导的受体复合物。例如，在激活时，两个ror2分子可以相互作用以形成同源二聚体。可替代地，ror2可与ror1形成异二聚体。ror2还可以相互作用于(例如结合至)其他ror2共受体，包括但不限于卷曲受体或支架蛋白(例如多配体聚糖)。这些相互作用对于通过ror2进行的下游信号转导可能是必需的，并因此可以通过破坏这些相互作用来抑制ror2信号转导。

因此，可以通过许多不同的方法来评估ror2激活/抑制，例如测量：(i)ror2诱导的wnt-β-连环蛋白信号转导的抑制；(ii)ror2酪氨酸磷酸化；(iii)ror2下游靶标(例如14-3-3β支架蛋白)的磷酸化；(iv)ror2靶标基因(例如ctgf、yap、taz和wnt5a)的表达；或(v)ror2形成受体复合物的能力(例如ror2是否可以与受体复合物的其他成员相互作用)。本领域技术人员将能够选择合适的技术来测量(i)至(v)中的每项。

ror2抑制剂

本发明涉及ror2抑制剂及其在治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解中的治疗用途。

ror2抑制剂可以部分地或完全地抑制(例如减少、预防、消除或改善)ror2的至少一种功能或活性。例如，如本文所定义的，本发明的ror2抑制剂抑制ror2的至少一种活性或功能，这导致了，例如，刺激软骨细胞分化(这可能与软骨细胞分化标志物例如col2a1、aggrecan、erg的表达增加有关)、col1a1和/或colx的表达降低、胶原蛋白降解酶adamts-4和adamts-5的表达降低、gag的累积增加(例如gag的降解减少和/或gag的表达增加)、和/或oa相关的疼痛减少。ror2的抑制也可能导致内源性ctgf基因的转录减少和/或内源性ctgf蛋白的表达减少。

本发明的ror2抑制剂可以通过降低ror2的至少一种功能或活性的任何机制起作用。举例来说，本发明的ror2抑制剂可通过以下机制来抑制ror2的功能或活性：

(a)减少或预防内源性ror2基因的转录(例如将突变引入内源性ror2基因或使内源性ror2基因的一部分缺失)；

(b)减少或预防编码ror2蛋白的mrna的翻译(例如通过靶向编码ror2蛋白的mrna进行降解)；

(c)减少或预防ror2蛋白与一种或多种活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16))之间的相互作用；

(d)减少或预防ror2蛋白与ror2受体复合物的成员之间的相互作用，例如通过减少或预防第一ror2蛋白和第二ror2蛋白之间的相互作用、和/或减少或预防ror2蛋白与ror1蛋白、卷曲受体蛋白和/或支架蛋白(例如多配体聚糖)之间的相互作用；

(e)减少或预防ror2与下游靶标(例如14-3-3β支架蛋白)相互作用，和/或

(f)降低或预防ror2使下游靶标蛋白(例如14-3-3β)磷酸化的能力。

本发明的ror2抑制剂可通过与ror2的一个或多个活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和/或wnt16))结合，通过竞争来减少或预防内源性ror2与其活化配体之间的相互作用。

在一个实施方式中，ror2抑制剂是可溶性ror2蛋白。术语“可溶性ror2蛋白”和“ror2蛋白的可溶性片段”在本文可互换使用。可溶性ror2蛋白可包含全长ror2蛋白的一个或多个胞外结构域的全部或部分，全长ror2蛋白例如与seqidno:5具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的ror2蛋白或由与seqidno:6具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的ror2蛋白。

可溶性ror2蛋白可包含具有seqidno:5的序列的ror2蛋白的一个或多个胞外结构域的全部或一部分。可溶性ror2蛋白可包含由具有seqidno:6的序列的多核苷酸编码的ror2蛋白的一个或多个胞外结构域的全部或一部分。

可溶性ror2蛋白可包含具有seqidno:7的序列的全长ror2蛋白或与seqidno:7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的全长ror2蛋白的一个或多个胞外结构域的全部或一部分。可溶性ror2蛋白可包含由具有seqidno:8的序列的多核苷酸或由与seqidno:8具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的全长ror2蛋白一个或多个胞外结构域的全部或一部分。

如上所述，ror2的胞外部分/结构域包括(从n端起)：信号肽、免疫球蛋白结构域(ig)、富含半胱氨酸结构域(crd)和kringle结构域。人ror2蛋白的胞外部分/结构域可以具有seqidno:10的氨基酸序列。

可溶性ror2蛋白可包含与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽。可溶性ror2蛋白可包含具有seqidno:10的序列的多肽。

可溶性ror2蛋白可包含由具有seqidno:11的序列的多核苷酸或与seqidno:11具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

可溶性ror2蛋白可包含ror2的crd结构域的全部或一部分。如上所述，人ror2蛋白的示例crd结构域具有seqidno:12的序列。人ror2蛋白的示例crd结构域由具有seqidno:13的序列的多核苷酸编码。可溶性ror2蛋白可包含与seqidno:12具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽。可溶性ror2蛋白可包含具有seqidno:12的序列的多肽。可溶性ror2蛋白可包含由具有seqidno:13的序列的多核苷酸或与seqidno:13具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

可溶性ror2蛋白可包含ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段。胞外部分/结构域的片段可以是能够部分地或完全地抑制(例如减少、预防、消除或改善)ror2的至少一种功能或活性的功能片段。例如，ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可能能够：

(i)减少或预防ror2蛋白与一种或多种活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16))之间的相互作用；

(ii)减少或预防ror2蛋白与ror2受体复合物的成员之间的相互作用，例如通过减少或预防第一ror2蛋白和第二ror2蛋白之间的相互作用、和/或减少或预防ror2蛋白与ror1蛋白、卷曲受体蛋白和/或支架蛋白(例如多配体聚糖)之间的相互作用；

(iii)减少或预防ror2与下游靶标(例如14-3-3β支架蛋白)相互作用，和/或

(iv)降低或预防ror2使下游靶标蛋白(例如14-3-3β)磷酸化的能力。

ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可能能够通过与ror2的一个或多个活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和/或wnt16))结合，通过竞争来减少或预防内源性ror2与其活化配体之间的相互作用。

可溶性ror2蛋白可包含具有seqidno:10的序列的多肽或与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的片段。

可溶性ror2蛋白可包含由具有seqidno:11的序列的多核苷酸或与seqidno:11具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的片段。

ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段的长度可以为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段的长度可以为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段的长度可以为10-400个、20-375个、30-350个、40-325个、50-300个、60-275个、70-250个、90-225个、100-200个、120-180个、140-160个氨基酸。

ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含seqidno:10或与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含seqidno:10或与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含seqidno:10或与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的10-400个、20-375个、30-350个、40-325个、50-300个、60-275个、70-250个、90-225个、100-200个、120-180个、140-160个连续氨基酸。

ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含由具有seqidno:11的序列的多核苷酸或与seqidno:11具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含由具有seqidno:11的序列的多核苷酸或与seqidno:11具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含由具有seqidno:11的序列的多核苷酸或与seqidno:11具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的10-400个、20-375个、30-350个、40-325个、50-300个、60-275个、70-250个、90-225个、100-200个、120-180个、140-160个连续氨基酸。

ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的10-400个、20-375个、30-350个、40-325个、50-300个、60-275个、70-250个、90-225个、100-200个、120-180个、140-160个连续氨基酸。

ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含由具有seqidno:8的序列的多核苷酸或与seqidno:8具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含由具有seqidno:8的序列的多核苷酸或与seqidno:8具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375或400个连续氨基酸。ror2蛋白的胞外部分/结构域的片段可包含由具有seqidno:8的序列的多核苷酸或与seqidno:8具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的10-400个、20-375个、30-350个、40-325个、50-300个、60-275个、70-250个、90-225个、100-200个、120-180个、140-160个连续氨基酸。

除了ror2蛋白的胞外部分/结构域之外，可溶性ror2蛋白还可有效地包含其他结构域、接头、切割标签、和/或亲和标签。例如，可溶性ror2蛋白可以进一步包含能够使可溶性ror2蛋白靶向细胞的合适的膜锚。本领域已知的任何合适的膜锚可用于本发明的可溶性ror2蛋白。本领域技术人员能够选择合适的膜锚。

可以在本发明的可溶性ror2蛋白中使用的示例膜锚是gpi锚。gpi锚通常包含连接至烷基、烷基脂肪酸或神经酰胺链的能够与脂质双层(例如细胞膜)疏水地相互作用的磷脂酰乙醇胺(phosphoethanolamine，pe)-3man-glcn-磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，pi)-甘油的核。膜锚可以连接至ror2蛋白的胞外结构域的c端。

膜锚可以通过接头连接至ror2蛋白的胞外部分/结构域。因此，在ror2蛋白包含gpi锚的情况下，所述gpi锚可以通过接头(可以被称为gpi接头)连接至ror2蛋白的胞外部分/结构域的c端。示例gpi接头可具有以下氨基酸序列sssttttttttllllllllllllll(seqidno:9)。gpi接头可由以下核苷酸序列编码：

agcagcagcaccaccaccaccaccaccaccaccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctg(seqidno:14)。seqidno:14之后可以是终止密码子，例如tga、taa或tag(例如在载体中)。

ror2蛋白的可溶性片段还可以包括亲和标签。包含亲和标签使得可溶性ror2蛋白易于分离和/或纯化。本领域已知的任何合适的亲和标签可用于可溶性ror2蛋白。本领域技术人员能够选择合适的亲和标签。

亲和标签可以选自由以下组成的组：myc/his标签、myc标签、his标签、谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、strepii标签、flag标签、碱性磷酸酶标签、噬菌体t7表位标签(t7标签)、钙调蛋白结合肽(cbp)标签、半乳糖结合蛋白(gbp)标签、人流感血凝素(ha)标签及其组合。

亲和标签可以在胞外部分/结构域或膜锚的c端。

在一个实施方式中，ror2蛋白的可溶性片段还包括切割标签，该切割标签布置为允许从ror2蛋白的可溶性片段中切割亲和标签。用这种方式，可经由亲和标签捕获可溶性ror2蛋白，然后通过切割所述切割标签来回收。切割标签可以在胞外部分/结构域或膜锚的c端且在亲和标签的n端。切割标签选自由以下组成的组：肠激酶切割标签、烟草蚀刻病毒蛋白酶切割位点、凝血酶切割标签、xa因子(fxa)切割标签、人鼻病毒(hrv)3c蛋白酶(“prescission”)切割标签。

在一个实施方式中，切割标签是肠激酶切割标签。例如，具有氨基酸序列kdddd(seqidno:20)的肠激酶切割标签。肠激酶切割标签可以由核苷酸序列aaagatgatgatgat(seqidno:21)编码。可替代地，肠激酶切割标签可以由以下核苷酸序列编码：

agcagcagcaccaccaccaccaccaccaccaccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgaaagatgatgatgatgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattga

(seqidno:22)

在一个实施方式中，切割标签是烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签。例如，具有氨基酸序列gqfylne(seqidno:23)的烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签。烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签可以由核苷酸序列ggccagttttatctgaacgaa(seqidno:24)编码。可替代地，烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签可以由以下核苷酸序列编码：

agcagcagcaccaccaccaccaccaccaccaccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgggccagttttatctgaacgaagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattga

(seqidno:25)

包含ror2蛋白的胞外部分/结构域和gpi接头的本发明的示例可溶性ror2蛋白具有氨基酸序列：

margsalprrpllcipavwaaaalllsvsrtsgevevldpndplgpldgqdgpiptlkgyflnflepvnnitivqgqtailhckvagnpppnvrwlkndapvvqeprriiirkteygsrlriqdldttdtgyyqcvatngmktitatgvlfvrlgpthspnhnfqddyhedgfcqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtsthlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlesdlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaancmrigipaerlgryhqcyngsgmdyrgtasttksghqcqpwalqhphshhlsstdfpelggghaycrnpggqmegpwcftqnknvrmelcdvpscsprdsskmgilysssttttttttllllllllllllll

(seqidno:26)

因此，本发明提供了包含seqidno:26的多肽的ror2抑制剂。本发明还提供包含与seqidno:26具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的ror2抑制剂。

包含ror2蛋白的胞外部分/结构域和gpi接头的本发明的示例可溶性ror2蛋白由具有以下序列的多核苷酸编码：

atggcccggggctcggcgctcccgcggcggccgctgctgtgcatcccggccgtctgggcggccgccgcgcttctgctctcagtgtcccggacttcaggtgaagtggaggttctggatccgaacgaccctttaggaccccttgatgggcaggacggcccgattccaactctgaaaggttactttctgaattttctggagccagtaaacaatatcaccattgtccaaggccagacggcaattctgcactgcaaggtggcaggaaacccaccccctaacgtgcggtggctaaagaatgatgccccggtggtgcaggagccgcggcggatcatcatccggaagacagaatatggttcacgactgcgaatccaggacctggacacgacagacactggctactaccagtgcgtggccaccaacgggatgaagaccattaccgccactggcgtcctgtttgtgcggctgggtccaacgcacagcccaaatcataactttcaggatgattaccacgaggatgggttctgccagccttaccggggaattgcctgtgcacgcttcattggcaaccggaccatttatgtggactcgcttcagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagcggccttcaccatgatcggcacgtctacgcacctgtcggaccagtgctcacagttcgccatcccatccttctgccacttcgtgtttcctctgtgcgacgcgcgctcccgggcacccaagccgcgtgagctgtgccgcgacgagtgcgaggtgctggagagcgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggcttcagctgcccaagtgtgaggcgctgcccatgcctgagagccccgacgctgccaactgcatgcgcattggcatcccagccgagaggctgggccgctaccatcagtgctataacggctcaggcatggattacagaggaacggcaagcaccaccaagtcaggccaccagtgccagccgtgggccctgcagcacccccacagccaccacctgtccagcacagacttccctgagcttggaggggggcacgcctactgccggaaccccggaggccagatggagggcccctggtgctttacgcagaataaaaacgtacgcatggaactgtgtgacgtaccctcgtgtagtccccgagacagcagcaagatggggattctgtacagcagcagcaccaccaccaccaccaccaccaccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgaaagatgatgatgatgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattga

(seqidno:27)

因此，本发明提供具有seqidno:27的序列的分离的多核苷酸或与seqidno:27具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的分离的多核苷酸。

本发明还提供包含由seqidno:27编码的多肽的ror2抑制剂。本发明还提供包含由与seqidno:27具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的ror2抑制剂。

在一个实施方式中，可溶性ror2蛋白包含(从n端到c端)：(i)ror2蛋白的胞外部分/结构域；(ii)gpi接头；(iii)肠激酶切割标签；和(iv)myc/his标签。包含(从n端至c端)：(i)ror2蛋白的胞外部分/结构域；(ii)gpi接头；(iii)肠激酶切割标签；和(iv)myc/his标签的本发明的示例可溶性ror2蛋白具有氨基酸序列：

margsalprrpllcipavwaaaalllsvsrtsgevevldpndplgpldgqdgpiptlkgyflnflepvnnitivqgqtailhckvagnpppnvrwlkndapvvqeprriiirkteygsrlriqdldttdtgyyqcvatngmktitatgvlfvrlgpthspnhnfqddyhedgfcqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtsthlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlesdlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaancmrigipaerlgryhqcyngsgmdyrgtasttksghqcqpwalqhphshhlsstdfpelggghaycrnpggqmegpwcftqnknvrmelcdvpscsprdsskmgilysssttttttttllllllllllllllkddddeqkliseedlnmhtghhhhhh

(seqidno:28)

因此，本发明提供了包含seqidno:28的多肽的ror2抑制剂。本发明还提供包含与seqidno:28具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的ror2抑制剂。

包含(从n端至c端)：(i)ror2蛋白的胞外部分/结构域；(ii)gpi接头；(iii)肠激酶切割标签；和(iv)myc/his标签的本发明的示例可溶性ror2蛋白由具有以下序列的多核苷酸编码：

atggcccggggctcggcgctcccgcggcggccgctgctgtgcatcccggccgtctgggcggccgccgcgcttctgctctcagtgtcccggacttcaggtgaagtggaggttctggatccgaacgaccctttaggaccccttgatgggcaggacggcccgattccaactctgaaaggttactttctgaattttctggagccagtaaacaatatcaccattgtccaaggccagacggcaattctgcactgcaaggtggcaggaaacccaccccctaacgtgcggtggctaaagaatgatgccccggtggtgcaggagccgcggcggatcatcatccggaagacagaatatggttcacgactgcgaatccaggacctggacacgacagacactggctactaccagtgcgtggccaccaacgggatgaagaccattaccgccactggcgtcctgtttgtgcggctgggtccaacgcacagcccaaatcataactttcaggatgattaccacgaggatgggttctgccagccttaccggggaattgcctgtgcacgcttcattggcaaccggaccatttatgtggactcgcttcagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagcggccttcaccatgatcggcacgtctacgcacctgtcggaccagtgctcacagttcgccatcccatccttctgccacttcgtgtttcctctgtgcgacgcgcgctcccgggcacccaagccgcgtgagctgtgccgcgacgagtgcgaggtgctggagagcgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggcttcagctgcccaagtgtgaggcgctgcccatgcctgagagccccgacgctgccaactgcatgcgcattggcatcccagccgagaggctgggccgctaccatcagtgctataacggctcaggcatggattacagaggaacggcaagcaccaccaagtcaggccaccagtgccagccgtgggccctgcagcacccccacagccaccacctgtccagcacagacttccctgagcttggaggggggcacgcctactgccggaaccccggaggccagatggagggcccctggtgctttacgcagaataaaaacgtacgcatggaactgtgtgacgtaccctcgtgtagtccccgagacagcagcaagatggggattctgtacagcagcagcaccaccaccaccaccaccaccaccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgaaagatgatgatgatgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattga

(seqidno:29)

因此，本发明提供具有seqidno:29的序列的分离的多核苷酸或与seqidno:29具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的分离的多核苷酸。

本发明还提供包含由seqidno:29编码的多肽的ror2抑制剂。本发明还提供包含由与seqidno:29具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的ror2抑制剂。

在一个实施方式中，可溶性ror2蛋白包含(从n端到c端)：(i)ror2蛋白的胞外部分/结构域；(ii)gpi接头；(iii)烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签；和(iv)myc/his标签。包含(从n端至c端)：(i)ror2蛋白的胞外部分/结构域；(ii)gpi接头；(iii)烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签；和(iv)myc/his标签的本发明的示例可溶性ror2蛋白具有氨基酸序列：

margsalprrpllcipavwaaaalllsvsrtsgevevldpndplgpldgqdgpiptlkgyflnflepvnnitivqgqtailhckvagnpppnvrwlkndapvvqeprriiirkteygsrlriqdldttdtgyyqcvatngmktitatgvlfvrlgpthspnhnfqddyhedgfcqpyrgiacarfignrtiyvdslqmqgeienritaaftmigtsthlsdqcsqfaipsfchfvfplcdarsrapkprelcrdecevlesdlcrqeytiarsnplilmrlqlpkcealpmpespdaancmrigipaerlgryhqcyngsgmdyrgtasttksghqcqpwalqhphshhlsstdfpelggghaycrnpggqmegpwcftqnknvrmelcdvpscsprdsskmgilysssttttttttllllllllllllllgqfylneeqkliseedlnmhtghhhhhh

(seqidno:30)

因此，本发明提供了包含seqidno:30的多肽的ror2抑制剂。本发明还提供包含与seqidno:30具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多肽的ror2抑制剂。

包含(从n端至c端)：(i)ror2蛋白的胞外部分/结构域；(ii)gpi接头；(iii)烟草蚀刻病毒蛋白酶切割标签；和(iv)myc/his标签的本发明的示例可溶性ror2蛋白由具有以下序列的多核苷酸编码：

atggcccggggctcggcgctcccgcggcggccgctgctgtgcatcccggccgtctgggcggccgccgcgcttctgctctcagtgtcccggacttcaggtgaagtggaggttctggatccgaacgaccctttaggaccccttgatgggcaggacggcccgattccaactctgaaaggttactttctgaattttctggagccagtaaacaatatcaccattgtccaaggccagacggcaattctgcactgcaaggtggcaggaaacccaccccctaacgtgcggtggctaaagaatgatgccccggtggtgcaggagccgcggcggatcatcatccggaagacagaatatggttcacgactgcgaatccaggacctggacacgacagacactggctactaccagtgcgtggccaccaacgggatgaagaccattaccgccactggcgtcctgtttgtgcggctgggtccaacgcacagcccaaatcataactttcaggatgattaccacgaggatgggttctgccagccttaccggggaattgcctgtgcacgcttcattggcaaccggaccatttatgtggactcgcttcagatgcagggggagattgaaaaccgaatcacagcggccttcaccatgatcggcacgtctacgcacctgtcggaccagtgctcacagttcgccatcccatccttctgccacttcgtgtttcctctgtgcgacgcgcgctcccgggcacccaagccgcgtgagctgtgccgcgacgagtgcgaggtgctggagagcgacctgtgccgccaggagtacaccatcgcccgctccaacccgctcatcctcatgcggcttcagctgcccaagtgtgaggcgctgcccatgcctgagagccccgacgctgccaactgcatgcgcattggcatcccagccgagaggctgggccgctaccatcagtgctataacggctcaggcatggattacagaggaacggcaagcaccaccaagtcaggccaccagtgccagccgtgggccctgcagcacccccacagccaccacctgtccagcacagacttccctgagcttggaggggggcacgcctactgccggaaccccggaggccagatggagggcccctggtgctttacgcagaataaaaacgtacgcatggaactgtgtgacgtaccctcgtgtagtccccgagacagcagcaagatggggattctgtacagcagcagcaccaccaccaccaccaccaccaccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgggccagttttatctgaacgaagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattga

(seqidno:31)

因此，本发明提供具有seqidno:31的序列的分离的多核苷酸或与seqidno:31具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的分离的多核苷酸。

本发明还提供包含由seqidno:31编码的多肽的ror2抑制剂。本发明还提供包含由与seqidno:31具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％序列同一性的多核苷酸编码的多肽的ror2抑制剂。

针对ror2的寡核苷酸

本发明提供了针对ror2的寡核苷酸，该寡核苷酸，用于治疗骨关节炎和/或促进软骨修复和/或治疗与骨关节炎相关的疼痛的用途。这种针对ror2的寡核苷酸是根据本发明的ror2抑制剂。

在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)键组成的核苷酸或核苷单体的低聚物。术语“寡核苷酸”还包括包含有类似功能的非天然存在的单体、或其部分的寡聚物。在核酸酶存在下，这种修饰的或替代的寡核苷酸因为其性质(例如增强的细胞摄取、降低的免疫原性和增加的稳定性)而通常优于天然形式。

寡核苷酸通常被分类为脱氧核糖寡核苷酸(deoxyribooligonucleotide)或核糖寡核苷酸(ribooligonucleotide)，其是dna或rna分子的寡聚体。脱氧核糖寡核苷酸由5-碳糖(脱氧核糖)组成，该5-碳糖在糖的5'碳和3'碳上与磷酸盐共价连接，以形成交替的无支链聚合物。核糖寡核苷酸由相似的重复结构组成，其中5-碳糖为核糖。

本文所述的寡核苷酸可以是单链dna或rna、双链dna或rna、dna-rna杂合体、或嵌合的dna-rna结构。双链rna的示例包括例如，sirna、短发夹rna(shrna)和诸如前体mirna(pre-mirna)的其他rnai试剂。单链寡核苷酸包括例如，反义寡核苷酸、核酶、成熟mirna、以及三链形成寡核苷酸。

使用已知技术并基于对ror2基因的序列的了解(例如，基于seqidno:2和seqidno:4的核苷酸序列)，可以设计双链rna(dsrna)分子以通过基于序列同源性的对其rna转录物的靶向来抑制ror2基因。这种dsrna可以是通常呈茎环(“发夹”)构型的sirna，或可以是微rna(mirna)。这种dsrna的序列将包含与ror2基因的mrna转录物的一部分的序列相对应的部分。该部分通常将与包含显性突变的等位基因内的靶标部分100％互补，但也可以使用较低水平的互补性(例如60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、90％或更高、或95％或更高)。

使用已知技术并基于对ror2基因的序列的了解(例如，基于seqidno:2和seqidno:4的核苷酸序列)，可以设计单链反义寡核苷酸以通过基于序列同源性的对其rna转录物的靶向来抑制等位基因。这种反义寡核苷酸的序列将包含与ror2基因的mrna转录物的一部分的序列相对应的部分。该部分通常将与包含显性突变的等位基因内的靶标部分100％互补，但也可以使用较低水平的互补性(例如60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、90％或更高、或95％或更高)。在一个实施方式中，寡核苷酸是反义寡核苷酸(aon)。aon可以经由沃森克里克碱基配对(watson-crickbasepairing)通过结合至前体mrna或mrna而起作用，并通过机制如通过核糖核酸酶h(rnaseh)介导的mrna降解来诱导基因抑制。aon可以具有与mrna编码互补的核苷酸序列。

在一些情况下，寡核苷酸的总长度可以多达100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个或30个核苷酸。在其他情况下，总长度可以为29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个或10个核苷酸，特别是14-25个核苷酸。

本发明的aon可以是gapmer或altimer。gapmer是一种嵌合aon，其包含dna分子的中心嵌段，侧翼是保护内部嵌段免受核酸酶降解的2'-o修饰的核糖寡核苷酸或其他人工修饰的核糖寡核苷酸单体的嵌段。寡核苷酸含有dna碱基，其中dna碱基中的一些或全部碱基具有硫代磷酸化骨架。例如，没有dna碱基、dna碱基中有5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个碱基具有硫代磷酸化骨架。与未修饰的dna相比，含有硫代磷酸化骨架的dna提供对核酸酶的增加的抵抗力。

在一个实施方式中，寡核苷酸包含修饰以帮助增强寡核苷酸的性质。因此，可以通过用至少一个修饰的核苷酸替代至少一个核苷酸来修饰本发明的寡核苷酸，理想地使得与相应的未修饰的寡核苷酸相比，该寡核苷酸的体内和体外稳定性得到增强。例如，修饰的核苷酸可以是糖修饰的核苷酸或核碱基修饰的核苷酸。在一些情况下，可以包括两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰的核苷酸，或在其他情况下，可以包括至少以下数目：八个、九个、十个、十一个或十二个这种修饰，或在其他情况下，可以包括至少以下数目：十五个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个、二十四个、二十五个或可以修饰至少这些数目。在另一些情况下，所有核苷酸都可以被修饰，或者除了一个、两个、三个、四个或五个核苷酸之外的所有核苷酸可以被修饰。

在一些情况下，修饰的核苷酸是2'-脱氧核糖核苷酸。在某些情况下，2'-脱氧核糖核苷酸是2'-脱氧鸟苷或2'-脱氧腺苷。在其他情况下，修饰的核苷酸是2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基(例如，2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基假尿苷、2'-o-甲基尿苷、2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基)核糖核苷酸。在一些情况下，修饰的核苷酸选自2'-氨基、2'-硫基和2'-氟修饰的核糖核苷酸。在进一步的例子中，修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2'-氟胞苷、2'-氟尿苷、2'-氟鸟苷、2'-氟腺苷、2'-氨基胞苷、2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鸟苷、2'-氨基-丁酰基-芘-尿苷和2'-氨基-腺苷。在另外的例子中，修饰的核苷酸选自5-碘尿苷、核糖胸苷、5-溴尿苷、2-氨基嘌呤、5-甲基胞苷、5-氟胞苷、和5-氟尿苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫尿苷、以及5-氨基烯丙基尿苷。

在一些情况下，修饰的核苷酸包括：5位的衍生物，例如选自5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、5-丙炔尿苷、5-丙烯基尿苷；6位的衍生物，例如6-(2-氨基)丙基尿苷；腺苷和/或鸟苷的8位的衍生物，例如8-溴鸟苷、8-氯鸟苷、或8-氟鸟苷，可以使用的核苷酸类似物包括脱氮核苷酸，例如7-脱氮腺苷；o-和n-修饰的(例如烷基化的，例如n6-甲基腺苷)核苷酸；及其他杂环修饰的核苷酸类似物。可以使用的对核苷酸的糖部分的修饰的示例包括被选自h、or、r、f、cl、br、i、sh、sr、nh2、nhr、nr2、coor或or的基团取代的2'oh基团，其中r是取代或未取代的c1-c6烷基、c1-c6烯基、c1-c6炔基、c1-c6芳基等。

核苷酸的磷酸基团也可以被修饰，例如通过用硫取代磷酸基团中的一个或多个氧(例如通过使用硫代磷酸酯)。修饰可以例如通过抑制由核酸外切酶进行的降解来降低包含修饰的碱基的多核苷酸的水解速率。在一优选的例子中，寡核苷酸对核糖核酸酶具有抗性。可以采用的寡核苷酸包括具有修饰以增强这种抵抗的寡核苷酸，例如本发明的寡核苷酸可以优选用2'-o-甲基基团(例如2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基假尿苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基尿苷、2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基)来修饰并且另外包含硫代磷酸酯骨架。

在一些情况下，寡核苷酸包含含有硫代磷酸酯和2'-o-甲基(例如，2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基假尿苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基尿苷，2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基)修饰的寡核苷酸。可以采用其他形式的寡核苷酸修饰，例如，锁核酸(包含至少一个2'-c、4'-c-氧-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体的寡核苷酸)。在一些情况下，采用的修饰的核苷酸可以是5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辫苷(beta-d-galactosylqueosine)、肌苷、n6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基肌辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、1,5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2,6-二氨基嘌呤。

在一些情况下，修饰的寡核苷酸可包括对磷酸骨架的修饰，例如甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、吗啉膦酸酯、哌嗪膦酸酯和氨基膦酸酯。在一个示例中，核苷酸间桥接磷酸残基中的每隔一个残基可以如所述进行修饰。在另一个非限制性示例中，这种寡核苷酸是其中核苷酸中的至少一个核苷酸或全部核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，c1-c4、直链或支链的、饱和或不饱和烷基，诸如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)的寡核苷酸。

在一个实施方式中，寡核苷酸是小干扰rna(sirna)。sirna通过激活rnai诱导的抑制复合物(rnai-inducedsuppressioncomplex，也称为risc复合物)起作用。本发明的sirna可以是未修饰的或修饰的，能够抑制(即部分地或完全地防止)ror2蛋白的表达。本发明的sirna可以防止ror2基因的表达。本发明的sirna可以防止编码ror2蛋白的mrna的翻译。本发明的sirna可以通过影响ror2蛋白的翻译后修饰来减少或防止ror2蛋白表达。本发明的sirna的长度可以为约5-60个核苷酸、约5-55个核苷酸、约5-50个核苷酸、约5-45个核苷酸、约5-40个核苷酸、约5-35个核苷酸、约5-30个核苷酸、约5-25个核苷酸、约5-20个核苷酸、约5-15个核苷酸、或约5至10个核苷酸。

在一些实施方式中，修饰的sirna含有至少一个2'o-me嘌呤或嘧啶核苷酸，例如2'o-me-鸟苷、2'o-me-尿苷、2'o-me-腺苷、和/或2'o-me-胞嘧啶核苷酸。修饰的核苷酸可以存在于sirna的一条链(即有义链或反义链)或两条链中。sirna序列可以具有突出端(overhang)或平末端(bluntend)。

修饰的sirna可以包含sirna双链体的双链区域中的约1％至约100％(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的修饰的核苷酸。在某些实施方式中，sirna的双链区域中的核苷酸中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个包含修饰的核苷酸。

可以使用本领域已知的任何手段来识别合适的sirna序列。通常，将elbashiretal.,nature,411:494-498(2001)和elbashiretal.,emboj.,20:6877-6888(2001)中描述的方法与reynoldsetal.,naturebiotech.,22(3):326-330(2004)中提出的合理设计规则相结合。

优选地，sirna是化学合成的。可以使用本领域中已知的多种技术(例如usmanetal.,j.am.chem.soc.,109:7845(1987)；scaringeetal.,nucl.acidsres.,18:5433(1990)；wincottetal.,nucl.acidsres.,23:2677-2684(1995)；以及wincottetal.,methodsmol.bio.,74:59(1997)中描述的那些技术)中的任何技术来合成包含本发明的sirna分子的寡核苷酸。寡核苷酸的合成利用了常见的核酸保护和偶联基团，例如5'端的二甲氧基三苯甲基和3'端的亚磷酰胺。可替代地，sirna分子可由两个不同的寡核苷酸组装，其中一个寡核苷酸包含有义链，而另一个包含sirna的反义链。例如，每条链可以分开合成，并在合成和/或去保护后通过杂交或连接而接合在一起。在某些其他情况下，可以将sirna分子合成为单个连续的寡核苷酸片段，其中自补的有义区域和反义区域杂交以形成具有发夹二级结构的sirna双链体。

在一个实施方式中，针对ror2的寡核苷酸是包含向导rna序列和tracrrna的向导rna。向导rna序列能够与具有内源ror2基因的dna序列的靶标序列杂交。tracrrna与向导rna序列偶联。向导rna与ror2内的位点杂交，并使crispr-cas酶靶向所述位点。在一些实施方式中，向导序列的长度为10-30个核苷酸、或15-25个核苷酸、或15-20个核苷酸。优选地，crispr-cas酶是ii型crispr酶，例如cas-9。该酶与向导rna复合。在一个实施方式中，该酶是有活性的，并充当核酸内切酶通过激活非同源末端接合或同源dna修复通路来切割dna，从而导致平末端切口或缺口。可以提供修复模板序列，并通过同源重组将其引入等位基因，从而替代其靶向的序列，例如等位基因的dna中的突变。在另一个实施方式中，该酶靶向于显性突变等位基因的dna，但是该酶包含一种或多种降低或消除其核酸内切酶活性的突变，使得其不编辑突变等位基因，但是防止或降低其转录。在另一个实施方式中，可以对酶进行改造，使其融合到转录抑制因子(transcriptionalrepressor)中，以减少或破坏其核酸内切酶功能。该酶将能够结合向导rna并靶向dna序列，但是不会发生dna切割。可以例如通过关闭启动子或对rna聚合酶进行阻断来抑制ror2基因。在另一个实施方式中，转录抑制因子可以与tracr序列结合。如konermann等人(genome-scaletranscriptionalactivationbyanengineeredcrispr-cas9complex,nature,vol000,2014)所述，可以通过掺入蛋白结合rna适体序列使功能域附接至tracr序列。转录抑制因子-tracr序列复合物可用于使其他部分靶向至所期望的精确的基因位置。

本发明的寡核苷酸可以与肽或受体缀合。为了辅助寡核苷酸的递送，肽可以例如是细胞穿透肽。该技术例如在wo2009/147368、wo2013/030569、wo2012/150960和wo2004/097017中描述。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸可以与运载体缀合或被封装在脂质体内。本发明提供了与运载体缀合或被封装在脂质体内的本发明的sirna。在一个实施方式中，该运载体选自由去端肽胶原、诸如胆固醇的脂质、生物聚合物、以及诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒组成的组。

本发明的寡核苷酸可以与来自ror2基因(例如内源性ror2基因)的rna转录物的区域互补。在一个例子中，该寡核苷酸将与该序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸互补，优选与该序列的13-25个或16-21个核苷酸互补。

在一个例子中，本发明的寡核苷酸的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，优选地长度至少为19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸的长度为10至35个核苷酸，例如长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个核苷酸。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸的长度为18至30个核苷酸，例如长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸的长度为21个核苷酸。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸的长度为29个核苷酸。能够杂交的寡核苷酸的区域可以是该长度，或至少是该长度，但是在寡核苷酸的5'和/或3'端也有另外的核苷酸，尽管在其他例子中寡核苷酸的全长是该数目的核苷酸。

通常，可以优选采用与靶标rna的一部分完全互补的寡核苷酸序列。在一些情况下，可能存在因遗传突变、品系多态性或进化趋异而可预期的序列变异，可能存在。例如，相对于靶标序列具有插入、缺失和单点突变的寡核苷酸序列也可以有效用于抑制。寡核苷酸序列与靶标rna(例如靶标前体mrna)之间的大于70％的序列同一性(或互补性)、例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列同一性是优选的。

序列同一性，包括确定核酸序列的序列互补性，可以通过本领域已知的序列比较和比对算法来确定。为了确定两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的百分比同一性，处于最佳比较目的进行序列比对(例如，可以在第一序列或第二序列中引入空位以进行最佳比对)。然后比较相应核苷酸(或氨基酸)位置处的核苷酸(或氨基酸残基)。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置处的相同的残基占据时，则分子在该位置是相同的。两条序列之间的百分比同一性是该序列共享的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同位置数/位置总数*100)，可选地对引入的空位数和/或引入的空位长度进行罚分。

可以使用数学算法来完成序列比较和两个序列之间的百分比同一性的确定。在一个实施方式中，在具有足够同一性的比对的序列的特定部分上产生比对，而不是在具有低程度同一性的部分上产生比对(即，局部比对)。用于比较序列的局部比对算法的一个优选的非限制性示例是karlinandaltschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264-68的算法，该算法在karlinandaltschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-77中进行了改进。altschul,etal.(1990)j.mol.biol.215:403-10的blast程序(版本2.0)并入了这种算法。

在另一个实施方式中，通过引入适当的空位来优化比对，并在比对序列的长度上确定百分比同一性(即，空位比对)。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如altschuletal.,(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402所述使用gappedblast。在另一个实施方式中，通过引入适当的空位来优化比对，并且在比对序列的整个长度上确定百分比同一性(即，全局比对)。用于序列的全局比较的数学算法的一个优选的非限制性示例是myersandmiller,cabios(1989)的算法。这种算法被合并到align程序(版本2.0)中，align程序(版本2.0)是gcg序列比对软件包的一部分。当采用align程序来比较氨基酸序列时，可以使用pam120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。

针对ror2的sirna和shrna

本发明涉及针对ror2的sirna和shrna及其在治疗和/或预防软骨缺失、治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解中的治疗用途。

在一个实施方式中，本发明的ror2抑制剂是sirna，该sirna包含选自由以下组成的组的序列：

(i)5'aagucuacaaaggucaccugu3’(seqidno:1)，包含seqidno:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'aagucuacaaaggucaccuguccugucuc3’(seqidno:2)，包含seqidno:2的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'aaacaggugaccuuuguagac3’(seqidno:3)，包含seqidno:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iv)5'aaacaggugaccuguagacccugucuc3’(seqidno:4)，包含seqidno:4的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及

(v)与seqidno:1-4中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含seqidno:1-4中的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在一个实施方式中，用于根据权利要求4或11所述的用途的ror2抑制剂，其中sirna包括序列：

(i)5'aagucuacaaaggucaccugu3’(seqidno:1)，包含seqidno:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；和

(ii)5'aaacaggugaccuuuguagac3’(seqidno:3)，包含seqidno:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

本发明的任何sirna还可以在3'端包含核苷酸序列ccugucuc。该序列的并入能够促进sirna的合成。

包括本发明的sirna和shrna的本发明的寡核苷酸可以与运载体缀合或被封装在脂质体内。因此，本发明提供了与运载体缀合或被封装在脂质体内的本发明的sirna。在一个实施方式中，该运载体选自由去端肽胶原、诸如胆固醇的脂质、生物聚合物、以及诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒组成的组。

如实施例5中所述，本发明人在实施例5中使用了针对ror2的sirna-去端肽胶原缀合物以使ror2基因在体内沉默。去端肽胶原缀合的sirna在与软骨内的靶标结合方面被证明是极其有效的，其中密集的无血管的胞外基质阻碍了许多合成生物分子或天然生物分子的有效渗透。

因此，在一个实施方式中，本发明的sirna与去端肽胶原缀合。去端肽胶原是一种高度纯化的胃蛋白酶处理过的i型胶原蛋白。胶原蛋白是结缔组织中的一种纤维蛋白，其在维持组织和器官的形态方面起着重要作用。胶原蛋白分子在n和c端都有一个称为端肽(telopeptide)的氨基酸序列，该氨基酸序列赋予大多数胶原蛋白抗原性。通过胃蛋白酶处理获得的去端肽胶原由于其缺乏端肽而免疫原性低，并且在临床上用于大范围的目的，包括伤口愈合、脉管假体并且还用作骨软骨替代物和止血剂。去端肽胶原在体内移植后显示出低毒性和低免疫原性。minakuchietal.2004中更详细地讨论了使用去端肽胶原作为载体来递送sirna(nucleicacidsres.2004；32(13):e109)。

在另一方面,本发明提供针对ror2的shrna，该sirna包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：

(i)5'gguucacgacugcgaauccaggaccugga3’(seqidno:15)，包含seqidno:15的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(ii)5'aagaccauuaccgccacuggcguccuguu3’(seqidno:16)，包含seqidno:16的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iii)5'auggauuacagaggaacggcaagcaccac3’(seqidno:17)，包含seqidno:17的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(iv)5'aagcagaaggcaucugcguccacaccgca3’(seqidno:18)，包含seqidno:18的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；

(v)5'ccuugagcaugaucuucagcuacuguucc3’(seqidno:19)，包含seqidno:19的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及

(vi)与seqidno:15-19中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含seqidno:15-19中的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。

在另一方面，本发明提供了本发明的shrna作为药物的用途。在另一方面，本发明提供了针对ror2的shrna在用于在对象中治疗骨关节炎和/或促进软骨修复和/或治疗与骨关节炎相关的疼痛中的用途。在一个实施方式中，可以使用病毒载体递送shrna。病毒载体可以包装在病毒颗粒、例如慢病毒颗粒中。可用于递送针对ror2的shrna的慢病毒颗粒的示例是tl320439，其可从origene商购获得。

寡核苷酸递送

可以使用任何合适的方法将本发明的寡核苷酸(包括本发明的sirna和本发明的shrna)引入细胞中。例如，可以使用转染、电穿孔、融合、脂质体、胞外囊泡(例如外来体或微泡)、胶体聚合物颗粒、树状聚合物以及病毒和非病毒载体以及本领域已知的其他方式将寡核苷酸序列递送至细胞。

在一些情况下，使用涉及脂质体介导的摄取的方法来递送寡核苷酸。lipofectin和cytofectin是基于脂质的正离子，其与带负电荷的核酸结合并形成复合物，该复合物可运送核酸穿过细胞膜并且可以被利用。在一种情况下，lipofectin用于递送本发明的寡核苷酸，特别是lipofectamine2000。在一种情况下，可使用试剂递送寡核苷酸。例如，可使用涉及试剂的方法将寡核苷酸递送至体外细胞。在一些情况下，可能不需要转染试剂，且寡核苷酸可直接通过gymnosis而被靶标细胞吸收。

在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸可以使用包含树状聚合物的组合物来递送。树状聚合物是具有明确定义的、均质的和单分散结构的纳米级径向对称分子，该分子具有典型的对称核、内壳和外壳(madaanetal.(2014)jpharmbioalliedsci.2014jul-sep；6(3):139–150)。任何树状聚合物都可能适用于递送本发明的寡核苷酸。与本发明的寡核苷酸一起使用的树状聚合物可以包括由聚酰胺胺(pamam)，聚(丙烯亚胺)(ppi)、聚l-赖氨酸、三聚氰胺、聚(醚羟胺)(peham)、聚(酯胺)(pea)和/或聚甘油组成的组。

递送可以指向对象，或例如指向细胞或组织，例如随后再引入细胞或组织中。本发明的寡核苷酸可以直接引入靶标细胞或细胞外引入腔、间质腔、引入对象的循环中，口服引入，或者可以通过使用将核酸引入体内细胞的方法将细胞或生物体浸入含有rna的溶液中来引入。

在一个实施方式中，本发明的ror2抑制剂或sirna是通过关节内注射来递送的。

本发明的寡核苷酸可以通过任何合适的施用途径来递送。在一些情况下，施用可能是全身性的，而在另一些情况下，施用可能是局部性的。例如，可通过在组织部位直接注射或输注到体液中来施用寡核苷酸。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊髓液是可引入rna的部位的例子。

本发明的寡核苷酸可以例如通过任何合适的方法递送至对象的关节。在某些情况下，寡核苷酸可以通过透皮方法递送。寡核苷酸也可经由可植入装置递送。

引入本发明的寡核苷酸的物理方法包括注射含有本发明的寡核苷酸的溶液、轰击被本发明的寡核苷酸覆盖的颗粒、将细胞或生物体浸泡在本发明的寡核苷酸的溶液中、或在本发明的寡核苷酸存在下对细胞膜进行电穿孔。包装在病毒颗粒中的病毒载体可用于实现将本发明的寡核苷酸有效引入细胞中，并转录由表达构建体编码的本发明的寡核苷酸。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，例如脂质介导的运载体转运、化学介导的转运，例如磷酸钙等。可以将本发明的寡核苷酸与执行以下活性中的一种或多种的组分一起引入：增强细胞对本发明寡核苷酸的摄取、抑制本发明寡核苷酸的单链的退火、稳定本发明寡核苷酸的单链、防止本发明寡核苷酸的降解或相反地增加对靶标基因的抑制。

可以修饰本发明的寡核苷酸，使得其靶向特定的细胞，例如通过结合至在特定的细胞类型上发现的受体。可以使用载体将本发明的寡核苷酸递送至细胞。

载体

本发明还提供一种载体，该载体包含编码本发明的ror2抑制剂或本发明的sirna的核苷酸序列。如本文所用，术语“载体”是指适于将编码本发明的ror2抑制剂或sirna的核苷酸序列递送至靶标细胞的分子或构建体。

病毒载体

在一个实施方式中，该载体是病毒载体，可选地该载体选自由慢病毒载体、逆转录病毒载体、和腺相关病毒(aav)载体组成的组。在一个实施方式中，aav载体是一种自补aav(self-complementaryaav，scaav)载体。本发明的病毒载体可以衍生自或可衍生自任何合适的病毒。

在一个实施方式中，病毒载体是重组病毒颗粒。重组病毒颗粒能够用编码本发明的ror2抑制剂或sirna的核苷酸序列转导靶标细胞。对于逆转录病毒颗粒，一旦进入细胞，来自载体颗粒的rna基因组将被逆转录成dna，并整合到靶标细胞的基因组中。

慢病毒载体

慢病毒(lentiviruses)是一大群逆转录病毒中的一部分。慢病毒的详细列表可以在coffinetal.(1997)“retroviruses”coldspringharborlaboratorypresseds:jmcoffin,smhughes,hevarmuspp758-763)中找到。简而言之，慢病毒可分为灵长类组和非灵长类组。灵长类慢病毒的例子包括但不限于：人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)、获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)的病原体和猿猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus，siv)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢性病毒(slowvirus)”梅迪/维斯那病毒(visna/maedivirus，vmv)、以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(caprinearthritis-encephalitisvirus，caev)、马传染性贫血病毒(equineinfectiousanaemiavirus，eiav)、猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，fiv)和牛免疫缺陷病毒(bovineimmunodeficiencyvirus，biv)。逆转录病毒(例如mlv)无法感染未分裂或缓慢分裂的细胞，诸如那些组成，例如肌肉、眼睛、大脑、肺和肝组织的细胞。

如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个可衍生自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞、表达基因或被复制的生物学机制。逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构有许多共同特征，例如，5'ltr和3'ltr(包装信号位于5'ltr和3'ltr之间或在5'ltr和3'ltr之内，以使基因组能够被包装)、引物结合位点、附着位点(以使整合到宿主细胞基因组中成为可能)、以及编码包装成分的gag、pol和env基因-这些是组装病毒颗粒所需的多肽。慢病毒具有另外的特征，例如hiv中的rev和rre序列，该序列能够使得整合的前病毒的rna转录物能够有效地从受感染的靶标细胞的细胞核输出到细胞质。

在前病毒中，病毒基因在其两端侧接有称为长末端重复序列(longterminalrepeats，ltr)的区域。ltr通过充当增强子-启动子序列和聚腺苷酸化信号来负责转录，从而控制病毒基因的表达。ltr本身是相同的序列，可以分为三个元件，分别称为u3、r和u5。u3衍生自rna的3'端独有的序列。r衍生自rna的两端处的重复的序列，以及u5衍生自rna的5'端独有的序列。在不同病毒之间，这三个元件的大小可能会相差悬殊。

在复制缺陷型慢病毒载体基因组中，gag、pol和env可能不存在或不起作用。

在本发明的典型的慢病毒载体中，可以从病毒中去除复制必需的一个或多个蛋白质编码区域中的至少一部分。这使得病毒载体是复制缺陷型的。病毒基因组的部分也可以用编码本发明的ror2抑制剂或sirna的核苷酸序列代替，以产生包含编码本发明的ror2抑制剂或sirna的核苷酸序列的载体，该载体能够转导靶标非分裂宿主细胞和/或将靶标非分裂宿主细胞的基因组整合到宿主基因组中。

在一个实施方式中，慢病毒载体是如wo2007/071994中所述的非整合载体。在另一个实施方式中，载体具有递送没有或缺乏病毒rna的序列的能力。在另一个实施方式中，位于待递送的rna上的异源结合结构域(与gag异源)和gag或pol上的同源结合结构域可用于确保对待递送的rna进行包装。这两个载体均在wo2007/072056中描述。

慢病毒载体可以是“非灵长类”载体，即，衍生自不主要感染灵长类特别是人类的病毒。

病毒载体可以衍生自eiav。除了gag、pol和env基因之外，eiav还编码其他三个基因：tat、rev和s2。tat充当病毒ltr的转录激活物(derseandnewbold(1993)virology194(2):530-536andmauryetal(1994)virology200(2):632-642)，rev通过rev应答元件(rev-responseelement，rre)调节并协调病毒基因的表达(martaranoetal.(1994)jvirol68(5):3102-3111)。这两种蛋白质的作用机制被认为与灵长类病毒的类似机制大致相似(martaranoetal.(1994)jvirol68(5):3102-3111)。s2的功能是未知的。此外，已经鉴定出eiav蛋白，ttm，是由被剪接到跨膜蛋白起始处的env编码序列的tat的第一个外显子编码的(beiseletal.(1993)jvirol67(2):832-842)。

术语“重组慢病毒载体”是指具有足够的慢病毒遗传信息以允许在包装成分存在的情况下将rna基因组包装到能够感染靶标细胞的病毒颗粒中的载体。靶标细胞的感染可包括逆转录和整合到靶标细胞基因组中。重组慢病毒载体携带通过载体待递送至靶标细胞的非病毒编码序列，例如编码本发明的ror2抑制剂或sirna的非病毒编码序列。重组慢病毒载体不能独立复制以在最终靶标细胞内产生传染性慢病毒颗粒。通常，重组慢病毒载体缺乏复制所必需的功能性gag-pol和/或env基因和/或其他基因。本发明的重组慢病毒载体可以具有最小的病毒基因组。

抗ror2抗体

本发明涉及与ror2结合的抗体，在本文中称为抗ror2抗体。本发明涉及这种抗体的用途，例如用于治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解中的治疗用途。

抗体优选地与ror2特异性结合，即该抗体与ror2结合，但该抗体不与其他分子结合或以较低亲和力与其他分子结合。本文所用的术语ror2可以指人ror2。可替代地，本文所用的术语ror2可指非人ror2，例如鼠ror2。

人ror2蛋白的序列在seqidno:5中列出。鼠ror2蛋白的序列在seqidno:7中列出。本发明的抗体可能对来自其他哺乳动物的ror2具有结合亲和力，例如来自灵长类或啮齿类(例如小鼠或大鼠)的ror2。

在一个实施方式中，本发明的抗体阻断ror2的功能，这种抗ror2抗体可以被称为“阻断抗体”或“阻断性抗ror2抗体”。这些术语可以互换使用。

ror2的阻断涵盖ror2的至少一种活性或功能的任何降低，这导致了，例如刺激相关的软骨细胞分化(这可能与软骨细胞分化标志物例如col2a1、aggrecan、和/或erg的表达增加有关)、col1a1和/或colx的表达降低、胶原蛋白降解酶adamts-4和adamts-5的表达降低、gag的表达增加、oa相关的疼痛减少。

例如，ror2的阻断可以通过阻断与活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16))之间的相互作用、阻断ror2蛋白与ror2受体复合物中的成员之间的相互作用、或通过阻断ror2与下游细胞内靶标(例如14-3-3β支架蛋白)的相互作用来实现。例如，本发明的抗ror2抗体可以阻断以下中的一种或多种：

(a)ror2蛋白与一种或多种活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16))之间的相互作用；

(b)ror2蛋白与ror2受体复合物中的成员之间的相互作用，例如第一ror2蛋白与第二ror2蛋白之间的相互作用，和/或ror2蛋白与ror1蛋白、卷曲受体蛋白和/或支架蛋白(例如多配体聚糖)之间的相互作用；

(c)ror2与下游靶标(例如14-3-3β支架蛋白)作用之间的相互作用，该相互作用可以降低或防止ror2使所述下游靶标蛋白(例如14-3-3β)磷酸化的能力。

ror2的阻断可能导致内源性ctgf基因、yap基因和/或taz基因的转录减少。ror2的阻断可能导致内源性ctgf蛋白、yap蛋白或taz蛋白的表达降低。

阻断涵盖ror2的活性或功能的全部降低或部分降低。例如，本发明的阻断性抗ror2抗体可以全部或部分减少：

(a)ror2蛋白与一种或多种活化配体(例如wnt家族成员(例如wnt5a、wnt3a、wnt1、wnt11、wnt4和wnt16))之间的相互作用；

(b)ror2蛋白与ror2受体复合物中的成员之间的相互作用，例如第一ror2蛋白与第二ror2蛋白之间的相互作用，和/或ror2蛋白与ror1蛋白、卷曲受体蛋白和/或支架蛋白(例如多配体聚糖)之间的相互作用；

(c)ror2与下游靶标(例如14-3-3β支架蛋白)作用之间的相互作用，该相互作用可以降低或防止ror2使所述下游靶标蛋白(例如14-3-3β)磷酸化的能力。本发明的抗ror2抗体还可以全部或部分阻断内源性ctgf蛋白的内源性ctgf基因、yap基因和/或taz基因表达的转录。例如，本发明的抗ror2抗体可以使ror2的活性或功能降低10％至50％，至少50％或至少70％、80％、90％、95％或99％。

ror2活性或功能的阻断可通过任何合适的手段来测量。例如，基于ror2酪氨酸磷酸化和14-3-3β支架蛋白磷酸化是活化的wnt5a/ror2信号转导通路的特征，可以通过测量对ror2酪氨酸磷酸化和/或14-3-3β支架蛋白的影响来确定wnt5a/ror2相互作用的阻断。还可以使用激酶测定法来确定ror2活性的阻断，在激酶测定法中，测量ror2的合成底物(例如，衍生自天然底物的短肽，比如vangl2)的ror2依赖性磷酸化。例如，可以通过蛋白质印迹法来测量vangl2的磷酸化。还可以通过用阿尔新蓝对在存在或不存在ror2抑制剂的情况下培养的细胞染色和/或通过在存在或不存在ror”抑制剂的情况下培养的细胞中测定aggrecan的表达来测量对ror2活性的阻断。

术语“结合活性”和“结合亲和力”旨在指抗体分子与靶标结合或不与靶标结合的趋势。结合亲和力可以通过确定抗体及其靶标的解离常数(kd)来量化。类似地，抗体相对于其靶标的结合特异性可以根据抗体对其靶标的与相对于抗体和另一非靶标分子的解离常数相比的比较性解离常数(kd)来定义。

在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体不与ror1结合，即，抗ror2抗体不与ror1交叉反应。

通常，抗体相对于靶标的kd将比相对于其他非靶标分子(例如环境中的无关物质或附带物质)的kd小2倍、优选地5倍、更优选地10倍。更优选地，kd将小50倍，甚至更优选地小100倍，并且还更优选地小200倍。

该解离常数的值可以通过公知方法直接确定，并且即使对于复杂的混合物，也可以通过诸如那些，例如cacecietal.(byte9:340-362,1984)的方法来计算。例如，可以使用诸如wong&lohman(proc.natl.acad.sci.usa90,5428-5432,1993)公开的双滤膜硝化纤维素滤膜结合测定法(double-filternitrocellulosefilterbindingassay)来确定kd。

评价对ror2的结合亲和力的一种方法是通过elisa。评估配体(例如抗体)朝向靶标的结合能力的其他标准测定法是本领域已知的，包括例如蛋白质印迹、ria和流式细胞术分析。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评定，例如表面等离振子共振，例如通过biacore^tm系统分析来评定。

本发明的抗体与其靶标的结合亲和力可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过表面等离振子共振来测量。表面等离振子共振的一种类型是biacore。优选地，本发明的抗体对ror2的结合亲和力为1nm或更小。优选地，本发明的抗体对ror2的结合亲和力为0.5nm或更小、0.1nm或更小、50pm或更小、10pm或更小、5pm或更小、或2pm或更小。

可以进行竞争性结合测定，其中将抗体与靶标的结合与通过靶标的另一已知配体(例如另一抗体)与靶标的结合进行比较。发生50％抑制的浓度称为ki。在理想条件下，ki等于kd。ki值永远不会小于kd，因此可以方便地替代测量ki来提供kd的上限。

本发明的抗体可以与ror2特异性结合。“特异性结合”意指抗体与ror2结合的亲和力大于抗体与其他靶标结合的亲和力。本发明的抗体优选能够以是其与另一非靶标分子结合的亲和力的至少两倍、10倍、50倍、100倍或比其与另一非靶标分子结合的亲和力更大的亲和力与其靶标结合。

在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至seqidno:5内的表位或与seqidno:5具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列内的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至seqidno:7内的表位或与seqidno:7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列内的表位。

在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的胞外部分。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的胞外部分的结构域。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的ig结构域、crd或kringle结构域。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的crd。

在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的胞外部分内的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的胞外部分的结构域内的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的ig结构域、crd或kringle结构域内的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至ror2的crd内的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至seqidno:10的氨基酸序列内的表位或与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列内的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至seqidno:12内的表位或与seqidno:10具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列内的表位。

在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至氨基酸序列由包含seqidno:11的核苷酸序列的或与seqidno:11具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的核苷酸序列或氨基酸序列的多核苷酸编码的表位。在一个实施方式中，本发明的抗ror2抗体结合至氨基酸序列由包含seqidno:13的核苷酸序列或与seqidno:13具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的核苷酸序列或氨基酸序列的多核苷酸编码的表位。表位序列可包含seqidno:5、7、10或12的5-30、5-25、5-20、5-15或5-10个连续氨基酸。

本发明的抗ror2抗体可以结合至长度为5-30、5-25、5-20、5-15或5-10个氨基酸的表位序列。例如，本发明的抗ror2抗体可以结合至长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的表位序列。

如本文所用，术语“表位”通常是指靶标抗原上被免疫受体(例如抗体)识别的位点。优选地，表位是衍生自蛋白质或作为蛋白质的一部分的短肽。表位可以由肽的氨基酸和相应的dna序列的知识、以及由特定的氨基酸的性质(例如大小、电荷等)和密码子词典来鉴定，而无需过度实验。例如参见ivanroitt,essentialimmunology,1988；janiskuby,immunology,1992e.g.,pp.79-81。

表位的位置可以通过常规方法来鉴定。例如，可以通过评估抗体结合至不同片段或变体ror2多肽的能力来确定表位的一般位置。也可以使用常规方法来确定ror2内的与抗体接触的特定的氨基酸。例如，可以使抗体与靶标分子结合然后抗体/靶标复合物可以结晶。可以确定复合物的晶体结构，并用于识别抗体与其靶标之间相互作用的特定位点。

本发明的抗体与本发明的另一抗体一样可以结合至相同的表位或区域。例如，在已知本发明的一种抗体的情况下，本发明的其他抗体可以通过比较其与ror2的结合和已知抗体与ror2的结合来鉴定。

本发明的抗体可以包含重链和/或轻链。

如本文所述，本发明的抗体可以具有与本发明的另一抗体交叉竞争以结合至ror2的能力。这种交叉竞争的抗体可以基于其在标准结合测定中与本发明的已知抗体交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以使用biacore分析、elisa分析或流式细胞术来证明交叉竞争。这种交叉竞争可能表明两种抗体结合至相同或相似的表位。

因此，本发明的抗体可以通过包括结合测定的方法来鉴定，该结合测定评估测试抗体是否能够与本发明的已知抗体针对靶标分子上的结合位点进行交叉竞争。进行竞争性结合测定的方法是本领域众所周知的。例如，该方法可以涉及在抗体可以结合至靶标分子的条件下使本发明的已知抗体与靶标分子接触在一起。然后可以使抗体/靶标复合物与测试抗体接触，并且可以评估测试抗体能够从抗体/靶标复合物中置换本发明的抗体的程度。一种替代方法可以涉及在允许抗体结合的条件下使测试抗体与靶标分子接触，然后加入能够结合该靶标分子的本发明抗体，并评估本发明的抗体能够从抗体/靶标复合物中置换测试抗体的程度。

测试抗体抑制本发明的抗体与靶标结合的能力证明了测试化合物可以与本发明的抗体竞争与靶标的结合，因此，测试抗体与本发明的已知抗体一样结合至ror2蛋白上的相同的表位或区域。在这种方法中被鉴定为与本发明的已知抗体交叉竞争的测试抗体也是根据本发明的潜在抗体。测试抗体可以在与本发明的已知抗体一样结合ror2的相同的区域并且与本发明的已知抗体交叉竞争的事实表明该测试抗体可以在与已知抗体相同的结合位点处充当配体，并且测试抗体可以因此模仿已知抗体的作用。

本发明的已知抗体可以是如本文所述的抗体，例如如本文所述的ror2抗体之一或如本文所述的保留与ror2结合的能力的其任何变体或片段。本发明的抗体可以结合至与如本文所述的抗体中的一种或多种抗体或如本文所述的保留与ror2结合的能力的其任何变体或片段相同的表位。

可以参考抗体与不是靶标的分子的结合来评估特异性结合。可以通过比较抗体与靶标结合和与另一分子结合的能力来进行该比较。该比较可以如上所述在对kd或ki的评估中进行。在这种比较中使用的其他分子可以是任何并非是靶标分子的分子。优选地，另一分子与靶标分子不相同。优选地，靶标分子不是靶标分子的片段。

本文所指的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(κ)(l)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(heavychainvariableregion，本文缩写为vh)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(lightchainvariableregion，本文缩写为vl)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。vh区和vl区可以进一步细分为高度可变区，称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)，其被更加保守的称为构架区(frameworkregion，fr)的区域分隔开。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。

本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是单克隆抗体。多克隆抗体是衍生自不同的b细胞系的抗体。多克隆抗体可包含针对特定抗原的不同的免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗体可包含结合至抗原分子内的一个或多个不同的表位的不同的免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗体可以通过常规方法例如用目标抗原进行免疫而产生。例如，可以用人ror2使能够表达人抗体序列的小鼠免疫。随后可以除去血液并纯化ig级分。

单克隆抗体是彼此相同并且对特定表位具有单一结合特异性和亲和力的免疫球蛋白分子。本发明的单克隆抗体(monoclonalantibody，mab)可以通过多种技术产生，该技术包括常规的单克隆抗体方法，例如在“monoclonalantibodies；amanualoftechniques”,hzola(crcpress,1988)和在“monoclonalhybridomaantibodies:techniquesandapplication”,sgrhurrell(crcpress,1982)中公开的那些方法。

本发明的抗ror2抗体可以是鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼科抗体(例如美洲驼抗体)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

抗体的术语“抗原结合部分”是指保留与抗原如ror2特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示出，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括fab片段、f(ab')2片段、fab’片段、fd片段、fv片段、dab片段以及分离的互补决定区(cdr)。单链抗体(比如scfv)和重链抗体(比如vhh和骆驼抗体)也意在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且可以以与完整抗体相同的方式对片段进行效用筛选。

可以通过例如标准elisa或蛋白质印迹法来测试本发明的抗体与靶标蛋白的结合。elisa测定还可用于筛选与靶标蛋白呈阳性反应性的杂交瘤。抗体的结合特异性也可以通过监测抗体与表达靶标蛋白的细胞的结合来确定，例如通过流式细胞术。

通过确定抗体是否与其他蛋白质结合，可以进一步研究本发明的抗体对靶标蛋白的特异性。例如，在需要产生特异性结合ror2或特定部分(例如ror2的表位)的抗体的情况下，可以通过确定抗体是否还与缺少目标部分的ror2的其他分子或修饰形式结合来评估抗体的特异性。

一旦识别并选择了合适的抗体，就可以通过本领域已知的方法来鉴定抗体的氨基酸序列。可以使用简并引物来克隆编码抗体的基因。可以通过常规方法来重组产生抗体。

本文使用的“多肽”的最广泛的意义是指具有两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其他拟肽的化合物。因此，术语“多肽”包括短的肽序列以及较长的多肽和蛋白质。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然氨基酸和/或非天然氨基酸或合成氨基酸，包括甘氨酸和d或l旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。

分离的细胞

本发明还提供分离的细胞，该分离的细胞包含本发明的ror2抑制剂、寡核苷酸、sirna和/或载体。本发明还涉及这种分离的细胞在治疗和/或预防软骨缺失和/或治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解中的治疗用途。

本文还描述了ror2抑制剂在增强自体细胞制剂在体内产生软骨的能力的方法中的用途。

因此，在一个方面，本发明提供一种用于增强细胞产生软骨的能力的方法。在一个实施方式中，该方法是体外方法。在一个实施方式中，该方法是离体法。在一个实施方式中，体外方法增强了向患者施用后细胞产生软骨的能力。

本发明的细胞或可以在本发明的方法中使用的细胞可以选自由以下组成的组：分化细胞、非分化细胞(例如干细胞，比如多潜能干细胞、多能干细胞、诱导性多潜能干细胞、间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc))。在一个实施方式中，本发明的细胞是msc。msc可以是浓缩msc。通过使msc与一种或多种生长因子或分化因子接触可以刺激msc分化成浓缩干细胞，所述一种或多种生长因子或分化因子如一种或多种选自由以下组成的组的因子：骨形态发生蛋白-5a(bonemorphogeneticprotein-5a，bmp-5a)、bmp-5b、纤维母细胞生长因子-4(fibroblastgrowthfactor-4，fgf-4)、fgf-8、fgf-10、碱性fgf、n-钙粘着蛋白(n-cadherin)、神经细胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule，ncam)、基底膜聚糖(perlecan)、转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，tgf-β1)、tgf-β2和多功能蛋白聚糖(veriscan)。

在一个实施方式中，本发明的细胞是软骨细胞。软骨细胞是在软骨中发现的产生并维持软骨基质的细胞。通过使浓缩msc与一种或多种生长因子或分化因子接触，可以刺激浓缩msc分化成软骨细胞，该一种或多种生长因子或分化因子如一种或多种选自由以下组成的组的因子：bmp-2、bmp-4、bmp-5、bmp-7、生长分化因子-5(growthdifferentiationfactor-5，gdf-5)/bmp-14、碱性fgf、胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor，igf-1)、tgf-β1和tgf-β2。

药物组合物

本发明还提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的ror2抑制剂、本发明的sirna、本发明的载体或本发明的分离的细胞。药物组合物通常还将包含药学上可接受的运载体或赋形剂。可以对药物组合物进行配制以帮助该药物组合物与其预期的施用途径相容。

在本发明中可以采用并且在一些情况下可以采用的施用途径的例子包括肠胃外施用，例如关节内施用、静脉内施用、真皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、肌肉内施用、口服(例如吸入)施用、透皮(局部)施用、透粘膜施用可以采用。本发明的药物组合物、ror2抑制剂、寡核苷酸、抗ror2抗体、sirna、载体或分离的细胞可以例如通过这些途径递送。可以对本发明的药物组合物进行配制以帮助与任何前述施用途径相容。用于递送本发明的药物组合物、ror2抑制剂、寡核苷酸、抗ror2抗体、sirna、载体或分离的细胞的优选途径是经由关节内施用。在一个实施方式中，关节内施用是经由关节内注射或输注(也称为关节注射或输注)。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物、ror2抑制剂、寡核苷酸、抗ror2抗体、sirna、载体或分离的细胞是通过缓释植入物来进行关节内递送的。当患者患有软骨缺失或膝关节的相关病症、例如骨关节炎时，可以将缓释植入物植入患者膝盖的髌下脂垫中。在一个实施方式中，缓释植入物配置为控制关节内递送的本发明的ror2抑制剂、寡核苷酸、抗ror2抗体、sirna、载体或分离的细胞的释放速率。缓释植入物可包含载体部分以封装本发明的ror2抑制剂、寡核苷酸、抗ror2抗体、sirna、载体或分离的细胞。在一实施方式中，载体部分包含胶原蛋白。

例如，包括特别是用于肠胃外应用、皮内应用、皮下应用或关节内应用的溶液或悬浮液的本发明的药物组合物可以包括以下成分：无菌稀释剂，例如注射用水、含盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。在一些情况下，可能的赋形剂可以选自水、盐溶液、酒精、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。组合物的ph可以用酸(例如盐酸)或碱(例如氢氧化钠)来调节。该组合物、例如用于肠胃外制剂的组合物可以被封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在优选的情况下，本发明的组合物具有生理ph。

适用于注射用途的药物组合物、例如适用于在关节内注射中使用的药物组合物包括无菌水溶液(当为水溶性时)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于合适的运载体，可以包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(cremophorel；tm；basf，帕西波尼，n.j)或磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufferedsaline，pbs)。该组合物通常将是无菌的。

如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。该运载体可适用于肠胃外施用，例如关节内施用、静脉内施用、肌肉内施用或皮下施用(例如，通过注射或输注)。该运载体可特别适用于关节内施用。取决于施用途径，可以将本发明的抗ror2抗体包被在材料中，以保护抗体免受可能使抗体失活或变性的酸和其他自然条件的作用。

优选的药学上可接受的运载体包括水性载体或稀释剂。可以在本发明的药物组合物中采用的合适的水性载体的例子包括水、缓冲水和盐水。其他运载体的例子包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选的将是在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(比如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。

本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序且通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。可能还期望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射药物形式的吸收延长。

典型地，治疗性组合物在生产和储存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。

根据需要，可以通过将所需量的活性剂(例如抗体)掺入适当的含有上面所列的成分中的一种或其组合的溶剂中，然后微量过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散体是通过将活性剂掺入含有基本分散介质和上述所列的需要的其他成分的无菌溶媒来制备的。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这两种方法从其先前的无菌过滤溶液中得到活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。

本发明的药物组合物可以包含一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞。本发明的药物组合物可以包含另外的活性成分以及一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞。本发明的药物组合物还可以包含另外的治疗剂或预防剂。另外的治疗剂或预防剂可用于治疗或预防骨关节炎和/或促进软骨修复和/或治疗或预防与骨关节炎相关的疼痛。

包含本发明的寡核苷酸的药物组合物包括寡核苷酸的任何药学上可接受的盐、酯或这些酯的盐。在某些情况下，本发明的组合物可以包括超过一种的本发明的针对ror2的寡核苷酸。因此，例如，本公开还涉及药学上可接受的盐、前药、这些前药的药学上可接受的盐，并且也可以采用其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。前药可例如包括在寡聚化合物的一端或两端上并入另外的核苷，该寡聚化合物在体内被内源核酸酶切割，以形成活性寡核苷酸。

施用可以，例如，通过吸入来进行。例如，全身性施用可以通过透粘膜或透皮方式。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，例如可以将寡核苷酸配制成透皮的贴剂或膏药、油膏、药膏、凝胶或乳膏。寡核苷酸可以，例如以栓剂或保留灌肠剂的形式来制备。在一些情况下，寡核苷酸可以与保护化合物免于从体内快速清除的运载体(例如控释剂，包括植入物和微囊递送系统)一起配制。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。

在一个实施方式中，药物组合物可以以单位剂型配制。在一些实施方式中，可以将组合物配制成安瓿。药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包裹或分配器中。

本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括向对象施用以治疗骨关节炎和/或促进软骨修复和/或治疗与骨关节炎相关的疼痛的一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞，以及任选的说明书，优选地这种试剂盒具有以本发明的药物组合物的形式提供的一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞。该试剂盒还可以包括用于施用一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞或药物组合物的工具，例如注射器或其他适当的递送装置。试剂盒可包括本文讨论的任何递送工具。在一种情况下，试剂盒还包含脂质体转染试剂(lipofectin)和尤其是用脂质体转染试剂配制的本发明的寡核苷酸。试剂盒可包含本发明的ror2抑制剂、寡核苷酸、sirna、载体以及缓释植入物，例如包含含有去端肽胶原的运载体部分的缓释植入物。

要施用的本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞的剂量将取决于进行的特定方法或递送途径，以及在将其施用于对象时疾病的性质、对象的状况、特定制剂以及施用途径。本发明的寡核苷酸的细胞内浓度的例子包括约0.005至50μm、或更优选为0.02μm至5μm的浓度。为了对诸如人的对象施用，可以采用约0.001mg/kg至50mg/kg、优选地0.01mg/kg至10mg/kg、以及更优选地0.1mg/kg至5mg/kg的日剂量。技术人员、尤其是适当的医师将能够确定适当的剂量，例如考虑诸如年龄、性别、体重等因素。

可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次剂量，可以随时间施用若干个分次剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。如本文所用，单位剂型是指适合作为待治疗对象的单位剂量的物理上离散的单元；每个单元包含经计算与所需的药物运载体联合产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。

可以以单次剂量或多次剂量施用。可以经由相同或不同的途径并在相同或不同的位置施用多次剂量。可替代地，可以经由持续释放剂用药，在这种情况下，需要较不频繁地施用。剂量和频率可以根据在一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞的对象中的半衰期以及所需的治疗时间而变化。

治疗方法以及诊断或预测方法

本发明还提供一种治疗和/或预防软骨缺失、治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复或预防软骨降解的方法，该方法包括向有此需要的对象施用一种或多种本发明的ror2抑制剂、sirna、载体或分离的细胞。

另外，本发明提供了用于对对象治疗和/或预防软骨缺失、治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复或预防软骨降解的ror2抑制剂，其中该抑制剂是抗ror2抗体或其片段或针对ror2的寡核苷酸。

本发明还提供一种诊断患有软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的对象的方法，该方法包括步骤：确定先前从对象获得的样品中的ror2的表达水平和/或活性。本发明还提供一种用于预测对象对软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨的易感性增加的方法，该方法包括步骤：(i)确定先前从对象获得的样品中的ror2的表达水平和/或活性。

在一些实施方式中，对象可以是人类对象。在一些实施方式中，对象可以是非人类对象。该对象可以先前已经被诊断为患有软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解。该对象可以有发展为软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的风险，例如，先前可能已确定该对象携带遗传标志物，该遗传标记表明该对象具有较高的发展软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的风险。该对象可以被怀疑患有oa。该对象可以正在接受软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的治疗。例如，该对象可以正在用一种或多种ror2抑制剂、例如本发明的ror2抑制剂进行治疗。该对象可以已经遭受了损伤或创伤，或者已经进行了外科手术，使对象处于发展为软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的较高风险中。例如，对象可能先前已经进行过手术，以治疗前交叉韧带(anteriorcruciateligament，acl)损伤或膝盖半月板损伤，例如撕裂。该对象可以是老年对象。例如，该对象可以为至少40岁、至少45岁、至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁、至少80岁、至少85岁、至少90岁、或至少95岁。该对象可以是女性对象。

在一个实施方式中，该对象可以是女性。

该对象可能对用于治疗和/或预防软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的其他方法或组合物无反应。例如，对象可能对用nsaid或阿片类镇痛药的治疗无反应。

在一个实施方式中，本发明的方法治疗改善了oa相关的疼痛。通常使用自填问卷来测量和监控疼痛，自填问卷例如womac、ikdc、lysholm、koos、牛津膝关节评分(oxfordkneescore)和类似的验证评分系统(collinsetal.(2015)arthritiscareres(hoboken).2011nov；63(011):s208–s228.)。这种评分系统通过若干子评分来评估疼痛和功能。还可以使用更多以疼痛为重点的评分系统来分离疼痛的不同组成，例如异常性疼痛或中枢敏化引起的负重疼痛(例如paindetectands-lanss；moretonetal.(2015)arthritiscare&researchvolume67,issue4,pages519–528,april2015)。功能测试，例如baerti,etal.kneesurgery,sportstraumatology,arthroscopy,2014中所述的“起立行走(timed“up&go”)”或“登楼梯测试(stairclimbingtest)”。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。

实施例

实施例1-材料和方法

过表达和sirna转染

根据生产商的说明，使用jetprime转染试剂(polyplus)在完全dmem中使用sirna(终浓度为20nm)敲除人和小鼠ror2。鸟嘌呤-胞嘧啶(guanine–cytosine，gc)含量中等的stealthrnai阴性对照双链体(lifetechnologies)或与靶标sirna含有相同含量的gc的乱序序列用作阴性对照。

微团培养与阿尔辛蓝染色

将细胞以1×10⁷个细胞/ml的密度重悬于完全培养基中，并通过将15μl细胞悬液移入24孔板中的每个孔来获得微团培养物。使细胞附着3h，然后添加1ml完全培养基(必要时，进行刺激)。将微团培养3天。收集微团用于rt-pcr基因表达分析或固定，并用阿尔辛蓝染色整装。如前所述进行阿尔辛蓝提取和定量。在室温下用徕卡显微镜采集图像。

super8xtopflash测定

使用jetprime转染试剂(polyplus)将super8xtopflashtcf/lef-萤火虫荧光素酶报告基因质粒和cmv-renilla荧光素酶质粒进行共转染。将细胞刺激24小时，然后使用双荧光素酶报告基因测定系统(promega)测量荧光素酶活性。

验证实验

关节内注射去端肽胶原-sirna。5或7天后杀死小鼠；对股骨髁进行组织学处理，取半月板和胫骨生长板之间的所有组织进行蛋白质印迹。

组织学分析和oa评分

如其他地方所述，进行组织学处理和组织形态计量学分析。所有图像均使用相同的设置在奥林巴斯显微镜上拍摄。排除用于组织形态计量学分析的完整切片＜3个的小鼠(每组1个)。使用grubb的测试识别对照组中的一只小鼠的r异常值(p＝0.04137；grubbs,1950,1969))，并在分析中删除该小鼠，因为它没有发展oa。

统计分析

将参数数据与t检验进行比较，将非参数数据与wilcoxon–mann–whitney检验进行比较。对于多重比较，使用了方差分析或秩和检验(kruskal–wallistest)，包括适当的事后检验。p值＜0.05被认为是显著的：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。

实施例2-ror2在正常软骨中是不可检测到的，在骨关节炎中上调

在处于18.5dpc阶段的小鼠胚胎中的关节软骨的最靠表面的软骨层中检测ror2(图1a)。在产后，在静息状态通过免疫荧光检测不到ror2，然而，在通过关节去稳定引发骨关节炎后1周，在关节软骨的上部1/3部分处可检测到ror2(图1b)。为了确认人中的ror2在人类中的表达，我们比较了获得自进行全关节置换的受试者对象的关节软骨的严重受损的部位区域和相对保持的区域部位。ror2在保持的软骨部位区域中几乎检测不到但在具有高度软骨损伤的区域中始终存在。还通过蛋白质印迹法确认了人软骨和滑膜中的ror2表达(图1c和d)。

实施例3-ror2过表达抑制软骨细胞分化

为了研究ror2的水平是否影响软骨细胞分化程度，我们对间充质细胞系进行了功能获得研究。首先，为了验证ror2哺乳动物表达质粒的活性，我们确认了，与之前的文献一致，ror2在hek293细胞中的过表达抑制wnt3a激活典型的wnt信号转导的能力，如由荧光素酶报告测定评估的。如预期的，与wnt-5a的共刺激增强ror2抑制wnt-3a诱导的wnt信号转导的激活的能力(图2a)。在间充质细胞系mc3h10t1/2中确认了ror2过表达的wnt抑制作用(图2b)。ror2过表达不抑制gsk3β-抑制剂bio激活wnt信号转导的能力，由此表明该抑制作用处于gsk3β的上游(图2c)。

然后我们测试了ror2过表达是否调节mc3h10t1/2细胞响应于骨形态生成蛋白2(bmp-2)而进行分化的能力(denker等，1999)。如预期的，bmp-2引起mc3h10t1/2的快速软骨细胞快速分化，如通过阿利新蓝(alcianblue)染色评估的。ror2过表达抑制mc3h10t1/2细胞响应于bmp-2的软骨形成分化(图2d)以及软骨细胞分化标志物col2a1，、acan和erg的表达(图2e)。ror2过表达还使上调增殖标志物pcna上调(图2f)。

实施例4-ror2功能丧失支持软骨细胞分化

到目前的数据表明oa和炎性细胞因子引起ror2的上调并且ror2依赖性信号转导抑制软骨细胞分化。因此我们测试了ror2功能丧失是否导致软骨合成代谢。我们设计了sirna，其在体外在蛋白水平使ror2表达沉默约73％(图3a)。我们还设计了shrna-慢病毒，其使ror2mrna下调92％，蛋白下调56％(图3b和c)。ror1的表达没有改变，这证明了rna干扰的特异性(图3b)。如预期的，间充质细胞系mc3h10t1/2响应于bmp-2而向软骨形成分化。不论使用sirna还是shrna-慢病毒，即使是在没有bmp-2的情况下，ror2沉默也足以驱动mc3h10t1/2细胞的软骨细胞分化，即使是在没有bmp-2的情况下，如通过阿利新蓝染色(图3d和e)和acanmrna表达(图3f)评估的。此外，ror2沉默强烈地抑制关键软骨降解酶adamts-4和adamts-5的表达(图3g)。有趣的是，ror2沉默并不导致借助wnt-3a的荧光素酶报告物激活的增加(图3h)。

实施例5-ror2体内沉默导致骨关节炎症状和结构特征的改善

ror2阻断的合成代谢作用和关键的分解代谢酶的抑制促使我们测试ror2功能丧失是否可能对oa有益。在体内，用传统疗法和大分子难以靶向软骨细胞，因为软骨是无血管的，并且软骨细胞被包裹在密集的、带强负电荷的胞外基质中。为了使用临床相关的而且有效的技术来阻断ror2，我们将sirna与去端肽胶原结合使用。在一组验证实验中，我们建立了7μl的与0.5％去端肽胶原缀合的20μmror2sirna(或乱序对照)关节内注射，在长达5天的时间内实现ror2蛋白表达降低～50％(图4a)。重要的是，该沉默效率足以使ror2靶标基因ctgf下调～60％(图4b)。

作为不稳定性诱发的骨关节炎的模型，我们对骨骼成熟小鼠的内侧半月板前角和内侧副韧带进行了手术切除(也称为半月板韧带损伤；以下简称mli)。对侧肢体进行了假手术。手术后四周(当已经建立软骨和骨病变时)，每5天，小鼠中有一半接受双侧关节内注射去端肽胶原-ror2-sirna注射(治疗组)，另一半接受去端肽胶原-乱序-sirna注射(对照组)(每组n＝6)。手术后第六周，如使用linton无行为能力测定仪(lintonincapacitancemeter)进行评估的，对照组的小鼠在负重方面表现出疼痛。在最初的无行为能力的趋势后，治疗组中的小鼠在六周时恢复到每个后肢负重50％，这表明负重时无疼痛感(图4c-治疗的第13天)。

oa与软骨下骨的实质性硬化以及在称为骨赘的关节表面的两侧形成新的骨骼有关。如通过骨体积/组织体积(bonevolume/tissuevolume，bv/tv)比测量的，ror2沉默与软骨下骨硬化的正常化有关(图4d)。番红o染色强度的组织形态计量学分析揭示出治疗组中gag保留显著增加/降解显著减少(图4e)。番红o的强度与功能丧失密切相关，这表明结构改善和症状改善之间存在联系(图4f)。

实施例6-ror2沉默支持人软骨类器官的体内形成

将来自小鼠模型的数据转换到人类中的一个问题是跨物种的分子通路的保守程度。为了验证ror2作为人软骨中的治疗靶标，我们采用了一种过继模型(adoptivemodel)，其中异位植入裸鼠的人软骨细胞生成了表型稳定、抗血管形成和软骨内骨形成的软骨类器官。通过用编码ror2特异性shrna或乱序序列的慢病毒转导软骨细胞作为对照，实现了ror2阻断。用ror2shrna转导的人关节软骨细胞比对照具有更高的gag含量(图5)。该发现证实了ror2阻断足以支持人软骨细胞中的体内软骨分化。

以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。

在不脱离本发明的范围和精神的前提下，本发明的所述方面的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。

尽管已经结合特定的优选实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这种特定的实施例。实际上，对分子生物学、细胞生物学、免疫学或相关领域的技术人员来说显而易见的对用于实施本发明的所述模式的各种修改都旨在包括在所附权利要求的范围内。

序列表

<110>伦敦玛丽王后大学

<120>ror2抑制剂及其在治疗和/或预防软骨缺失中的用途

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<212>prt

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<220>

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151015

leuleuleuleuleuleuleuleuleu

2025

<210>10

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<212>prt

<213>智人

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151015

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405

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<212>dna

<213>智人

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<212>prt

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