用于基因编辑的Cpf1-相关方法和组合物与流程

相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月11日提交的美国临时申请序列号62/597,118、2018年1月29提交的美国临时申请序列号62/623,501、2018年4月30日提交的美国临时申请序列号62/664,905、以及2018年10月16日提交的美国临时申请序列号62/746,494的优先权，对其中的每一个要求优先权并将其各自的内容以其全文结合在此。序列表本说明书进一步通过引用而结合于2018年12月11日经由efs在此提交的序列表。依照37c.f.r.§1.52(e)(5)，本序列表文本文件标识为0841770210sl.txt，为444,032字节并创建于2018年12月11日。将序列表的整个内容通过引用特此并入。本序列表并未延伸超出本说明书的范围，并且因此不含有新问题。本披露涉及用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列的表达的crispr/cpf1相关方法和组分，以及用于评估这样的编辑和/或表达的调节的方法和组合物。
背景技术：
：crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)在细菌和古核生物中作为适应性免疫系统进化，以防御病毒攻击。在暴露于病毒后，病毒dna的短区段被整合进crispr基因座中。rna是从包括病毒序列的crispr基因座的一部分转录。所述rna含有与病毒基因组互补的序列，介导将cpf1蛋白靶向病毒基因组中的靶序列。cpf1蛋白(“来自普雷沃菌属(prevotella)和弗朗西斯菌属(franciscella)1的crispr”)又称为cas12a，其又裂解病毒靶标并且由此使所述靶标沉默。最近，crispr/cpf1系统已经改适以用于在真核细胞中进行基因组编辑。位点特异性双链断裂(dsb)的引入允许通过内源dna修复机制(例如非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr))改变靶序列。技术实现要素：本披露提供了用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列表达的改进的crispr/cpf1相关方法和组分，例如，在治疗上相关的细胞系中和关于治疗上相关的靶序列中，以及用于评估这样的靶标编辑和/或表达调节的效率的策略。在一方面，本披露涉及crispr/cpf1介导的治疗上相关的靶位点的编辑在治疗上相关的细胞群中的用途。例如，但并非进行限制，本披露提供了包括治疗上相关的靶位点的修饰的分离细胞。在某些实施例中，所述细胞是t细胞，例如，cd8+t细胞、cd8+天然t细胞、cd4+中枢记忆t细胞、cd8+中枢记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+t细胞、cd4+干细胞记忆t细胞、cd8+干细胞记忆t细胞、cd4+辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4+天然t细胞、th17cd4+t细胞、th1cd4+t细胞、th2cd4+t细胞、th9cd4+t细胞、cd4+foxp3+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞或cd4+cd25+cd127-foxp3+t细胞。在某些实施例中，所述细胞是淋巴样祖细胞、造血干细胞(hsc)、人脐带血来源的红系祖(hudep)细胞、自然杀伤细胞或树突细胞。在某些实施例中，所述细胞是hsc或hudep细胞。在某些实施例中，本披露提供了一种包括修饰，例如破坏(例如在hbg基因座中由包含cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因座(例如，包括hbg基因的调控区)的grna分子的rnp复合物的递送产生)的分离的细胞或细胞群。在某些实施例中，rnp复合物包括cpf1rna指导的核酸酶和grna分子之间的复合物。在某些实施例中，可以靶向hbg基因座的任何区域。在某些实施例中，靶向hbg基因的顺式调控区。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1介导的hbg基因座的启动子区的编辑(例如破坏)的用途。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1介导的hbg基因座的-800至-60nt启动子区(例如-110nt启动子区)的编辑的用途。在某些实施例中，可以编辑(例如破坏)hbg基因座的顺式调控区。例如，但并非进行限制，crispr/cpf1介导的编辑可用于破坏hbg基因座的顺式调控区中存在的caat盒。hbg启动子区的普遍性破坏和caat盒的特异性破坏可以经由靶向那些序列的crispr/cpf1编辑系统的递送来实现。用于这样的crispr/cpf1编辑系统(靶向hbg基因座的那些序列)中使用的grna分子的非限制性实例，在图6、9和11和表19中进行了鉴定。在某些实施例中，靶向hbg基因序列的grna分子包含grna分子的序列，称为hbg1-1。在某些实施例中，本披露涉及分离的crispr/cpf1编辑的细胞，其中hbg基因座的-110nt启动子区使用复合物进行了破坏，所述复合物包含crispr/cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因座的-110nt启动子区的指导rna。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞可以包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞不包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合用于检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞群，其中hbg基因座的-110nt启动子区使用复合物进行了破坏，所述复合物包含crispr/cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因座的-110nt启动子区的指导rna。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞群可以包括包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分的细胞。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑细胞群不包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合用于检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞，其中hbg启动子区中存在的caat盒使用复合物进行了破坏，所述复合物包含crispr/cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因座的启动子区中存在的caat盒的指导rna。在某些实施例中，这样的细胞包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞不包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合用于检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞群，其中hbg启动子区中存在的caat盒使用复合物进行了破坏，所述复合物包含crispr/cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因座的启动子区中存在的caat盒的指导rna。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞群可以包括包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分的细胞。在某些实施例中，本披露提供了一种crispr/cpf1编辑的细胞或使用包括修饰，例如破坏(例如在特异性表达转录抑制因子bcl11a的红系细胞中由包含cpf1rna指导的核酸酶和靶向bcl11a基因序列的grna分子的复合物的递送产生)的crispr/cpf1编辑的细胞群。在某些实施例中，可以靶向bcl11a基因序列的任何区域。例如，但并非进行限制，可以靶向bcl11a基因的红系增强子区，例如来自转录起始位点(tss)的+55kb和+62kb之间的红系增强子区。在某些实施例中，crispr/cpf1介导的编辑可以用于破坏bcl11a的内含子2的+58dhs区中存在的bcl11a的gata1结合基序。bcl11a的gata1结合基序的破坏可以经由靶向所述基序的crispr/cpf1编辑系统的递送来实现。用于这样的crispr/cpf1编辑系统(靶向bcl11a的gata1基序)中使用的grna分子的非限制性实例在图7、10和12中进行了鉴定。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞，其中bcl11a基因内含子2的+58dhs区被破坏。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞可以包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞群，其中bcl11a基因内含子2的+58dhs区被破坏。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞群可以包括包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分的细胞。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞，其中bcl11a基因的gata1基序被破坏。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞可以包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1编辑的细胞群，其中bcl11a基因的gata1基序被破坏。在某些实施例中，这样的crispr/cpf1编辑的细胞群可以包括包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分的细胞。在某些实施例中，使用用于检测此类组分的适合的方式未检测到用于修饰或破坏细胞或细胞群中bcl11a基因的crispr/cpf1系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露提供了一种分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在t细胞的一种或多种内源基因中的修饰(例如破坏)。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1介导的t细胞内源基因(选自由fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita、trbc及其任何组合组成的组)编辑的用途。例如，但并非进行限制，所述修饰通过包含cpf1rna指导的核酸酶和grna分子的一种或多种复合物(例如rnp复合物(其靶向fas基因序列的一部分、bid基因序列的一部分、ctla4基因序列的一部分、pdcd1基因序列的一部分、cblb基因序列的一部分、ptpn6基因序列的一部分、b2m基因序列的一部分、trac基因序列的一部分、ciita基因序列的一部分、trbc基因序列的一部分或其组合))的递送产生。例如，但并非进行限制，可以递送两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种复合物，例如rnp复合物，其中复合物中的每一种靶向不同基因。在某些实施例中，grna可以与要靶向的基因的任一链互补。在某些实施例中，grna分子可以靶向要靶向的基因的调控区、内含子或外显子。在某些实施例中，本文的披露涵盖的crispr/cpf1系统靶向例如trac基因，以生成分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在trac基因中的修饰，例如破坏。在某些实施例中，crispr系统包含与trac基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与trac基因的任一链互补。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在trac基因的编码序列内。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且trac基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，用于在靶向trac的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表2和3中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，本文的披露涵盖的crispr/cpf1系统靶向例如trbc基因，以生成分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在trbc基因中的修饰，例如破坏。在某些实施例中，crispr系统包含与trbc基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与trbc基因的任一链互补。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在trbc基因的编码序列内。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且trbc基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，用于在靶向trbc的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表4和5中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，本文的披露涵盖的crispr/cpf1系统靶向例如b2m基因，以生成分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在b2m基因中的修饰，例如破坏。在某些实施例中，crispr系统包含与b2m基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与b2m基因的任一链互补。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在b2m基因的编码序列内。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且b2m基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，用于在靶向b2m的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表6、7和8中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，用于在靶向b2m的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含核酸序列agugggggugaauucagugu。在某些实施例中，本文的披露涵盖的crispr/cpf1系统靶向例如ciita基因，以生成分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在ciita基因中的修饰，例如破坏。在某些实施例中，crispr系统包含与ciita基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与ciita基因的任一链互补。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在ciita基因的编码序列内。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且ciita基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，用于在靶向ciita的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表9中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，本文的披露涵盖的crispr/cpf1系统例如使用靶向trac、ciita、trbc和b2m基因中的两个或更多个基因的一个或多个外显子、一个或多个内含子或一个或多个调控区的grna来靶向这些基因中的两个或更多个的组合，以生成分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在trac、ciita、trbc和b2m基因中的两个或更多个基因的修饰，例如破坏。在某些实施例中，本披露的crispr/cpf1系统可以包括一种或多种复合物，所述复合物包含cpf1rna指导的核酸酶和靶向一个或多个基因(例如选自b2m、trac、ciita和trbc组成的组)的grna分子。例如，但并非进行限制，本披露的crispr/cpf1系统可以包括(a)包含第一grna(包括与第一基因的靶序列互补的第一靶向结构域)和第一cpf1rna指导的核酸酶的第一rnp复合物；和(b)包含第二grna分子(包括与第二基因的靶序列互补的第二靶向结构域)和第二cpf1rna指导的核酸酶的第二rnp复合物。在某些实施例中，第一基因和第二基因选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组。crispr/cpf1系统可以进一步包括靶向一种或多种另外的基因的另外的rnp复合物。例如，但并非进行限制，在多重化的情况下，每个rnp复合物可以含有相同的cpf1蛋白，或者每个rnp复合物可以包括不同的cpf1蛋白，例如cpf1蛋白变体。在某些实施例中，分离的细胞，例如，分离的crispr/cpf1编辑的hsc或crispr/cpf1编辑的t细胞，或此类crispr/cpf1编辑的细胞群不包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，在细胞群中小于约10％、小于约5％或小于约1％的crispr/cpf1编辑的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合的方式以检测此类组分确定的。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被编辑和/或修饰(例如具有bcl11a基因中的破坏、hbg基因座中的破坏和/或选自fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc的一个或多个基因中的破坏)。在某些实施例中，所述细胞群具有大于约15％的编辑、大于约20％的编辑、大于约25％的编辑、大于约30％的编辑、大于约35％的编辑、大于约40％的编辑、大于约45％的编辑、大于约50％的编辑、大于约55％的编辑或大于约60％的编辑。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞具有有效的indel。在另一方面，本披露涉及修饰的cpf1蛋白及其在用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列的表达的crispr/cpf1相关方法中的用途。本披露进一步提供了编码修饰的cpf1蛋白的核酸。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白来源于选自由以下组成的组的cpf1蛋白：氨基酸球菌属物种(acidaminococcussp.)菌株bv3l6cpf1蛋白(ascpf1)、弗朗西斯菌(francisellanovicida)u112(fncpf1)、牛莫拉氏菌(moraxellabovoculi)237(mbcpf1)、candidatusmethanomethylphilusalvusmx1201(cmacpf1)、sneatiaamnii(sacpfq)、腔隙莫拉菌(moraxellalacunata)(mlcpf1)、牛莫拉氏菌aax08_00205(mb2cpf1)、牛莫拉氏菌aax11_00205(mb3cpf1)、毛螺菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)nd2006cpf1蛋白(lbcpf1)、毛螺菌科细菌ma2020(lb5cpf1)、毛螺菌科细菌mc2017(lb4cpf1)、腕足黄杆菌(flavobacteriumbrachiophilum)fl-15(fbcpf1)、硫微螺菌属物种(thiomicrospirasp.)xs5(tscpf1)、parcubacteria菌群gw2011(pgcpf1)、候选罗斯曼菌细菌(candidatusroizmanbacteriabacterium)gw2011(crbcpf1)、候选佩莱格里尼菌科细菌(candidatusperegrinbacteriabacterium)gw2011(cpbcpf1)、丁酸弧菌属物种(btyrivibriosp.)nc3005(bscpf1)、溶纤维丁酸弧菌(butyrivibriofibrisolvens)(bfcpf1)、布氏普雷沃菌(prevotellabryantii)b14(pb2cpf1)和口腔类拟杆菌(bacteroidetesoraltaxon)274(bocpf1)(参见，例如，zetsche等人,biorxiv[生物预印本]134015；doi:https://doi.org/10.1101/134015，将其内容通过引用以其整体并入本文)。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含核定位信号(nls)。例如，但并非进行限制，此类nls序列选自由以下组成的组：核质蛋白nls(nnls)(seqidno:1)和猿猴病毒40“sv40”nls(snls)(seqidno:2)。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白的nls序列定位于cpf1蛋白序列的c末端处或定位在cpf1蛋白序列的c末端附近。例如，但并非进行限制，修饰的cpf1蛋白可以选自以下：his-ascpf1-nnls(seqidno:3)；his-ascpf1-snstaneyls(seqidno:4)；和his-ascpf1-snls-snls(seqidno:5)。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白的nls序列定位于cpf1蛋白序列的n末端处或定位在cpf1蛋白序列的n末端附近。例如，但并非进行限制，修饰的cpf1蛋白可以选自以下：his-snls-ascpf1(seqidno:6)、his-snls-snls-ascpf1(seqidno:7)和snls-snls-ascpf1(seqidno:8)。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含定位于cpf1蛋白序列的n末端和c末端两者处或定位在cpf1蛋白序列的n末端和c末端两者附近的nls序列。例如，但并非进行限制，修饰的cpf1蛋白可以选自以下：his-snls-ascpf1-snls(seqidno:9)和his-snls-snls-ascpf1-snls-snls(seqidno:10)。nls序列的同一性和n末端/c末端位置的另外的排列(例如附加两个或更多个nnls序列或nnls和snls序列(或其他nls序列)的组合以及有和没有纯化序列(例如六组氨酸序列)的序列)在本披露的主题范围内。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含cpf1蛋白序列的一个或多个半胱氨酸残基处的改变(例如，缺失或取代)。例如，但并非进行限制，修饰的cpf1蛋白包含在选自由以下组成的组的位置处的改变：c65、c205、c334、c379、c608、c674、c1025和c1248。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含一个或多个半胱氨酸残基取代丝氨酸或丙氨酸。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含选自由以下组成的组的改变：c65s、c205s、c334s、c379s、c608s、c674s、c1025s和c1248s。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含选自由以下组成的组的改变：c65a、c205a、c334a、c379a、c608a、c674a、c1025a和c1248a。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含在位置c334和c674或c334、c379和c674处的改变。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含以下改变：c334s和c674s或c334s、c379s和c674s。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含以下改变：c334a和c674a或c334a、c379a和c674a。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含一个或多个半胱氨酸残基改变以及一个或多个nls序列(例如，his-ascpf1-nnlscys-less(seqidno:11)或his-ascpf1-nnlscys-low(seqidno:12))的引入。在某些实施例中，在一个或多个半胱氨酸残基中包含缺失或取代的cpf1蛋白展现出减少的聚集。在另一方面，本披露提供了在细胞中修饰一个或多个靶序列的方法。在某些实施例中，此类方法包括使(a)与目的靶序列互补的grna分子和(b)cpf1rna指导的核酸酶与细胞或细胞群接触。在某些实施例中，在细胞或细胞群中，cpf1rna指导的核酸酶修饰目的靶序列。在某些实施例中，所述细胞是t细胞、造血干细胞(hsc)或人脐带血来源的红系祖(hudep)细胞。在某些实施例中，细胞群中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被修饰。在某些实施例中，目的靶序列是hbg1基因序列，例如启动子区，并且grna分子包括grna分子hbg1-1的序列。在某些实施例中，目的靶序列是bcl11a基因序列。可替代地，靶核酸序列选自由以下组成的组：fas基因序列的一部分、bid基因序列的一部分、ctla4基因序列的一部分、pdcd1基因序列的一部分、cblb基因序列的一部分、ptpn6基因序列的一部分、b2m基因序列的一部分、trac基因序列的一部分、ciita基因序列的一部分、trbc基因序列的一部分及其组合。本披露进一步提供了在细胞中用于修饰一个或多个，例如两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个基因的方法，所述方法包括使细胞与(a)包含第一grna(包括与第一基因的靶序列互补的第一靶向结构域)和第一cpf1rna指导的核酸酶的第一rnp复合物；和(b)包含第二grna分子(包括与第二基因的靶序列互补的第二靶向结构域)和第二cpf1rna指导的核酸酶的第二rnp复合物接触。在某些实施例中，这些方法可以进一步包括(c)包含第三grna分子(包含与第三基因的靶序列互补的第三靶向结构域)和第三cpf1rna指导的核酸酶的第三rnp复合物和/或(d)包含第四grna分子(包含与第四基因的靶序列互补的第四靶向结构域)和第四cpf1rna指导的核酸酶的第四rnp复合物。在某些实施例中，每个rnp复合物可以包含相同的cpf1蛋白，或者每个rnp复合物可以包括不同的cpf1蛋白，例如cpf1蛋白变体。在某些实施例中，用于修饰细胞中的一个或多个例如，两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个基因的方法可以包括使细胞与以下接触：(a)第一grna，所述第一grna包括与第一基因的靶序列互补的第一靶向结构域；(b)第二grna分子，所述第二grna分子包括与第二基因的靶序列互补的第二靶向结构域；以及(c)本文披露的或由编码披露的cpf1rna指导的核酸酶的核酸编码的cpf1rna指导的核酸酶。在某些实施例中，所述方法可以进一步包括(d)第三grna分子，所述第三grna分子包含与第三基因的靶序列互补的第三靶向结构域和/或(e)第四grna分子，所述第四grna分子包含与第四基因的靶序列互补的第四靶向结构域，其中，cpf1rna指导的核酸酶修饰第一基因、第二基因、第三基因和/或第四基因。在某些实施例中，第一基因、第二基因、第三基因和第四基因选自由b2m、trac、ciita和trbc基因组成的组。在某些实施例中，所述细胞是t细胞。在另一方面，本披露涉及通过向受试者施用使用本披露涵盖的crispr/cpf1系统修饰的一个或多个细胞来治疗受试者的方法。在某些实施例中，一个或多个细胞离体或在体外被修饰，然后施用给受试者。在某些实施例中，治疗受试者的方法包括使获得自受试者的细胞与crispr/cpf1系统接触，所述crispr/cpf1系统包含：(a)与靶核酸的靶序列互补的grna分子；和(b)本文披露的cpf1rna指导的核酸酶。在某些实施例中，本披露涉及一种通过向受试者施用一种或多种细胞治疗有需要的受试者的方法，所述细胞获得自供体并且在向受试者施用之前使用本披露的crispr/cpf1系统离体或在体外被基因修饰。在某些实施例中，受试者患有血红蛋白病，例如镰状细胞病或β-地中海贫血。在某些实施例中，受试者患有癌症或自身免疫性障碍。在某些实施例中，本披露进一步提供了向患有血红蛋白病的受试者施用细胞群的方法，其中所述细胞群包括由复合物的递送产生的在hbg基因序列或bcl11a基因序列中的修饰，所述复合物包含cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因序列或bcl11a基因序列的grna分子。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被修饰。在某些实施例中，所述细胞是造血干细胞(hsc)或人脐带血来源的红系祖(hudep)细胞。在另一方面，本发明提供了用于靶向目的核酸序列以生成修饰的细胞(例如crispr/cpf1编辑的细胞)的grna分子。在某些实施例中，grna分子包括与靶序列互补的第一靶向结构域，其中所述靶序列是hbg基因序列或bcl11a基因序列。图6-12和46和表19中提供了此类grna的非限制性实例。在某些实施例中，本披露提供一种包括grna分子的crispr/cpf1系统，当将所述系统引入细胞时，在与grna分子的第一靶向结构域互补的靶序列处或在与grna分子的第一靶向结构域互补的靶序列附近形成indel，和/或当将包含grna分子的crispr/cpf1系统引入细胞时，在与hbg1或hbg2启动子区的grna第一靶向结构域互补的序列中产生缺失。在某些实施例中，当将包括本披露的grna分子的crispr/cpf1系统引入细胞时导致胎儿血红蛋白的表达增加。在某些实施例中，包括本披露的grna分子的crispr/cpf1系统导致胎儿血红蛋白的表达量增加，所述量适于部分或完全减轻血红蛋白病(例如镰状细胞病或β-地中海贫血)的症状。例如，但并非进行限制，相对于bcl11a基因或hbg基因座和/或基因中未破坏的细胞或细胞群中胎儿血红蛋白的表达水平，胎儿血红蛋白的表达可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。在一些实施例中，胎儿血红蛋白的表达增加可以大于约1皮克(pg)、大于约2pg、大于约3pg、大于约4pg、大于约5pg、大于约6pg、大于约7pg、大于约8pg、大于约9pg或大于约10pg。本披露进一步提供了包括与靶序列互补的第一靶向结构域的grna分子，其中所述靶序列选自由以下组成的组：b2m基因序列的一部分、trac基因序列的一部分、ciita基因序列的一部分、trbc基因序列的一部分及其组合。表2-9中提供了此类grna的非限制性实例。本披露提供了包括本文披露的grna分子的组合物。在某些实施例中，grna分子包含表2-9和19和图6-12中披露的grna。在某些实施例中，grna靶向表18中提供的染色体位置(例如基因组坐标)。在某些实施例中，所述组合物可以进一步包括cpf1蛋白，例如，以产生rnp复合物。在某些实施例中，本披露提供了包含一种或多种rnp复合物(例如，rnp复合物的群体)的组合物，其中每种rnp复合物靶向不同的基因或基因的区域。在某些实施例中，所述组合物可用于治疗有需要的受试者，例如患有癌症、自身免疫性障碍或血红蛋白病的受试者。在另一方面，本披露涉及用于修饰靶核酸序列的基因组编辑系统。在某些实施例中，所述基因组编辑系统可以包括grna分子；和本文披露的cpf1rna指导的核酸酶。本披露进一步提供了多重基因组编辑系统，例如，用于编辑选自由以下组成的组的两个或更多个基因：b2m、trac、ciita和trbc。在另一方面，本披露涉及用于评估crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列的表达的调节的方法，以及用于实现所述方法的组分。在某些实施例中，用于评估crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列的表达的调节的方法包括在靶核酸序列方面比较测试性cpf1蛋白的活性和对照cpf1蛋白的活性。在某些实施例中，测试的cpf1蛋白包含一个或多个相对于对照(例如，野生型cpf1蛋白)的修饰。此类修饰的实例包括但不限于，一个或多个nls序列的并入，六组氨酸纯化序列的并入，以及cpf1蛋白半胱氨酸氨基酸的改变，及其组合。在某些实施例中，用于评估crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节的方法包括将关于测试性cpf1蛋白的“匹配位点”靶核酸序列的活性与对照cas9蛋白进行比较。如本文所用，匹配位点靶核酸序列包含有待被cpf1以及cas9编辑的要求，例如tttvascpf1野生型原型间隔子邻近基序(“pam”)和nggspcas9野生型pam。如上所述，测试的cpf1蛋白可以包含一个或多个相对于野生型cpf1蛋白的修饰。此类修饰的实例包括但不限于，上述修饰并入一个或多个nls序列，并入六组氨酸纯化序列，以及cpf1蛋白半胱氨酸氨基酸的改变，及其组合。在某些实施例中，本披露涉及对通过测试性crispr/cpf1基因组编辑系统与对照rna指导的核酸酶基因组编辑系统进行的crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节的比较的测定。例如，但并非进行限制，测试和对照基因组编辑系统可以相差以下方面的任何一个或多个：rna指导的核酸酶的序列；基因组编辑系统组分的来源，例如制造方法；基因组编辑系统的一种或多种组分的配制；以及引入基因组编辑系统的细胞的特性，例如细胞类型或细胞制备方法。在某些实施例中，本文描述的测定允许对测试基因组编辑系统进行质量控制分析。在某些实施例中，本披露的测定将评估crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列的表达的调节，其中所述靶标包含匹配位点序列。在某些实施例中，使用匹配位点靶核酸允许对crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列的编辑(或由另一个基于crispr的系统编辑)和/或靶核酸序列表达的调节进行测定和/或评估。在某些实施例中，使用匹配位点靶核酸允许在特定细胞类型中对crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列的编辑(或由另一个基于crispr的系统编辑)和/或靶核酸序列表达的调节进行测定和/或评估。例如，但并非进行限制，此类方法可用于在t细胞、造血干细胞(hsc，包括但不限于cd34+hsc)和人脐带血来源的红系祖细胞(hudep)还有其他细胞类型中评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节。在某些实施例中，使用匹配位点靶核酸允许关于使用的crispr/cpf1介导编辑系统的特定属性来对crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列的编辑(或由另一个基于crispr的系统编辑)和/或靶核酸序列表达的调节进行测定和/或评估。例如，但并非进行限制，此类方法可用于评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节以鉴定不同制造过程制备的cpf1rna指导的核酸酶和/或grna活性的差异。此类方法还可以鉴定不同配制品中存在的cpf1rna指导的核酸酶和/或grna的活性以及那些使用不同递送策略的活性的差异。在某些实施例中，匹配位点靶核酸序列选自由以下组成的组：匹配位点1(“ms1”；seqidno:13)，匹配位点5(“ms5”；seqidno:14)，匹配位点11(“ms11”；seqidno:15)，和匹配位点18(“ms18”；seqidno:16)。在某些实施例中，匹配位点靶核酸序列为ms5。可以使用多种策略将本披露的crispr/cpf1编辑系统递送给细胞。例如，但并非进行限制，编码crispr/cpf1编辑系统的组分的一种或多种载体(例如aav或其他病毒载体)，可以用于在细胞中诱导crispr/cpf1编辑系统的组分的表达。可替代地，包含crispr/cpf1编辑系统的各种组分的rnp复合物可以被递送到细胞中，例如，通过电穿孔或可用于递送rnp复合物到细胞中的任何其他适合的方法。在某些实施例中，脂质纳米颗粒可用于将rnp复合物递送到细胞中。附图说明附图旨在提供本披露的某些方面和实施例的说明性和示意性而非综合性的实例。图式并不旨在限制或结合于任何具体理论或模型，并且不一定按比例绘制。不限制前文，可将核酸和多肽描绘为线性序列，或描绘为示意性二维或三维结构；这些描绘旨在具有说明性，而不是限制或束缚于关于其结构的任何具体模型或理论。图1提供了工程化的cpf1变体如何扩展pam靶向空间的汇总。图2提供了来自kleinstiver等人,naturebiotechnology[自然生物技术],34(8):869-742016年8月(ms1、ms5、ms11和ms18)的四个匹配位点的序列和用于在评估与那些匹配位点靶序列有关的cpf1和cas9的性能中使用的细胞类型的汇总。图3a-3b描述了在两个匹配位点基因座(ms1和ms5)处比较cpf1/grnarnp与cas9/grnarnp的浓度增加的剂量反应实验结果(图3a)，以及比较ascpf1和spcas9在匹配位点靶标ms1、ms5、ms11和ms18上的活性的测定结果，其中，cpf1比cas9更有效地编辑某些靶位点(图3b)。图4描绘了在固定的4.4μmrnp剂量下跨多个细胞类型的各种ascpf1nls变体与匹配位点5指导物的比较。数据被归一化为针对每种细胞类型显示最大编辑的变体。图5a-5b描绘了在4.4μmrnp剂量下两种最佳ascpf1nls变体与靶向原代t细胞中trac基因座的指导rnagwed545的比较(图5a)，以及在4.4μmrnp剂量下his-ascpf1-snls-snls变体与靶向原代t细胞中trac基因座的指导rnab2m-12的比较(图5b)。在这两种情况下，数据被归一化为显示最大编辑的变体。图6描绘了hsc和hudep中hbg1测定中使用的grna序列。图7描绘了hsc和hudep中bcl11a测定中使用的grna序列。图8描绘了hsc或hudep中hbg1或bcl11a的特定序列及其相应的％编辑。还提供了靶向hbb的提议grna。图9描绘了在caat盒基序处与grnaascpf1wthbg1-1结合的hbg1启动子区图10描绘了在gata1基序处与grnabcl11aascpf1rr-8结合的bcl11a增强子区的一部分。图11描绘了使用图6中鉴定的grna筛选hbg1启动子的区域。此区域跨越大约150bp。hbg1-1被示出与caat盒基序重叠。图12描绘了使用图7中鉴定的grna筛选的bcl11a红系增强子的区域。此区域跨越大约600个碱基对，bcl11arr-8被示出与gata1基序重叠。图13描绘了针对ascpf1低半胱氨酸构建体鉴定的半胱氨酸突变体。图14描绘了alexafluor马来酰亚胺测定的结果，证明了在ascpf1c334sc379sc674s中半胱氨酸残基的可及性显著降低。图15描绘了wtascpf1、ascpf1无半胱氨酸变体和两个低半胱氨酸变体对ms5底物dna的等效核酸内切酶活性的展示。图16描绘了在hudep和hsc中用ascpf1wt和rrpam变体靶向hbg1启动子区。用最优的ca-137脉冲程序和lonza溶液se进行了hudep实验。用如制造商推荐的脉冲编码eo-100和lonza溶液p3运行hsc筛选。对所有指导物的剂量为4.4μm的rnp，具有2:1指导物:蛋白比率。每种条件处理50,000hsc。ascpf1wt和rr蛋白内毒素水平为<5eu/ml。图17描绘了在hudep和hsc中用ascpf1wt和rr和rvrpam变体以及一个wtfncpf1靶筛选bcl11a增强子区。用最优ca-137脉冲程序和lonza溶液se运行hudep筛选。用如制造商推荐的脉冲编码eo-100和lonza溶液p3运行hsc筛选。还显示bcl11a的对照指导物(命名为kobeh)。对所有指导物的剂量为4.4μm的rnp，具有2:1指导物:蛋白比率。每种条件处理50,000hsc。ascpf1wt、rr和rvr蛋白的内毒素水平为<5eu/ml。图18描绘了在hudep中对ascpf1的核转染筛选。剂量为2.2μm的ascpf1rnp，使用匹配位点5(ms5)指导的rna，指导物:蛋白为2:1。ascpf1wt蛋白内毒素水平为<5eu/ml。用50,000hudep/条件使用不同脉冲程序测试lonza溶液se、sf和sg。脉冲编码ca-137和ca-138与溶液se显示了最佳编辑。图19描绘了在hsc中对ascpf1的核转染筛选。剂量为2.2μm的ascpf1rnp，使用匹配位点5(ms5)指导的rna，指导物:蛋白为2:1。ascpf1wt蛋白内毒素水平为<5eu/ml。用50,000hsc/条件使用不同脉冲程序测试lonza溶液p1、p2、p3、p4和p5。脉冲编码ca-137和ca-138、以及ff-100和ff-104在溶液p2情况下显示了最佳编辑。图20描绘了在lonzaamaxa中使用特定脉冲编码增加hsc中跨靶标和pam变体的编辑。对所有指导物的剂量为4.4μm的rnp，具有2:1指导物:蛋白比率。每种条件处理50,000hsc。ascpf1wt、rr和rvr蛋白的内毒素水平为<5eu/ml。图21描绘了在trbc、trac和b2m基因座处用ascpf1及其rr变体和rvrpam变体筛选t细胞治疗性靶标。大约30％的grna在初步筛选中显示超过50％的编辑，这与通常观察到的spcas9命中率相当，表明cpf1可潜在地用于患者t细胞的治疗性基因座(包括但不限于，例如，trac、trbc和/或b2m)处的基因编辑。图22描绘了电穿孔脉冲编码的改变显著改善了在t细胞中在多个治疗性靶基因座处的最大编辑。图23a-23b描绘了在原代t细胞中在疾病相关基因座处用cpf1rnp进行有效的敲除编辑。图23a描绘了用于离体细胞治疗的rnp工作流程。图23b描绘了使用ascpf1或工程化的pam变体在多个治疗上相关的t细胞基因座处的有效单一ko。图24描绘了通过流式细胞术测量的用cpf1rnp处理的t细胞中两个治疗性靶标的高效双敲除。图25描绘了在trbc、trac和b2m基因座处用ascpf1及其rr变体和rvrpam变体筛选t细胞治疗性靶标。图26总结了ascpf1wt、rr和rvr在t细胞中的三个同种异体t细胞靶标上的高编辑效率。图27示出了人原代t细胞中用cpf1或cas9进行两个t细胞靶标的双敲除。图28描绘了在ciita基因座处用cpf1筛选t细胞治疗性靶标。图29总结了与spcas9相比，cpf1在t细胞中的三个同种异体t细胞靶标trac、ciita和b2m上的高编辑效率。图30示出了在t细胞中用cpf1rnp三敲除三个t细胞靶标的效率。图31a-31b.图31a总结了靠前的cpf1候选指导物对三个t细胞靶ciita、trac和b2m的特异性，并且描绘了检测到的脱靶数量。图31b描绘了通过靶向的扩增子测序没有发现可检测的脱靶。图32描绘了改进t细胞中最大编辑的电穿孔条件的鉴定。条件1为ds-130并且条件2为ca-137。图33描绘了改进t细胞中基因编辑效力的nls构型的鉴定。nlsv1代表序列krpaatkkagqakkkk(seqidno:1)并且nlsv2代表序列2xpkkkrkv(seqidno:2)。图34描绘了使用ascpf1用hbg1-1指导物在hsc中的hbg-1基因座处的编辑效率。图35描绘了使用ms5指导rna在t细胞中的匹配位点5处，nls变体的编辑效率。图36描绘了通过流式细胞术测量的在ciita基因座处编辑的t细胞中mhcii的减少。图37a描绘了在ciita基因座处编辑的t细胞中的编辑效率。图37b描绘了ciitagrnaciita-34、ciita-41、ciita-45和ciita-10靶向的基因组位置。图38总结了在ciita基因座处编辑的t细胞中mhcii的减少百分比。图39描绘了cpf1ciitagrna的编辑效率，并且描绘了针对grna检测到的脱靶的数量。图40描绘了aspcpf1rr和wttrac、ciita和b2mgrna的编辑效率。图41描绘了不同长度的aspcpf1rr和wtb2mgrna的编辑效率。图42描绘了不同长度的aspcpf1rr和wttracgrna的编辑效率。图43描绘了不同长度的aspcpf1rr和wtciitagrna的编辑效率。图44a是未经编辑的基因组dna靶位点、用于靶向整合的示例性dna供体模板、潜在的插入结果(即，在切割位点的非靶向整合或在切割位点的靶向整合)和三个潜在的pcr扩增子(由使用靶向p1引发位点和p2引物位点的引物对(扩增子x)、靶向p1引物位点和p2’引发位点的引物对(扩增子y)或靶向p1’引物位点和p2引物位点的引物对(扩增子z)产生)的示意性表示。所描绘的示例性dna供体模板含有整合的引物位点(p1’和p2’)和填充序列(s1和s2)。a1/a2：供体同源臂，s1/s2：供体填充序列，p1/p2：基因组引物位点，p1’/p2’：整合的引物位点，h1/h2：基因组同源臂，n：负荷，x：切割位点。图44b是未经编辑的基因组dna靶位点、用于靶向整合的示例性dna供体模板、潜在的插入结果(即，在切割位点的非靶向整合或在切割位点的靶向整合)和两个潜在的pcr扩增子(由使用靶向p1引物位点和p2引物位点的引物对(扩增子x)、或靶向p1’引物位点和p2引物位点的引物对(扩增子y)产生)的示意性表示。示例性dna供体模板含有整合的引物位点(p1’)和填充序列(s2)。a1/a2：供体同源臂，s1/s2：供体填充序列，p1/p2：基因组引物位点，p1’：整合的引物位点，h1/h2：基因组同源臂，n：负荷，x：切割位点。图44c是未经编辑的基因组dna靶位点、用于靶向整合的示例性dna供体模板、潜在的插入结果(即，在切割位点的非靶向整合或在切割位点的靶向整合)和两个潜在的pcr扩增子(由使用靶向p1引物位点和p2引物位点的引物对(扩增子x)、或靶向p1引物位点和p2’引物位点的引物对(扩增子y)产生)的示意性表示。示例性dna供体模板含有整合的引物位点(p2’)和填充序列(s1)。a1/a2：供体同源臂，s1/s2：供体填充序列，p1/p2：基因组引物位点，p2’：整合的引物位点，h1/h2：基因组同源臂，n：负荷，x：切割位点。图45描绘了设计用于靶向t细胞受体α恒定(trac)基因座的grna的示例性dna供体模板。图46描绘了从筛选hbg1和hbg2的启动子区而鉴定的grna。具体实施方式定义和缩写除非另外指定，否则以下术语中的每一个具有此章节中与其相关的含义。不定冠词“一个”(“a”和“an”)是指至少一个相关名词，并且可与术语“至少一个”和“一个或多个”互换使用。例如，“一个模块”意指至少一个模块，或一个或多个模块。连词“或”和“和/或”可作为非排他析取词互换使用。如本文所用，术语“约(about)”或“大约(approximately)”可以意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内，这将部分地取决于该值是怎样测定或确定的，例如，受到测量系统的限制。例如，按照惯例在给定值中，“约”可以意指在1个或超过1个标准差内。如果在申请和权利要求中描述了具体值，除非另有说明，否则术语“约”可以意指具体值的可接受误差范围，如由术语“约”修饰的值的±10％。短语“基本上由......组成”是指所叙述的种类是主要种类，但是其他种类可以以不影响主题组合物的结构、功能或行为的痕量或量存在。例如，基本上由特定种类组成的组合物通常包含90％、95％、96％或更多的所述种类。“结构域”用于描述蛋白质或核酸的区段。除非另外指明，否则不需要结构域具有任何特定功能特性。“indel”是核酸序列中的插入和/或缺失。indel可为dna双链断裂的修复产物，该dna双链断裂例如通过本披露的基因组编辑系统形成的双链断裂。indel最常在通过“错误倾向”修复路径(例如下文所述的nhej路径)修复断裂时形成。关于hsc的“有效的indel”是指导致hbf表达的indel(删除和/或插入)。在某些实施例中，hsc中的有效的indel可以诱导hbf的表达。在某些实施例中，hsc中的有效的indel可以导致hbf的表达水平增加。关于t细胞的“有效的indel”是指减少t细胞中靶基因(例如内源性t细胞基因)表达的indel(缺失和/或插入)。在某些实施例中，t细胞中的“有效的indel”导致t细胞上细胞表面蛋白或标记表达的减少或消除。“基因转变”是指通过并入内源同源序列(例如基因阵列内的同源序列)改变dna序列。“基因修正”是指通过并入外源同源序列(例如外源单链或双链供体模板dna)改变dna序列。基因转变和基因修正是通过hdr路径(例如下文所述的那些)修复dna双链断裂的产物。indel、基因转变、基因修正和其他基因组编辑结果典型地通过测序(最常通过“新一代(next-gen)”或“边合成边测序(sequencing-by-synthesis)”方法进行，但仍可使用saner测序)来评价，并且通过所有测序读段之间所关注位点处的数值变化(例如，±1、±2或更多个碱基)的相对频率来定量。测序用dna样品可通过本领域中已知的多种方法来制备，并且可包括通过聚合酶链式反应(pcr)扩增所关注位点、捕捉通过双链断裂产生的dna末端，如在tsai等人(nat.biotechnol.[自然生物技术]34(5):483(2016)，通过引用并入本文)中所述的guideseq方法中，或通过本领域熟知的其他手段。基因组编辑结果也可通过原位杂交法(例如fibercombtm系统，由基因组视觉公司(genomicvision)(法国巴涅)商品化)和通过本领域中已知的任何其他适宜方法来评价。如本文所用，短语“靶标序列的修饰”及其等效物涵盖但不限于将缺失、插入、基因转变、基因修正和/或indel引入靶序列中。靶序列的修饰可以导致靶序列表达的改变，例如，对编码序列的修饰可以破坏由所述序列编码的蛋白质的表达，而调控序列的修饰可以导致在调控序列的控制下的蛋白质表达的增加或减少，这取决于调控序列是否激活或抑制蛋白质的表达。“alt-hdr”、“替代性同源定向修复”或“替代性hdr”可互换使用，是指使用同源核酸(例如，内源同源序列(例如姐妹染色单体)或外源核酸(例如模板核酸))修复dna损伤的过程。alt-hdr与经典hdr的不同之处在于，该过程利用与经典hdr不同的路径，并且可以被经典hdr介体rad51和brca2抑制。alt-hdr的不同之处还在于涉及单链或带切口同源核酸模板，而经典hdr通常涉及双链同源模板。“经典hdr”、“经典同源定向修复”或“chdr”是指使用同源核酸(例如，内源同源序列(例如，姐妹染色单体)或外源核酸(例如，模板核酸))修复dna损伤的过程。当在双链断裂处已有显著切除时，典型hdr通常起作用，形成dna的至少一个单链部分。在正常细胞中，chdr通常涉及一系列步骤，诸如断裂的识别、断裂的稳定、切除、单链dna的稳定、dna交叉中间体的形成、交叉中间体的拆分以及连接。该过程需要rad51和brca2，并且同源核酸典型地为双链。除非另外指明，否则如本文所用的术语“hdr”涵盖经典hdr和alt-hdr两者。“非同源末端连接”或“nhej”是指连接介导的修复和/或非模板介导的修复，包括经典nhej(cnhej)和替代性nhej(altnhej)，替代性nhej又包括微同源介导的末端连接(mmej)、单链退火(ssa)和合成依赖性微同源介导的末端连接(sd-mmej)。在关于分子的修饰(例如核酸或蛋白质)使用时，“替代”或“替代的”不需要方法限制，但仅指示替代实体是存在的。“受试者”意指人类或非人类动物。人类受试者可为任何年龄(例如，婴儿、儿童、青年人或成年人)，并且可患有疾病，或可能需要基因修饰。可替代地，受试者可为动物，该术语包括但不限于哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、两栖动物，并且更具体地非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔子、豚鼠、犬、猫等。在本披露的某些实施例中，受试者为家畜，例如牛、马、绵羊或山羊。在某些实施例中，受试者是家禽。在某些实施例中，受试者是植物。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”意指治疗受试者(例如，人类受试者)的疾病，包括以下各项中的一种或多种：抑制疾病，即，阻止或预防其发展或进展；缓解疾病，即，引起疾病状态消退；减轻疾病的一种或多种症状；和治愈疾病。“预防”(prevent、preventing和prevention)是指预防哺乳动物(例如，人类)的疾病，包括(a)避免或排除疾病；(b)影响对疾病的诱因；或(c)防止或延迟疾病的至少一种症状的发作。“试剂盒”是指两种或更多种组分的任何集合，该两种或更多种组分一起构成可用于特殊目的的功能单元。通过说明(而不是限制)，根据本披露的一个试剂盒可以包括与rna指导的核酸酶复合或能够与该核酸酶复合的指导rna，并且伴有(例如悬浮于，或可悬浮于)药学上可接受的载体。该试剂盒可用于将复合物引入例如细胞或受试者中，用于在这种细胞或受试者中引起所需基因组改变的目的。试剂盒的组分可以包装在一起，或者这些组分可分开包装。根据本披露的试剂盒还任选地包括使用说明书(dfu)，其描述例如根据本披露的方法使用该试剂盒。dfu可以物理方式与试剂盒包装在一起，或者可以使试剂盒的使用者能获得该dfu，例如通过电子方式获得。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指dna和rna中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。多核苷酸、核苷酸序列、核酸等可以是嵌合混合物或其衍生物或经修饰的形式，单链或双链。它们可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处经修饰，例如以改进分子的稳定性、其杂交参数等。核苷酸序列典型地携带遗传信息，包括但不限于细胞器用于制造蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组dna、rna、任何合成的和遗传操作的多核苷酸，以及有义和反义多核苷酸二者。这些术语还包括含有经修饰碱基的核酸。常规iupac表示法用于本文所呈现的核苷酸序列中，如下表1中所示(还参见cornish-bowdena，nucleicacidsres.[核酸研究]1985年5月10日；13(9):3021-30，通过引用并入本文)。然而应注意，在序列可能由dna或者rna编码的那些情况下，例如在grna靶向结构域中，“t”表示“胸腺嘧啶或尿嘧啶”。表1：iupac核酸表示法符号碱基a腺嘌呤t胸腺嘧啶或尿嘧啶g鸟嘌呤c胞嘧啶u尿嘧啶kg或t/uma或cra或gyc或t/usc或gwa或t/ubc、g或t/uva、c或gha、c或t/uda、g或t/una、c、g或t/u术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。这些术语包括个别蛋白质、缔合在一起的蛋白质的组或复合物，以及此类蛋白质的片段或部分、变体、衍生物和类似物。肽序列使用常规表示法呈现于本文中，在左侧以氨基或n末端开始，并且前进至右侧的羧基或c末端。可以使用标准单字母或三字母缩写。术语“变体”是指诸如多肽、多核苷酸或小分子的实体，其与参照实体(例如，野生型或天然存在实体)显示出显著的结构同一性，但与参照实体相比，在一个或多个化学部分(例如，在多肽的上下文中的氨基酸或在多核苷酸的上下文中的核苷酸)的存在或水平方面与参照实体在结构上不同。如本文所用，术语变体还涵盖实体(如多肽、多核苷酸或小分子)，所述实体在与这样的实体有关的一个或多个特性中功能上更好或优于参照实体。在许多实施例中，变体在功能上也与其参考实体不同。例如，但并非进行限制，“变体cpf1多肽”涵盖包含s542r/k607r取代的ascpf1变体(其识别tycvpam)，以及包含s542r/k548v/n552r取代的ascpf1变体(其识别tatvpam)。如本文所用，术语“切割事件”是指核酸分子中的断裂。切割事件可以是单链切割事件，也可以是双链切割事件。单链切割事件可以产生5’悬突或3’悬突。双链切割事件可以产生平端、两个5’悬突或两个3’悬突。如本文所用，关于靶核酸序列上的位点，术语“切割位点”是指由rna指导的核酸酶依赖性过程介导，靶核酸的两个核苷酸残基之间发生双链断裂的靶位置，或者可替代地，是指其中靶核酸的几个核苷酸残基的范围内(发生两个单链断裂)的靶位置。切割位点可以是针对例如平端双链断裂的靶位置。可替代地，切割位点可以是靶核酸的几个核苷酸残基的范围内的靶位点，用于例如两个单链断裂或缺口，所述两个单链断裂或缺口形成双链断裂并且通过约10个碱基对分开。理想地，一个或多个双链断裂或成对的两个单链切口中更近者将在靶位置的0-500bp之内(例如，离靶位置不超过450、400、350、300、250、200、150、100、50或25bp)。当使用双切口酶时，成对的两个切口彼此在25-55bp(例如，在25和50、25和45、25和40、25和35、25和30、50和55、45和55、40和55、35和55、30和55、30和50、35和50、40和50、45和50、35和45、或40和45bp之间)之内并且彼此远离不超过100bp(例如、不超过90、80、70、60、50、40、30、20或10bp)。概述本披露提供了用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列的表达的crispr/cpf1相关方法和组分。例如，本披露提供了用于靶向影响造血干细胞(hsc)增殖、存活、持久性和/或功能的核酸序列的crispr/cpf1相关方法。在某些非限制性实施例中，本披露提供了通过cpf1rna指导的核酸酶有效编辑cd34+细胞中的靶核酸序列的第一证据。此外，本披露提供了cpf1rna指导的核酸酶有效编辑遗传性胎儿血红蛋白持续存在症(在本文中称为“hpfh”)相关的基因(bcl11a和hbg1)的第一证据。本披露还提供了用于靶向影响t细胞增殖、存活、持久性和/或功能的核酸序列的crispr/cpf1相关方法。本披露进一步提供了表现出显著编辑效率和表现出改进特性的修饰的cpf1蛋白，以及用于评估此类修饰的cpf1蛋白的效率的策略。修饰的cpf1蛋白在一方面，本披露涉及修饰的cpf1蛋白及其在用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列的表达的crispr/cpf1相关方法中的用途。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白来源于选自由以下组成的组的cpf1蛋白：氨基酸球菌属物种(acidaminococcussp.)菌株bv3l6cpf1蛋白(ascpf1)、弗朗西斯菌(francisellanovicida)u112(fncpf1)、牛莫拉氏菌(moraxellabovoculi)237(mbcpf1)、candidatusmethanomethylphilusalvusmx1201(cmacpf1)、sneatiaamnii(sacpfq)、腔隙莫拉菌(moraxellalacunata)(mlcpf1)、牛莫拉氏菌aax08_00205(mb2cpf1)、牛莫拉氏菌aax11_00205(mb3cpf1)、毛螺菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)nd2006cpf1蛋白(lbcpf1)、毛螺菌科细菌ma2020(lb5cpf1)、毛螺菌科细菌mc2017(lb4cpf1)、腕足黄杆菌(flavobacteriumbrachiophilum)fl-15(fbcpf1)、硫微螺菌属物种(thiomicrospirasp.)xs5(tscpf1)、parcubacteria菌群gw2011(pgcpf1)、候选罗斯曼菌细菌(candidatusroizmanbacteriabacterium)gw2011(crbcpf1)、候选佩莱格里尼菌科细菌(candidatusperegrinbacteriabacterium)gw2011(cpbcpf1)、丁酸弧菌属物种(btyrivibriosp.)nc3005(bscpf1)、溶纤维丁酸弧菌(butyrivibriofibrisolvens)(bfcpf1)、布氏普雷沃菌(prevotellabryantii)b14(pb2cpf1)和口腔类拟杆菌(bacteroidetesoraltaxon)274(bocpf1)(参见，例如，zetsche等人,biorxiv[生物预印本]134015；doi:https://doi.org/10.1101/134015，将其内容通过引用以其整体并入本文)。在某些实施例中，cpf1蛋白包含选自由以下组成的组的序列：seqidnos:17-19，其分别具有seqidno:20-22的密码子优化的核酸序列。cpf1核定位信号(nls)变体在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含核定位信号(nls)(在本文中也称为“cpf1nls变体”)。例如，但并非进行限制，可用于结合本文披露的方法和组合物的nls序列将包含能够促进蛋白质导入细胞核的氨基酸序列。可用于结合本文披露的方法和组合物的nls序列为本领域中已知。此类nls序列的非限制性实例包括具有如下氨基酸序列的核质蛋白nls：krpaatkkagqakkkk(seqidno:1)和具有氨基酸序列pkkkrkv(seqidno:2)的猿猴病毒40“sv40”nls。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白可具有一个或多个，例如，两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个nls序列。例如，但并非进行限制，修饰的cpf1蛋白可以具有两个nls序列、三个nls序列或四个nls序列。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白可以具有两个nls序列。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白的nls序列定位于cpf1蛋白序列的c末端处或定位在cpf1蛋白序列的c末端附近。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白的nls序列定位于cpf1蛋白序列的n末端处或定位在cpf1蛋白序列的n末端附近。在某些实施例中，本披露的修饰的cpf1蛋白可以具有定位于cpf1蛋白序列的n末端处或在cpf1蛋白序列的n末端附近的一个或多个nls序列以及定位于cpf1蛋白序列的c末端处或在cpf1蛋白序列的c末端附近的一个或多个nls序列，例如，修饰的cpf1蛋白包含定位于cpf1蛋白序列的n末端和c末端两者处或在cpf1蛋白序列的n末端和c末端两者附近的nls序列。在某些实施例中，具有定位于cpf1蛋白序列的c末端处或定位于cpf1蛋白序列的c末端附近的nls序列的修饰的cpf1蛋白可以选自以下：his-ascpf1-nnls(在本文中也称为“aspcpf1nlsv1”)(seqidno:3)；his-ascpf1-snls(seqidno:4)；和his-ascpf1-snls-snls(在本文中也称为“aspcpf1nlsv2”)(seqidno:5)，其中“his”是指六组氨酸纯化序列，“ascpf1”是指氨基酸球菌属物种cpf1蛋白序列，“nnls”是指核质蛋白nls，并且“snls”是指sv40nls。nls序列的同一性和c末端位置的另外的排列(例如附加两个或更多个nnls序列或nnls和snls序列(或其他nls序列)的组合以及有和没有纯化序列(例如六个组氨酸序列)的序列)在本披露的主题范围内。在某些实施例中，具有定位于cpf1蛋白序列的n末端处或定位于cpf1蛋白序列的n末端附近的nls序列的修饰的cpf1蛋白可以选自以下：his-snls-ascpf1(seqidno:6)、his-snls-snls-ascpf1(seqidno:7)和snls-snls-ascpf1(seqidno:8)。nls序列的同一性和n末端位置的另外的排列(例如附加两个或更多个nnls序列或nnls和snls序列(或其他nls序列)的组合以及有和没有纯化序列(例如六个组氨酸序列)的序列)在本披露的主题范围内。在某些实施例中，具有定位于cpf1蛋白序列的n末端和c末端两者处或定位于cpf1蛋白序列的n末端和c末端两者附近的nls序列的修饰的cpf1蛋白可以选自以下：his-snls-ascpf1-snls(seqidno:9)和his-snls-snls-ascpf1-snls-snls(seqidno:10)。nls序列的同一性和n末端/c末端位置的另外的排列(例如附加两个或更多个nnls序列或nnls和snls序列(或其他nls序列)的组合至n末端/c末端位置，以及有和没有纯化序列(例如六组氨酸序列))的序列在本披露的主题范围内。为了确定cpf1蛋白的修饰(例如nls修饰)有利于cd34+细胞和t细胞的编辑，合成了含有不同位置和类型nls序列的ascpf1蛋白。将蛋白变体与靶向grna的匹配位点5复合，并且电穿孔到cd34+细胞、t细胞和hudep(4.4μmrnp)中。在图4中，结果被描绘成归一化为针对每种细胞类型显示最大编辑的变体的％编辑。所述数据指示，不同种类的核酸酶在cd34+细胞和t细胞(还有其他细胞)中的相同靶位点上具有可变活性，并且在cd34+细胞和t细胞(还有其他细胞)中可以实现通过ascpf1的有效编辑。半胱氨酸修饰的cpf1蛋白和rnp已知二硫键的形成促进蛋白质的聚集。因此，为了鉴定可以被改变以减少这样的二硫键形成的可能性的半胱氨酸，对cpf1晶体结构和已知的cpf1一级氨基酸序列进行了分析(图13)。本披露的修饰的cpf1蛋白可以包含cpf1蛋白序列的一个或多个半胱氨酸残基处的改变(例如，缺失或取代)。此类修饰的cpf1蛋白表现出减少的聚集，这在扩大蛋白质的制造时特别有用。例如，但并非进行限制，修饰的cpf1蛋白包含一个或多个位置，例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个或八个位置处的改变，这些位置选自由以下组成的组：c65、c205、c334、c379、c608、c674、c1025和c1248。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含一个或多个半胱氨酸残基取代丝氨酸或丙氨酸。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个改变，例如取代：c65s、c205s、c334s、c379s、c608s、c674s、c1025s和c1248s。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个改变：c65a、c205a、c334a、c379a、c608a、c674a、c1025a和c1248a。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含在位置c334和c674或c334、c379和c674处的改变。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含以下改变：c334s和c674s，或c334s、c379s和c674s。在某些实施例中，修饰的cpf1蛋白包含以下改变：c334a和c674a，或c334a、c379a和c674a。在某些实施例中，如本文所述，修饰的cpf1蛋白包含一个或多个半胱氨酸残基改变以及一个或多个nls序列(例如，his-ascpf1-nnlscys-less(seqidno:11)或his-ascpf1-nnlscys-low(seqidno:12))的引入。cd34+hsc在与血红蛋白病相关的靶位点处的cpf1编辑本披露进一步提供了用于编辑用于治疗血红蛋白病(例如β地中海贫血和镰状细胞病)的靶核酸序列的crispr/cpf1相关方法。例如，但并非进行限制，crispr/cpf1相关的方法导致调节胎儿血红蛋白(hbf)表达的cd34+细胞中的一个或多个基因的破坏。治疗血红蛋白病的一种治疗策略涉及诱导增加hbf的表达。hbf的表达可以经由转录抑制因子bcl11a的红系细胞特异性表达的靶向破坏来诱导(canvers等人,nature[自然],527(12):192-197)。增加hbf表达的一个策略是使用基因编辑破坏bcl11a的表达。例如，但并非进行限制，rna指导的核酸酶，例如cpf1rna指导的核酸酶，可以靶向影响bcl11a基因表达的特定靶序列。在某些实施例中，可以靶向bcl11a基因的任何区域。本披露提供包括bcl11a基因中的修饰(例如破坏、敲低或敲除bcl11a表达)的细胞或细胞群。例如，但并非进行限制，细胞或细胞群可以通过递送包含cpf1rna指导的核酸酶和靶向bcl11a基因序列的grna分子的复合物(例如rnp复合物)来产生。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被修饰。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞具有有效的indel。在某些实施例中，cpf1rna指导的核酸酶可以靶向bcl11a基因的内含子2。在某些实施例中，cpf1rna指导的核酸酶将靶向破坏bcl11a基因的内含子2的+58dhs区中bcl11a的红系特异性增强子中的gata1结合基序。用于在这样的crispr/cpf1编辑系统(靶向bcl11a)中使用的示例性grna分子在图7、10和12中进行了鉴定。在某些实施例中，本披露涉及其中bcl11a基因被破坏的细胞。在某些实施例中，可以靶向bcl11a基因的红系增强子区，例如来自转录起始位点(tss)的+55kb和+62kb之间的红系增强子区。例如，但并非进行限制，本披露针对bcl11a基因内含子2的+58dhs区被破坏的细胞。在某些实施例中，这样的细胞可以包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及其中bcl11a基因被破坏的细胞群，例如其中bcl11a基因内含子2的+58dhs区被破坏。在某些实施例中，这样的细胞群包含如下细胞，所述细胞包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及其中bcl11a基因的gata1基序被破坏的细胞。在某些实施例中，这样的细胞可以包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及其中bcl11a基因的gata1基序被破坏的细胞群。在某些实施例中，这样的细胞群可以包括如下细胞，所述细胞包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。如以下实例3中所概述的，ascpf1成功介导了bcl11a基因内含子2的+58dhs区的靶位点的编辑。首先，在hudep2细胞中筛选多个具有不同pam(图1)的ascpf1变体指导rna，并且然后在mpbcd34+细胞中测试最有效的指导rna和核酸酶变体(图17)。特别地，图17描绘了在hudep和hsc中用ascpf1wt和rr和rvrpam变体以及一个wtfncpf1靶筛选bcl11a增强子区。与治疗血红蛋白病(例如β地中海贫血和镰状细胞病)有关的诱导胎儿血红蛋白表达的另一个策略是干扰hbg基因座的表达，特别是hgb1和/或hgb2的表达。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1介导的hbg基因座的编辑的用途。在某些实施例中，可以靶向hbg基因座的任何区域。在某些实施例中，如本文所述，crispr/cpf1介导的编辑可用于破坏hbg基因座的非编码区(参见，例如，表18)。在某些实施例中，如本文所述，crispr/cpf1介导的编辑可用于破坏hbg基因座的内含子。在某些实施例中，如本文所述，crispr/cpf1介导的编辑可用于破坏hbg基因靶向的顺式调控区。例如，但并非进行限制，顺式调控区可以包括启动子和/或增强子。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1介导的hbg基因座的启动子区的编辑的用途。在某些实施例中，如本文所述，crispr/cpf1介导的编辑可用于破坏hbg基因座的启动子区-800和-60nt之间的区域。例如，但并非进行限制，crispr/cpf1介导的编辑可用于破坏hbg启动子区的-110nt启动子区和/或hbg启动子区中存在的caat盒。hbg启动子区的普遍性破坏和caat盒的特异性破坏可以经由靶向那些序列的crispr/cpf1编辑系统的递送来实现。用于在这样的crispr/cpf1编辑系统(靶向hbg基因座的那些序列)中使用的示例性grna分子在图6、9和11和表19中进行了鉴定。表18中提供了可以靶向破坏hbg基因座的染色体区域(例如基因组坐标)。在某些实施例中，用于在破坏hbg1基因座中使用的grna分子是hbg1-1。本披露提供包括hbg基因座中的修饰(例如破坏、敲低或敲除hbg表达)的细胞或细胞群。例如，但并非进行限制，细胞或细胞群可以通过递送包含cpf1rna指导的核酸酶和靶向hbg基因座的grna分子的复合物(例如rnp复合物)来产生。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被修饰。在某些实施例中，细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞具有有效的indel。在某些实施例中，本披露涉及细胞，例如cd34+造血干细胞和祖细胞，其中hbg基因座被破坏。例如，但并非进行限制，本披露涉及其中hbg基因座启动子区被破坏的细胞。在某些实施例中，hbg基因座的-110nt启动子区被破坏。在某些实施例中，这样的细胞可以包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及其中hbg基因座的-110nt启动子区被破坏的细胞群。在某些实施例中，这样的细胞群可以包括以下细胞，所述细胞包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及其中hbg启动子区存在的caat盒被破坏的细胞。在某些实施例中，这样的细胞包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露涉及其中hbg启动子区存在的caat盒被破坏的细胞群。在某些实施例中，这样的细胞群可以包括以下细胞，所述细胞包含crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露提供了通过使用包括grnahbg1-1的crispr/cpf1编辑系统破坏hbg1基因座的细胞群。在某些实施例中，包括hbg基因座或bcl11a基因的修饰的crispr/cpf1编辑的细胞或crispr/cpf1编辑的细胞群不包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，crispr/cpf1编辑的细胞群中小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露提供了被施用至有需要的受试者的crispr/cpf1编辑的细胞群，其中crispr/cpf1编辑的细胞群中小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露的crispr/cpf1编辑系统对细胞中的bcl11a基因或hbg基因的破坏可导致与在bcl11a基因或hbg基因中没有破坏的细胞相比，细胞中胎儿血红蛋白的表达增加。例如，但并非进行限制，相对于bcl11a基因或hbg基因座和/或基因中未破坏的细胞中胎儿血红蛋白的表达水平，胎儿血红蛋白的表达可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。在某些实施例中，本披露的crispr/cpf1编辑系统对细胞中的bcl11a基因或hbg基因的破坏可导致胎儿血红蛋白的表达增加，其量适于部分或完全减轻血红蛋白病(例如镰状细胞病或β-地中海贫血)的症状。例如，但并非进行限制，胎儿血红蛋白的表达增加可以大于约1皮克(pg)、大于约2pg、大于约3pg、大于约4pg、大于约5pg、大于约6pg、大于约7pg、大于约8pg、大于约9pg、大于约10pg、大于约11pg、大于约12pg、大于约13pg、大于约14pg或大于约15pg。在某些实施例中，本披露的crispr/cpf1编辑系统对细胞中的bcl11a基因或hbg基因的破坏可导致每个细胞产生至少约1皮克、至少约2皮克、至少约3皮克、至少约4皮克、至少约5皮克、至少约6皮克、至少约7皮克，至少约8皮克，至少约9皮克，至少约10皮克，或从约8至约9皮克，或从约9至约10皮克胎儿血红蛋白。本披露还涉及由上述基因组编辑系统修饰的细胞群，其中相对于未经基因组编辑系统修饰的细胞群，较高百分比的细胞群能够分化为表达hbf的红系谱系细胞群。在某些实施例中，较高百分比可以是至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％或至少约40％更高。在某些实施例中，所述细胞可以是造血干细胞。在某些实施例中，所述细胞能够分化为成红细胞、红细胞或红细胞的前体或成红细胞的前体。在某些实施例中，可以通过超高效液相色谱(uplc)测量表达水平，例如hbf的相对表达水平(例如，相比于总β样球蛋白链)。可以使用多种策略将本披露的crispr/cpf1编辑系统递送给细胞。例如，但并非进行限制，编码crispr/cpf1编辑系统的组分的一种或多种载体(例如aav或其他病毒载体)，可以用于在细胞中诱导crispr/cpf1编辑系统的组分的表达。可替代地，包含crispr/cpf1编辑系统的组分的rnp复合物可以例如经由电穿孔引入细胞。在某些实施例中，rnp复合物可以通过脂质纳米颗粒递送至细胞中。如以下实例3中所概述的，图16描绘了在hudep和hsc中用ascpf1wt和rr-pam变体成功地靶向hbg1启动子区。总之，这些与bcl11a基因和hbg基因座破坏相关的数据显示，通过ascpf1变体在cd34+细胞中在临床相关的基因座处(即已知的hpfh靶位点)进行的有效编辑。与t细胞增殖、存活和/或功能相关的靶位点处t细胞的cpf1编辑一种提议治疗癌症的治疗策略涉及过继性t细胞转移。限制基因修饰t细胞作为癌症治疗剂的功效的因素包括(1)t细胞增殖，例如过继性转移后t细胞增殖受限；(2)t细胞存活，例如肿瘤环境中的因子诱导t细胞凋亡；以及(3)t细胞功能，例如由宿主免疫细胞和癌细胞分泌的抑制因子对细胞毒性t细胞功能的抑制。增加功效的一种策略是利用基因编辑以修改或破坏与t细胞增殖、存活和/或功能相关的t细胞基因。例如，但并非进行限制，rna指导的核酸酶，例如cpf1rna指导的核酸酶，可以靶向影响t细胞基因表达的特定序列。本披露涵盖的方法和组合物可以用于通过修饰一个或多个t细胞表达的基因(例如，fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因中的一个或多个)而影响t细胞增殖、存活、持久性和/或功能。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物可以用于通过修饰一个或多个t细胞表达的基因(例如，cblb和/或ptpn6基因)而影响t细胞增殖。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物可以用于通过修饰一个或多个t细胞表达的基因(例如，fas和/或bid基因)而影响t细胞存活。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物可以用于通过修饰一个或多个t细胞表达的基因(例如，ctla4、pdcd1、trac、ciita和/或trbc基因)而影响t细胞功能。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物可以用于通过修饰b2m基因而改进t细胞持久性。在某些实施例中，一个或多个t细胞表达的基因(包括但不限于fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)作为靶向敲除被独立地靶向，例如以影响t细胞增殖、存活、持久性和/或功能。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除一个t细胞表达的基因(例如，选自下组的一个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除两个t细胞表达的基因(例如，选自下组的两个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除三个t细胞表达的基因(例如，选自下组的三个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除四个t细胞表达的基因(例如，选自下组的四个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除五个t细胞表达的基因(例如，选自下组的五个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除六个t细胞表达的基因(例如，选自下组的六个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除七个t细胞表达的基因(例如，选自下组的七个基因，该组由以下组成：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除八个t细胞表达的基因，例如选自fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除九个t细胞表达的基因，例如选自fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除九个t细胞表达的基因，例如fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因。除上文所描述的基因之外，许多其他t细胞表达的基因可以被靶向以影响工程化t细胞的功效。这些基因包括但不限于tgfbri、tgfbrii和tgfbriii(kershaw等人2013nat.rev.cancer[癌症自然评论]13,525-541)。在某些实施例中，可以使用本文所披露的方法单独地或组合地修饰tgfbri、tgfbrii和tgfbriii基因中的一个或多个。在某些实施例中，可以使用本发明披露的方法单独地或与上文所描述的八个基因(即，fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc)中的任何一个或多个组合地修饰tgfbri、tgfbrii和tgfbriii基因中的一个或多个。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物修饰fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因，这是通过靶向所述一个或多个基因的位置(例如，敲除位置)(例如，非编码区(例如，启动子区或调控区)内的位置或编码区内的位置)，或通过靶向所述一个或多个基因的转录序列(例如，内含子序列或外显子序列)。在某些实施例中，所述一个或多个基因(例如，fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因)的编码序列(例如编码区，例如早期编码区)被靶向用于修饰和敲除表达。在某些实施例中，所述一个或多个t细胞表达的基因(例如，fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因)的非编码区(例如，启动子区或调控区)中的位置被靶向用于修饰和敲除所述一个或多个t细胞表达的基因的表达。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物修饰fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因，这是通过靶向所述一个或多个基因的编码序列。在某些实施例中，所述编码序列是早期编码序列。在某些实施例中，所述一个或多个基因的编码序列被靶向用于敲除所述一个或多个t细胞表达的基因的表达。在某些实施例中，本文所披露的方法和组合物修饰fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因，这是通过靶向所述一个或多个基因的非编码序列。在某些实施例中，所述非编码序列包括启动子区内的序列、增强子序列、内含子序列、3’utr内的序列、多腺苷酸化信号序列或其组合。在某些实施例中，所述一个或多个基因的非编码序列被靶向用于敲除所述一个或多个基因的表达。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因的一个或两个等位基因，例如通过在所述一个或多个基因中诱导修饰。在某些实施例中，所述修饰包含插入、缺失、突变或其组合。在某些实施例中，所述靶向敲除途径是使用包含cpf1酶的crispr/cpf1系统由非同源末端连接(nhej)介导。在某些实施例中，本文披露的crispr/cpf1系统靶向trac基因。在某些实施例中，crispr系统包含与trac基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与trac基因的任一链互补。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在trac基因的编码序列内。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，trac基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且trac基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，trac基因序列的部分在trac基因的编码序列的前500bp内。在某些实施例中，用于在靶向trac的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表2和3中列出的靶向结构域序列。本披露提供了包括表2和表3中提供的一种或多种grna的组合物。本披露进一步提供了包括一种或多种rnp复合物的组合物，所述rnp复合物包括表2和表3中提供的一种或多种grna。在某些实施例中，本文披露的crispr/cpf1系统靶向trbc基因。在某些实施例中，crispr系统包含与trbc基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与trbc基因的任一链互补。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在trbc基因的编码序列内。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，trbc基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且trbc基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，trbc基因序列的部分在trbc基因的编码序列的前500bp内。在某些实施例中，用于在靶向trbc的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表4和5中列出的靶向结构域序列。本披露提供了包括表4和表5中提供的一种或多种grna的组合物。本披露进一步提供了包括一种或多种rnp复合物的组合物，所述rnp复合物包括表4和表5中提供的一种或多种grna。在某些实施例中，本文披露的crispr/cpf1系统靶向b2m基因。在某些实施例中，crispr系统包含与b2m基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与b2m基因的任一链互补。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在b2m基因的编码序列内。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，b2m基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且b2m基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，b2m基因序列的部分在b2m基因的编码序列的前500bp内。在某些实施例中，b2m基因序列的部分在b2m基因的编码序列的第501个核苷酸和最后一个核苷酸之间。在某些实施例中，用于在靶向b2m的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表6、7和8中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，用于在靶向b2m的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含agugggggugaauucagugu。本披露提供了包括表6、7和8中提供的一种或多种grna的组合物。本披露进一步提供了包括一种或多种rnp复合物的组合物，所述rnp复合物包括表6、7和8中提供的一种或多种grna。在某些实施例中，本文披露的crispr/cpf1系统靶向ciita基因。在某些实施例中，crispr系统包含与ciita基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，crispr系统包含与ciita基因序列的一部分互补的grna。在某些实施例中，grna可以与ciita基因的任一链互补。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在ciita基因的编码序列内。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在外显子内。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在内含子内。在某些实施例中，ciita基因序列的靶向部分在基因的调控区内。在某些实施例中，靶向多于一种序列，并且ciita基因序列的靶向部分位于一个或多个外显子、一个或多个内含子、一个或多个调控区内或是一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个调控区。在某些实施例中，ciita基因序列的部分在ciita基因的编码序列的前500bp内。在某些实施例中，用于在靶向ciita的这样的crispr/cpf1系统中使用的grna分子的靶向结构域包含表9中列出的靶向结构域序列。本披露提供了包括表9中提供的一种或多种grna的组合物。本披露进一步提供了包括一种或多种rnp复合物的组合物，所述rnp复合物包括表9中提供的一种或多种grna。表2表3表4表5表6表7表8表9fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc的敲除和/或敲低可能在多种情况下有用，包括但不限于用于治疗癌症和非癌症疾病(例如自身免疫性障碍)的过继性免疫疗法的上下文中。根据本披露的某些实施例，fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc在将用于疗法的免疫细胞(如t细胞)中被敲除。作为一个非限制性实例，t细胞可以表达工程化的受体，如嵌合抗原受体(car)或异源t细胞受体(tcr)，所述受体可被配置为识别细胞或组织上与病理学(如肿瘤细胞)有关的抗原。无论它们是否表达工程化的受体，根据本披露的tcr、mhci和/或mhcii敲除t细胞可用于靶向其中gvh或hvg反应可能存在安全性或功效问题的组织或器官。tcr、mhci和/或mhcii敲除和/或敲低细胞可用于“同种异体”细胞疗法，其中细胞从受试者中获得，经修饰以敲除或敲低，例如破坏fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc的表达，然后返回到不同的受试者。在任一方法中，在收获和施用本披露的tcr、mhci和/或mhcii敲除和/或敲低细胞之间可以以各种方式操作，如扩增、刺激、纯化或分选、用转基因转导、冷冻和/或解冻。如本文所述，敲除或敲低fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc基因可以：(1)预防gvh反应；(2)预防hvg反应；和/或(3)改进t细胞的安全性和功效。如本文所述，敲低fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc蛋白的表达类似地可以：(1)预防gvh反应；(2)预防hvg反应；和/或(3)改进t细胞的安全性和功效。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除和/或敲低t细胞中一个或多个选自由以下组成的组的基因：b2m、trac、ciita和trbc。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除和/或敲低t细胞中两个选自由以下组成的组的基因：b2m、trac、ciita和trbc。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除和/或敲低t细胞中三个选自由以下组成的组的基因：b2m、trac、ciita和trbc。在某些实施例中，本发明披露的方法包括独立地敲除和/或敲低t细胞中所有四个基因b2m、trac、ciita和trbc。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的trac基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的ciita基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m和trac基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m和ciita基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的trac和ciita基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的trac和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的ciita和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m、trac和ciita基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m、trac和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m、ciita和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的trac、ciita和trbc基因。在某些实施例中，本发明披露的方法包括敲除和/或敲低t细胞中的b2m、trac、ciita和trbc基因。在某些实施例中，敲除和/或敲低t细胞中选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组的一个或多个基因、两个或更多个基因、三个或更多个基因或四个或更多个基因可以：(1)预防gvh反应；(2)预防hvg反应；和/或(3)改进t细胞的安全性和功效。例如，但并非进行限制，敲除和/或敲低t细胞中选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组的一个或多个基因可以用于生成“同种异体”细胞，例如，同种异体t细胞。在某些实施例中，敲除和/或敲除选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组一个或多个基因的可用于“同种异体”细胞疗法，其中细胞获得自受试者，经修饰以敲除或敲低，例如破坏b2m、trac、ciita和/或trbc的表达，然后返回不同的受试者。在某些实施例中，与未经修饰的t细胞相比，敲除和/或敲低t细胞中选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组的一个或多个基因、两个或更多个基因、三个或更多个基因或四个或更多个基因导致t细胞中mhcii受体表达的降低。在某些实施例中，相对于未经修饰的细胞群中mhcii受体、tcr或b2m表达的量，被修饰以敲除和/或敲低选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组的一个或多个基因的细胞群展现出mhcii受体、tcr或b2m表达减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在某些实施例中，敲除和/或敲低多于一个基因可涉及使用不同的用于编辑每个靶基因的核酸酶。例如，但并非进行限制，crispr/cpf1编辑系统可用于敲除和/或敲低一个靶基因，并且crispr/cas9编辑系统可用于敲除和/或敲低第二靶基因。本披露提供了分离的crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群，所述t细胞或t细胞群包括在本文披露的t细胞的一个或多个内源基因中的一个或多个修饰。在某些实施例中，crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。可替代地，crispr/cpf1编辑的t细胞或crispr/cpf1编辑的t细胞群不包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，crispr/cpf1编辑的细胞群中小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，所述t细胞是cd8+t细胞，cd8+天然t细胞、cd4+中枢记忆t细胞、cd8+中枢记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+t细胞、cd4+干细胞记忆t细胞、cd8+干细胞记忆t细胞、cd4+辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4+天然t细胞、th17cd4+t细胞、th1cd4+t细胞、th2cd4+t细胞、th9cd4+t细胞、cd4+foxp3+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞或cd4+cd25+cd127-foxp3+t细胞。在某些实施例中，本披露涉及crispr/cpf1介导的t细胞内源基因(选自由fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita、trbc及其任何组合组成的组)编辑的用途。例如，但并非进行限制，所述修饰通过包含cpf1rna指导的核酸酶和grna分子的一种或多种复合物(例如rnp复合物(其靶向fas基因序列的一部分、bid基因序列的一部分、ctla4基因序列的一部分、pdcd1基因序列的一部分、cblb基因序列的一部分、ptpn6基因序列的一部分、b2m基因序列的一部分、trac基因序列的一部分、ciita基因序列的一部分、trbc基因序列的一部分或其组合))的递送产生。在某些实施例中，可以递送两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种复合物，例如rnp复合物，其中复合物中的每一种靶向不同基因。在某些实施例中，t细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被编辑和/或被修饰。在某些实施例中，t细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞具有有效的indel，例如，在至少一个选自由以下组成的组的内源t细胞基因中：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc。cpf1变体、不同细胞类型和配制品的基准测定crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节可以通过在靶核酸序列(例如，“匹配位点”靶核酸序列)方面，比较测试crispr/cpf1编辑系统的活性与对照crispr/rna指导的核酸酶编辑系统的活性而进行评估。匹配位点靶核酸序列包含有待被cpf1以及第二rna指导的核酸酶(例如，cas9)编辑的要求。例如，在本实例中，可以使用tttvascpf1野生型原型间隔子邻近基序(“pam”)和nggspcas9野生型pam。如上所述，测试的cpf1蛋白可以包含一个或多个相对于野生型cpf1蛋白的修饰。此类修饰的实例包括但不限于，上述修饰并入一个或多个nls序列，并入六组氨酸纯化序列，以及cpf1蛋白半胱氨酸氨基酸的改变，及其组合。在本实例中使用的示例性匹配位点靶核酸序列包括匹配位点1(“ms1”；seqidno:13)，匹配位点5(“ms5”；seqidno:14)，匹配位点11(“ms11”；seqidno:15)，和匹配位点18(“ms18”；seqidno:16)。为了评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列在特定细胞类型(例如cd34+hsc)中表达的调节，将crispr/cpf1基因组编辑系统(即包含cpf1rna指导的核酸酶和与靶核酸(包含匹配位点靶)的至少一部分互补的grna的系统)引入(例如，作为rnp或经由使用编码所述系统的组分的载体)到目的细胞类型的细胞中。如在此所披露的可以检测靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节。然后可以将靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节的检测与当使用crispr/cas9基因组编辑系统用相同的匹配位点靶和相同的细胞类型检测靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节时进行比较。上述描述的对比crispr/cpf1介导的对crispr/cas9介导的(或通过另一基于crispr的系统编辑)靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节的方法允许对所使用的crispr/cpf1介导的编辑系统的特定属性进行评估。例如，但并非进行限制，此类方法可用于评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节以鉴定不同制造过程制备的cpf1rna指导的核酸酶和/或grna活性的差异。此类方法还可以鉴定不同配制品中存在的cpf1rna指导的核酸酶和/或grna的活性以及那些使用不同递送策略的活性的差异。在某些实施例中，本披露涉及对通过测试性crispr/cpf1基因组编辑系统与对照rna指导的核酸酶基因组编辑系统进行的crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节的比较的测定。更具体地，本披露提供了使用基因编辑系统(例如，crispr/cas9或crispr/cpf1或其具有与匹配位点互补的grna的变体)靶向的匹配位点(例如，含有匹配位点5的细胞)的测定，使得在匹配位点处编辑的水平或效率是基因编辑系统在任何其他位点处编辑效率的指示。换言之，可以通过测量在匹配位点处(例如，匹配位点5)实现的编辑水平或编辑效率来改变和评估基因编辑系统的各个组分的编辑效率。例如，但并非进行限制，测试和对照基因或基因组编辑系统可以相差以下方面的任何一个或多个：rna指导的核酸酶的序列；基因组编辑系统组分的来源，例如制造方法；基因组编辑系统的一种或多种组分的配制；以及引入基因组编辑系统的细胞的特性，例如细胞类型或细胞制备方法。在某些实施例中，本文描述的测定允许对测试基因组编辑系统进行质量控制分析。在某些实施例中，本披露的测定将评估crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列的表达的调节，其中所述靶标包含匹配位点序列。电穿孔脉冲编码筛选本披露进一步提供了在靶位点处产生更高编辑的电穿孔脉冲编码。如实例中所示，电穿孔脉冲编码的筛选允许鉴定编码，所述编码导致通过本披露的cpf1rna指导的核酸酶进行更高效地编辑。例如，但并非进行限制，图18描绘了使用一系列的特定脉冲编码和方案在hudep中对ascpf1的核转染筛选。类似地，图19描绘了在hsc中对ascpf1的示例性核转染筛选。在某些实施例中，脉冲编码ca-137和ca-138可用于促进cpf1rna指导的核酸酶的高效编辑。例如，但并非进行限制，图20和23c确认了ca-137脉冲编码的提高的效率。治疗方法本披露进一步提供了通过施用所披露的基因组编辑方法编辑的细胞来治疗疾病和/或障碍的方法。在某些实施例中，本披露涉及通过修饰受试者的一个或多个细胞来治疗受试者的方法。在某些实施例中，一个或多个细胞被离体修饰，然后施用给受试者。例如，但并非进行限制，治疗受试者的方法可以包括使来自受试者的细胞(例如离体)与(a)与靶核酸的靶序列互补的grna分子；和(b)本文披露的cpf1rna指导的核酸酶接触。在某些实施例中，本披露提供了治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用通过本披露的crispr/cpf1系统修饰的一个或多个细胞。在某些实施例中，一个或多个细胞获得自供体，使用本披露的crispr/cpf1系统进行基因修饰，并且然后施用给受试者。在某些实施例中，本披露的方法可以包括向有需要的受试者施用已使用所披露的基因组编辑方法编辑(例如，以产生同种异体t细胞)的t细胞。例如，但并非进行限制，本披露的方法可以包括施用一个或多个已被编辑以敲除或敲低fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和/或trbc的表达的t细胞。在某些实施例中，t细胞已被编辑以敲除或敲低b2m、trac、ciita和/或trbc的表达。在某些实施例中，一个或多个t细胞已被离体编辑，然后施用给受试者。在某些实施例中，一个或多个细胞获得自供体。在某些实施例中，此类t细胞可用于治疗患有癌症或自身免疫性障碍的受试者。在某些实施例中，在施用至受试者中的被crispr/cpf1编辑的t细胞群中，crispr/cpf1编辑的细胞群中小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露的方法可以包括向有需要的受试者施用已使用所披露的基因组编辑方法编辑的cd34+造血干细胞和祖细胞(hspc)。在某些实施例中，cd34+细胞可以被编辑以敲除或敲低bcl11a或hbg的表达。例如，但并非进行限制，使用本文披露的基因组编辑方法编辑的cd34+造血干细胞和祖细胞(hspc)可用于治疗有需要的受试者中的血红蛋白病。在某些实施例中，血红蛋白病可以是严重镰状细胞病(scd)或地中海贫血，如β-地中海贫血、δ-地中海贫血或β/δ-地中海贫血。在某些实施例中，用于治疗血红蛋白病的示例性方案可以包括从有需要的受试者中收获cd34+hspc，使用本文披露的基因组编辑方法离体编辑自体cd34+hspc，然后将编辑的自体cd34+hspc再输注到受试者中。在某些实施例中，用编辑的自体cd34+hspc治疗可导致hbf诱导增加。在收获cd34+hspc之前，在某些实施例中，受试者可以中断羟基脲治疗(如果适用的话)，并接受输血以维持足够的血红蛋白(hb)水平。在某些实施例中，受试者可经静脉内施用普乐沙福(plerixafor)(例如，0.24mg/kg)以将cd34+hspc从骨髓动员至外周血。在某些实施例中，受试者可经历一个或多个白细胞去除周期(例如，周期之间约一个月，一个周期定义为连续几天进行两次普乐沙福动员的白细胞去除收集)。在某些实施例中，为受试者进行的白细胞去除周期的数量可以是实现编辑的自体cd34+hspc重新注入回受试者所需的剂量(例如，≥2x106细胞/kg，≥3x106细胞/kg，≥4x106细胞/kg，≥5x106细胞/kg，2x106细胞/kg至3x106细胞/kg，3x106细胞/kg至4x106细胞/kg，4x106细胞/kg至5x106细胞/kg)连同实现用于备份存储的未编辑的自体cd34+hspc/kg的剂量(例如，≥1.5x106细胞/kg)的数量。在某些实施例中，可以使用本文披露的任何基因组编辑方法编辑从受试者收获的cd34+hspc。在某些实施例中，本文披露的任何一种或多种grna和一种或多种rna指导的核酸酶可以在基因组编辑方法中使用。在某些实施例中，治疗可以包括自体干细胞移植。在某些实施例中，受试者可以用白消安调理进行清髓性调理(例如，基于第一剂量药物代谢动力学分析调整剂量，测试剂量为1mg/kg)。在某些实施例中，调理可以连续发生四天。在某些实施例中，三天白消安洗脱期后，可以将编辑的自体cd34+hspc(例如，≥2x106细胞/kg，≥3x106细胞/kg，≥4x106细胞/kg，≥5x106细胞/kg，2x106细胞/kg至3x106细胞/kg，3x106细胞/kg至4x106细胞/kg，4x106细胞/kg至5x106细胞/kg)重新注入受试者(例如重新注入外周血)。在某些实施例中，可以制造编辑的自体cd34+hspc并为特定受试者冷冻保存。在某些实施例中，受试者可以在连续的清髓性调理方案和经编辑的自体cd34+细胞输注后获得中性粒细胞移植。中性粒细胞移植可以定义为三次连续测量的anc≥0.5x109/l。在某些实施例中，施用至受试者中的被crispr/cpf1编辑的cd34+hspc群中，crispr/cpf1编辑的cd34+hspc群中小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，本披露的crispr/cpf1介导的编辑系统可导致约10％或更高的临床相关或治疗上相关的编辑效率。例如，但并非进行限制，本披露的crispr/cpf1介导的编辑系统可以导致临床相关或治疗上相关的编辑效率为约5％或更高、约10或更高、15％或更高、约20％或更高、约25％或更高、约30％或更高、约35％或更高、约40％或更高、约45％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高或约99％或更高。在某些实施例中，在本文披露的治疗方法中有待施用的细胞群中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞被修饰。在某些实施例中，crispr/cpf1编辑的细胞群中小于约10％、小于约5％、小于约1％、小于约0.5％、小于约0.25％或小于约0.1％的细胞包括crispr/cpf1编辑系统的一种或多种组分。基因组编辑系统术语“基因组编辑系统”或“基因编辑系统”是指具有rna指导的dna编辑活性的任何系统。本披露的基因组编辑系统包括至少两种从天然存在的crispr系统改适的组分：指导rna(grna)和rna指导的核酸酶。这两种组分形成复合物，所述复合物能够与特定核酸序列结合并在所述核酸序列中或其周围编辑dna，例如通过制备一条或多条单链断裂(ssb或切口)、双链断裂(dsb)和/或点突变。天然存在的crispr系统进化性地组织化为两个类别和五种类型(makarova等人，natrevmicrobiol.[自然综述：微生物学]2011年6月；9(6):467-477(makarova)，通过引用并入本文)，并且虽然本披露的基因组编辑系统可改适任一类型或类别的天然存在的crispr系统的组分，但本文所呈现的实施例通常是从2类和ii型或v型crispr系统改适。2类系统涵盖ii型和v型，其特征为相对较大的多结构域rna指导的核酸酶蛋白(例如，cas9或cpf1)以及一个或多个指导rna(例如，crrna和任选地tracrrna)，它们形成核糖核蛋白(rnp)复合物，所述复合物缔合(即，靶向)并裂解与crrna的靶向(或间隔序列)序列互补的特定基因座。根据本披露的基因组编辑系统类似地靶向并编辑细胞dna序列，但与自然界中存在的crispr系统显著不同。例如，本文所述的单分子指导rna在自然界中不存在，并且根据本披露的指导rna和rna指导的核酸酶二者可并入任一数目的非天然存在的修饰。基因组编辑系统可以用多种方式来实施(例如施用或递送至细胞或受试者)，并且不同的实施可适合于不同应用。例如，在某些实施例中，基因组编辑系统是作为蛋白质/rna复合物(核糖核蛋白，或rnp)来实施，其可以包括于药物组合物中，所述药物组合物任选地包括药学上可接受的载体和/或囊封剂，例如脂质或聚合物微粒或纳米颗粒、胶束、脂质体等。在某些实施例中，基因组编辑系统是作为一种或多种编码上述rna指导的核酸酶和指导rna组分的核酸(任选地具有一种或多种其他组分)来实施；在某些实施例中，基因组编辑系统是作为一种或多种包含此类核酸的载体来实施，例如病毒载体，例如腺相关病毒；并且在某些实施例中，基因组编辑系统是作为前述任一种的组合来实施。根据本文所述原理操作的其他或经修改的实施将为技术人员所了解并且在本披露的范围内。应注意，本披露的基因组编辑系统可靶向单一特定核苷酸序列，或者可通过使用两个或更多个指导rna靶向(并且能平行编辑)两个或更多个特定核苷酸序列。在本披露通篇中，多个grna的使用称为“多重化”，并且可用于靶向多个无关的所关注靶序列，或用于在单一靶结构域内形成多个ssb或dsb，并且在一些情形中，用于在这种靶结构域内产生特定编辑。例如，maeder等人的国际专利公开号wo2015/138510(maeder)(其是通过引用并入本文)描述用于修正人类cep290基因中的点突变(c.2991+1655a至g)的基因组编辑系统，所述点突变导致产生隐蔽剪接位点，这又降低或消除该基因的功能。maeder的基因组编辑系统利用两个指导rna，这些指导rna靶向该点突变任一侧上的(即，侧接)序列，并且形成侧接该突变的dsb。这又促进了包括突变在内的间插序列的缺失，由此消除隐蔽剪接位点并恢复正常的基因功能。作为另一实例，cotta-ramusino等人的wo2016/073990(“cotta-ramusino等人”)(通过引用以其整体并入本文)描述利用两个grna与cas9切口酶组合(制造单链切口的cas9，如化脓链球菌(s.pyogenes)d10a)的基因组编辑系统，该布置称为“双重切口酶系统”。cotta-ramusino等人的双重切口酶系统经配置以在所关注序列的相对链上制造两个偏移一个或多个核苷酸的切口，所述切口组合产生具有悬突(在cotta-ramusino等人情形中是5’悬突，但3’悬突也有可能)的双链断裂。在一些情况下，该悬突又可以促进同源定向修复事件。并且作为另一实例，palestrant等人的wo2015/070083(“palestrant”，通过引用以其整体并入本文)描述靶向编码cas9的核苷酸序列的grna(称为“管理rna”)，其可以包括于基因组编辑系统中，所述基因组编辑系统包含一个或多个另外的grna以容许cas9的瞬时表达，所述cas9可能原本例如在一些经病毒转导的细胞中是组成型表达的。这些多重化应用旨在具有示例性而不是限制性，并且技术人员将了解，其他多重化应用通常与本文所述的基因组编辑系统相容。在一些情况下，基因组编辑系统可以形成双链断裂，这些双链断裂是通过细胞dna双链断裂机制例如nhej或hdr来修复。这些机制描述于多处文献中，例如davis和maizels,pnas,111(10):e924-932,2014年3月11日(davis)(描述alt-hdr)；frit等人，dnarepair[dna修复]17(2014)81-97(frit)(描述alt-nhej)；以及iyama和wilsoniii,dnarepair[dna修复](amst.)2013年8月；12(8):620-636(iyama)(概括描述经典hdr和nhej路径)。如果基因组编辑系统通过形成dsb来操作，那么此类系统任选地包括促进或有助于特定双链断裂修复模式或特定修复结果的一个或多个组分。例如，cotta-ramusino等人还描述其中添加单链寡核苷酸“供体模板”的基因组编辑系统；将供体模板并入细胞dna的靶区域中，该靶区域由基因组编辑系统裂解，并且可以导致靶序列中的变化。在某些实施例中，基因组编辑系统在不引起单链或双链断裂的情况下修饰靶序列，或修饰靶序列中或附近的基因的表达。例如，基因组编辑系统可包括融合至作用于dna的功能结构域的rna指导的核酸酶，由此修饰靶序列或其表达。作为一个实例，rna指导的核酸酶可连接至(例如融合至)胞苷脱氨酶功能结构域，并且可通过产生所靶向的c至a取代来操作。示例性核酸酶/脱氨酶功能描述于komor等人nature[自然]533,420-424(2016年5月19日)(“komor”)中，所述文献是通过引用并入。可替代地，基因组编辑系统可利用裂解失活的(即，“死”)核酸酶，例如死cas9(dcas9)，并且可通过在细胞dna的一个或多个所靶向区域上形成稳定复合物来操作，由此干扰涉及一个或多个所靶向区的功能，包括但不限于mrna转录、染色质重塑等。在某些实施例中，本披露涵盖的基因组编辑系统将在标准测定中表现出一定的最小编辑百分比。例如，但并非进行限制，本披露涵盖的某些基因组编辑系统将在某些标准测定中表现出至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的编辑。本领域已知的一种或多种测定或本文所述那些(例如像，以下实例1中所述的那些)可用于评估crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑。作为实例，以下实例1描述了评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列在特定细胞类型(例如cd34+hsc)中表达的调节，将crispr/cpf1基因组编辑系统(即包含cpf1rna指导的核酸酶和与靶核酸(包含匹配位点靶)的至少一部分互补的grna的系统)引入(例如，作为rnp或经由使用编码所述系统的组分的载体)到目的细胞类型的细胞中。如在此所披露检测靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节。将靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节的检测与当使用crispr/cas9基因组编辑系统用相同的匹配位点靶和相同的细胞类型检测靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节时进行比较。在某些实施例中，本披露的基因组编辑系统可以在细胞群中同时敲除或敲低选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个基因。在某些实施例中，本披露的基因组编辑系统可以包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种grna分子，其中每种grna分子包含不同基因的靶向结构域，例如从b2m、trac、ciita和trbc基因选择的基因。例如，但并非进行限制，本披露的多重基因组编辑系统可以包括(i)包含第一指导rna(grna)(包含与第一基因的靶序列互补的第一靶向结构域)和第一cpf1rna指导的核酸酶的第一rnp复合物，(ii)包含第二grna分子(包含与第二基因的靶序列互补的第二靶向结构域)和第二cpf1rna指导的核酸酶的第二rnp复合物，(iii)包含第三grna分子(包含与第三基因的靶序列互补的第三靶向结构域)和第四cpf1rna指导的核酸酶的第三rnp复合物，和/或(iv)包含第四grna分子(包含与第四基因的靶序列互补的第四靶向结构域)和第四cpf1rna指导的核酸酶的第四rnp复合物。在某些实施例中，第一基因、第二基因、第三基因和第四基因选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组。在某些实施例中，用于靶向b2m的grna分子的靶向结构域包含表6、7和8中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，用于靶向trac的grna分子的靶向结构域包含表2和3中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，用于靶向ciita的grna分子的靶向结构域包含表9中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，用于靶向trbc的grna分子的靶向结构域包含表4和5中列出的靶向结构域序列。在某些实施例中，对于所有靶基因编辑效率可以为>80％、>85％、>90％、>95％、>98％或>99％。在某些实施例中，细胞群可以是t细胞群。指导rna(grna)分子术语“指导rna”和“grna”是指促进rna指导的核酸酶(如cpf1)与细胞中的靶序列(如基因组或附加体序列)的特异性缔合(或“靶向”)的任何核酸。grna可以是单分子(包含单一rna分子，并且可替代地称为嵌合)或模块(包含多于一个、并且典型地两个单独的rna分子，例如crrna和tracrrna，其通常例如通过双链化彼此缔合)。grna和其组成部分的描述遍及于文献中，例如briner等人(molecularcell[分子细胞]56(2),333-339，2014年10月23日(briner)，所述文献是通过引用并入)，以及cotta-ramusino。在细菌和古细菌中，ii型crispr系统通常包含rna指导的核酸酶蛋白(例如cas9)、包括与外来序列互补的5’区的crisprrna(crrna)和包括与crrna的3’区互补并形成双链体的5’区的反式激活crrna(tracrrna)。虽然并非旨在受限于任何理论，但认为此双链体有助于形成cas9/grna复合物，并且是所述复合物的活性所需的。在ii型crispr系统经改适用于基因编辑中时，发现crrna和tracrrna可以接合成单一单分子或嵌合指导rna，在一个非限制性实例中借助桥接crrna(在其3’末端)和tracrrna(在其5’末端)的互补区的四核苷酸(例如gaaa)“四环(tetraloop)”或“接头”序列来接合。(mali等人science.[科学]2013年2月15日；339(6121):823-826(“mali”)；jiang等人natbiotechnol.[自然生物技术]2013年3月；31(3):233-239(“jiang”)；和jinek等人,2012年，science[科学]8月17日；337(6096):816-821(“jinek”)，将所有这些文献均通过引用并入本文。)指导rna不论是单分子或模块都包括“靶向结构域”，所述靶向结构域与靶序列内的靶结构域完全或部分互补，所述靶序列例如期望编辑的细胞基因组中的dna序列。靶向结构域在文献中通过多种名称来提及，包括但不限于“指导序列”(hsu等人,natbiotechnol.[自然生物技术]2013年9月；31(9):827-832(“hsu”)，通过引用并入本文)、“互补性区域”(cotta-ramusino等人)、“间隔序列”(briner)和一般性地称为“crrna”(jiang)。不论给予其何种名称，靶向结构域典型地长度为10-30个核苷酸，并且在某些实施例中长度为16-24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且在cas9grna情形中位于5’末端处或5’末端附近，并且在cpf1grna情形中位于3’末端处或3’末端附近。除了靶向域以外，grna典型地(但不一定，如下文所讨论)包括多个可影响grna/cas9和grna/cpf1复合物的形成或活性的域。例如，如上文所提及，通过grna的第一和第二互补性结构域形成的双链化结构(也称为重复：抗重复双链体)与cas9的识别(rec)叶相互作用，并且可以介导cas9/grna复合物的形成。(nishimasu等人,cell[细胞]156,935-949,2014年2月27日(nishimasu2014)和nishimasu等人,cell[细胞]162,1113-1126,2015年8月27日(nishimasu2015)，将这两篇文献均通过引用并入本文)。应注意，第一和/或第二互补性结构域可含有一个或多个多聚腺苷酸段，其可以由rna聚合酶识别为终止信号。因此，第一和第二互补性结构域的序列任选地经修饰以消除这些段，并促进grna的体外转录的完成，例如通过使用如briner中所述的a-g交换或a-u交换来修饰。对第一和第二互补性结构域的这些和其他类似修饰在本披露的范围内。与第一和第二互补性结构域一起，cas9grna典型地包括两个或更多个其他双链化区域，该两个或更多个其他双链化区域在体内但不一定在体外参与核酸酶活性。(nishimasu2015)。在第二互补性结构域的3’部分附近的第一茎环1被不同地称为“近端结构域”(cotta-ramusino)、“茎环1”(nishimasu2014和2015)以及“连结(nexus)”(briner)。一个或多个其他茎环结构通常存在于grna的3’端附近，其数目依物种而变：化脓链球菌grna典型地包括2个3’茎环(总计4个茎环结构，包括重复：抗重复双链体)，而金黄色葡萄球菌和其他物种仅具有一个(总计3个茎环结构)。对根据物种组织化的保守茎环结构(更通常地，和grna结构)的描述于briner中提供。虽然前述说明集中于用于cas9的grna，但应了解，已经(或可能在未来)发现或发明其他rna指导的核酸酶，其利用在一些方面与针对这一点描述的那些grna不同的grna。例如，cpf1(“来自普雷沃菌属(prevotella)和弗朗西斯菌属(franciscella)1的crispr”)是最近发现的rna指导的核酸酶，其发挥功能不需要tracrrna。(zetsche等人,2015,cell[细胞]163,759-7712015年10月22日(zetschei)，通过引用并入本文)。用于cpf1基因组编辑系统的grna通常包括靶向结构域和互补性结构域(替代性地称为“把手”)。还应注意，在用于cpf1的grna中，靶向结构域通常存在于3’端处或附近，而不是如上文结合cas9grna所述的5’端(把手位于cpf1grna的5’端处或5’端附近)。本领域技术人员将了解，虽然在来自不同原核物种的grna之间或在cpf1与cas9grna之间可能存在结构差异，但grna的操作原理通常是一致的。因为这种操作一致性，grna可在广义上通过其靶向域序列来定义，并且技术人员将了解，可将给定靶向域序列并入任何适宜grna中，包括单分子或嵌合grna，或包括一种或多种化学修饰和/或序列修饰(取代、额外核苷酸、截短等)的grna。因此，为了便于呈现本披露，grna可仅在其靶向域序列方面加以描述。更通常地，技术人员将了解，本披露的一些方面涉及可以使用多个rna指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指定，否则术语grna应理解为不仅涵盖那些与cas9或cpf1的特定种类相容的grna，还涵盖可以用于任何rna指导的核酸酶的任何适宜grna。通过说明，在某些实施例中，术语grna可以包括与存在于2类crispr系统(例如ii型或v型或crispr系统)中的任何rna指导的核酸酶或从其衍生或改适的rna指导的核酸酶一起使用的grna。本披露提供了包含表2-9和19中提供的任一grna的序列的grna分子及其组合物。本披露进一步提供了包括一种或多种grna(包含示于表2-9和19中的grna序列)的组合物及其组合物。本披露提供了靶向表18中提供的染色体区域(例如基因组坐标)的grna及其组合物。本披露提供在靶位点处(例如，在细胞群中)导致大于约10％编辑的grna。例如，但并非进行限制，本披露的grna在靶位点处(例如，在细胞群中)导致大于约15％编辑、大于约20％编辑、大于约25％编辑、大于约30％编辑、大于约35％编辑、大于约40％编辑、大于约45％编辑、大于约50％编辑、大于约55％编辑、大于约60％编辑、大于约65％编辑、大于约70％编辑、大于约75％编辑、大于约80％编辑、大于约85％编辑、大于约90％编辑、大于约95％编辑、大于约96％编辑、大于约97％编辑、大于约98％编辑或大于约99％编辑。grna设计用于选择和验证靶序列的方法以及脱靶分析先前已描述于例如以下文献中：mali；hsu；fu等人,2014natbiotechnol[自然生物技术]32(3):279-84，heigwer等人,2014natmethods[自然方法]11(2):122-3；bae等人(2014)bioinformatics[生物信息学]30(10):1473-5；和xiaoa等人(2014)bioinformatics[生物信息学]30(8):1180-1182。这些参考文献中的每一篇都是通过引用并入本文。作为非限制性实例，grna设计可包括使用软件工具来优化对应于使用者的靶序列的潜在靶序列的选择，例如以使全基因组的总脱靶活性降至最低。虽然脱靶活性不限于裂解，但每个脱靶序列处的裂解效率可以例如使用实验衍生的加权方案来预测。这些和其他指导选择方法详细描述于maeder和cotta-ramusino等人中。grna修饰grna的活性、稳定性或其他特征可以通过并入某些修饰来改变。作为一个实例，瞬时表达或递送的核酸可能易于被例如细胞核酸酶降解。因此，本文所述的grna可以含有引入针对核酸酶的稳定性的一个或多个经修饰核苷或核苷酸。虽然不希望受理论束缚，但还应相信，本文所述的某些经修饰grna在引入细胞中时可展现降低的先天性免疫反应。本领域技术人员将了解一般在细胞(例如哺乳动物细胞)中响应外源核酸(尤其那些病毒或细菌来源的核酸)观察到的某些细胞反应。此类反应可以包括诱导细胞因子表达和释放以及细胞死亡，可通过本文所呈现的修饰来减少或完全消除。这个章节中讨论的某些示例性修饰可以包括于grna序列内的任一位置，包括但不限于在5’端处或5’端附近(例如，在5’端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)和/或在3’端处或3’端附近(例如，在3’端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)。在一些情形中，修饰定位于功能基序内，例如cas9grna的重复-抗重复双链体、cas9或cpf1grna的茎环结构和/或grna的靶向结构域。作为一个实例，grna的5’端可以包括真核mrna帽结构或帽类似物(例如，g(5’)ppp(5’)g帽类似物、m7g(5’)ppp(5’)g帽类似物或3’-o-me-m7g(5’)ppp(5’)g抗反向帽类似物(arca))，如下文所示：该帽或帽类似物可以在grna的化学合成或者体外转录期间被包括。按类似方式，grna的5’端可能缺少5’三磷酸基团。例如，体外转录的grna可能经磷酸酶处理(例如，使用小牛肠碱性磷酸酶)以移除5’三磷酸基团。另一常见修饰包括在grna的3’端添加多个(例如，1-10、10-20或25-200个)腺嘌呤(a)残基，称为polya段。可在化学合成期间，在体外转录后使用多聚腺苷聚合酶(例如，大肠杆菌(e.coli)多聚(a)聚合酶)，或在体内借助多聚腺苷酸化序列，将polya段添加至grna，如maeder中所述。应注意，本文所述的修饰可以按任一适宜方式组合，例如不论是在体内从dna载体转录的grna，或者是在体外转录的grna，都可以包括5’帽结构或帽类似物中的一种或两种以及3’polya段。指导rna可以在3’末端u核糖处经修饰。例如，u核糖的两个末端羟基可以被氧化为醛基，并且伴随核糖环的打开，以提供如下所示的经修饰核苷：其中“u”可以是未经修饰或经修饰的尿苷。3’末端u核糖可以经如下所示的2’3’环状磷酸酯修饰：其中“u”可以是未经修饰或经修饰的尿苷。指导rna可以例如通过并入本文所述的一个或多个经修饰核苷酸而含有可以针对降解稳定的3’核苷酸。在某些实施例中，尿苷可以由经修饰尿苷(例如，5-(2-氨基)丙基尿苷和5-溴代尿苷)或由本文所述的任何经修饰尿苷替代；腺苷和鸟苷可以由经修饰腺苷和鸟苷(例如，在8位处具有修饰，例如8-溴代鸟苷)或由本文所述的任何经修饰腺苷和鸟苷替代。在某些实施例中，可以将糖修饰的核糖核苷酸并入grna中，例如，其中2’oh-基团由选自以下的基团替代：h、-or、-r(其中r可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、卤基、-sh、-sr(其中r可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氨基(其中氨基可以是例如nh2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或氰基(-cn)。在某些实施例中，磷酸骨架可以如本文所述经修饰，例如经硫代磷酸酯(phtx)基团修饰。在某些实施例中，grna的一个或多个核苷酸可以各自独立地是经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于2’-糖修饰的，例如2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基，或2’-氟修饰的，包括例如，2’-f或2’-o-甲基腺苷(a)、2’-f或2’-o-甲基胞苷(c)、2’-f或2’-o-甲基尿苷(u)、2’-f或2’-o-甲基胸苷(t)、2’-f或2’-o-甲基鸟苷(g)、2’-o-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(teo)、2’-o-甲氧基乙基腺苷(aeo)、2’-o-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5ceo)及其任何组合。指导rna还可以包括“锁定”核酸(lna)，其中2’oh-基团可以例如通过c1-6亚烷基c1-6亚杂烷基桥连接至同一核糖的4’碳。可使用任何适宜部分来提供此类桥，包括但不限于亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；o-氨基(其中氨基可以是例如nh2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基或o(ch2)n-氨基(其中氨基可以是例如nh2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在某些实施例中，grna可以包括经修饰核苷酸，其为多环状(例如，三环；和“解锁”形式，如二醇核酸(gna)(例如，r-gna或s-gna，其中核糖被附接至磷酸二酯键的二醇单元置换)，或苏糖核酸(tna，其中核糖被α-l-苏呋喃糖基(threofuranosyl)-(3’→2’)置换)。通常，grna包括糖基核糖，其为具有氧的5元环。示例性修饰的grna可以包括但不限于核糖中氧的置换(例如，用硫(s)、硒(se)或亚烷基，例如像亚甲基或亚乙基)；双键的添加(例如，以用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的缩环(例如，以形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，以形成具有另外的碳或杂原子的6元或7元环，例如像脱水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己烷基、环己烯基以及吗啉代，其也具有氨基磷酸酯骨架)。尽管大多数的糖类似物改变位于2’位，但其他位点也适于修饰，包括4’位。在某些实施例中，grna包含4’-s、4’-se或4’-c-氨基甲基-2’-o-me修饰。在某些实施例中，可以将脱氮核苷酸(例如，7-脱氮-腺苷)并入grna中。在某些实施例中，可以将o-烷基化和n-烷基化核苷酸(例如，n6-甲基腺苷)并入grna中。在某些实施例中，grna分子中的一个或多个或所有核苷酸是脱氧核苷酸。在某些实施例中，grna将包含从具有序列号pct/us17/69019的国际专利申请中描述的那些中选择的一个或多个grna合成接头和/或过程，所述序列号通过引用以其整体并入本文。rna指导的核酸酶根据本披露的rna指导的核酸酶包括但不限于天然存在的2类的crispr核酸酶，如cpf1，以及由其衍生或获得的其他核酸酶，例如变体。rna指导的核酸酶也可以由功能术语来定义。例如，rna指导的核酸酶被定义为如下的那些核酸酶：(a)与grna相互作用(例如复合)；和(b)与grna一起缔合或任选地裂解或修饰dna的靶区域，所述靶区域包括(i)与grna的靶向结构域互补的序列，以及任选地，(ii)称为“原型间隔子邻近基序”或“pam”的另一序列，其更详细地描述于下文中。在说明以下实例时，rna指导的核酸酶可以在广义上依据其pam特异性和裂解活性来定义，即使在共享相同pam特异性或裂解活性的个别rna指导的核酸酶之间可能存在变异。技术人员将了解，本披露的一些方面涉及可以使用具有某种pam特异性和/或切割活性的任何适宜rna指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指明，否则术语rna指导的核酸酶应理解为通用术语，并不限于rna指导的核酸酶的任何特定类型(例如，cas9与cpf1)、种类(例如，化脓链球菌与金黄色葡萄球菌)或变体(例如，全长与截短或分裂；天然存在的pam特异性与工程化pam特异性等)。pam序列的名称来源于其与“原型间隔子”序列的顺序关系，所述原型间隔子与grna靶向结构域(或“间隔序列”)互补。与原型间隔子一起，pam序列定义特定rna指导的核酸酶/grna组合的靶区域或序列。多种rna指导的核酸酶可能需要pam与原型间隔子之间的不同顺序关系。通常，cas9识别原型间隔子3’的pam序列。另一方面，cpf1通常识别原型间隔子5’的pam序列。除了识别pam和原型间隔子的特定顺序定向以外，rna指导的核酸酶还可以识别特定pam序列。例如，金黄色葡萄球菌cas9识别nngrrt或nngrrv的pam序列，其中n个残基紧靠由grna靶向结构域所识别区域的3’。酿脓链球菌cas9识别nggpam序列。并且新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)cpf1识别ttnpam序列。已鉴别多种rna指导的核酸酶的pam序列，并且鉴别新颖pam序列的策略已描述于shmakov等人,2015,molecularcell[分子细胞]60,385-397，2015年11月5日中。还应注意，工程化rna指导的核酸酶可具有与参考分子的pam特异性不同的pam特异性(例如，在工程化rna指导的核酸酶的情形中，参考分子可以是衍生出rna指导的核酸酶的天然存在的变体，或与工程化rna指导的核酸酶具有最大氨基酸序列同源的天然存在的变体)。除了其pam特异性以外，rna指导的核酸酶可通过其dna切割活性来表征：天然存在的rna指导的核酸酶典型地在靶核酸中形成dsb，但是已产生仅生成ssb的工程化变体(上文所讨论)(ran和hsu等人,cell[细胞]154(6),1380-1389,2013年9月12日(ran)，通过引用并入本文)，或完全不切割的工程化变体。cpf1与crrna复合的氨基酸球菌属物种(acidaminococcussp.)cpf1和包括tttnpam序列的双链(ds)dna靶标的晶体结构已经由yamano等人解析(cell[细胞].2016年5月5日；165(4):949-962(yamano)，通过引用并入本文)。cpf1像cas9一样，具有两个叶：rec(识别)叶和nuc(核酸酶)叶。rec叶包括rec1和rec2结构域，其缺少与任何已知蛋白质结构的相似性。同时，nuc叶包括三个ruvc结构域(ruvc-i、-ii和-iii)和bh结构域。然而，与cas9相反，cpf1rec叶缺少hnh结构域，并且包括同样缺少与已知蛋白质结构的相似性的其他结构域：结构上独特的pi结构域、三个楔形(wed)结构域(wed-i、-ii和-iii)和核酸酶(nuc)结构域。虽然cas9和cpf1共享结构和功能的相似性，但应了解，某些cpf1活性是由与任何cas9域不同的结构域介导的。例如，靶dna的互补链的切割似乎是由nuc结构域介导，所述nuc结构域在顺序上和空间上与cas9的hnh结构域不同。另外，cpf1grna的非靶向部分(把手)采用假结(pseudoknot)结构，而不是cas9grna中由重复：抗重复双链体形成的茎环结构。rna指导的核酸酶的修饰上述rna指导的核酸酶具有可用于多种应用的活性和特性，但技术人员将了解，rna指导的核酸酶在某些情况下也可以经修饰，以改变裂解活性、pam特异性或其他结构或功能特征。首先参看改变裂解活性的修饰，上文已描述降低或消除nuc叶内结构域活性的突变。可在ruvc结构域中、在cas9hnh结构域中或在cpf1nuc结构域中进行的示例性突变描述于ran和yamano中，以及cotta-ramusino中。通常，降低或消除两个核酸酶结构域之一中的活性的突变导致具有切口酶活性的rna指导的核酸酶，但应注意，切口酶活性的类型根据哪个结构域失活而变化。作为一个实例，cas9的ruvc结构域的失活将导致裂解互补或顶部链的切口酶。另一方面，cas9hnh结构域的失活导致裂解底部或非互补链的切口酶。对于化脓链球菌(kleinstiver等人,nature[自然].2015年7月23日；523(7561):481-5(kleinstiveri)和金黄色葡萄球菌(kleinstiver等人,natbiotechnol.[自然生物技术]2015年12月；33(12):1293-1298(klienstiverii))，相对于天然存在的cas9参考分子的pam特异性的修饰已经由kleinstiver等人描述。kleinstiver等人还已描述改进cas9的靶向保真性的修饰(nature[自然],2016年1月28日；529,490-495(kleinstiveriii))。对于化脓链球菌(kleinstiver等人,nature[自然].2015年7月23日；523(7561):481-5(kleinstiveri)，相对于天然存在的cas9参考分子的pam特异性的修饰已经由kleinstiver等人描述。这些参考文献中的每一篇都是通过引用并入本文。相对于天然存在的cpf1参考分子的pam特异性的修饰已经由gao等人(gao等人,natbiotechnol.[自然生物技术]2017aug；35(8):789-792，将其通过引用并入本文)描述。在某些实施例中，rna指导的核酸酶可以是cpf1变体，例如，ascpf1变体。在某些实施例中，cpf1变体是包含s542r/k607r变异的ascpf1变体，其识别tycvpam。在某些实施例中，cpf1变体是包含s542r/k548v/n552r变异的ascpf1变体，其识别tatvpam。已将rna指导的核酸酶分裂成两个或更多个部分，如zetsche等人(natbiotechnol.[自然生物技术]2015年2月；33(2):139-42(zetscheii)，通过引用并入)和fine等人(scirep.[科学报告]2015年7月1日；5:10777(fine)，通过引用并入)所描述。在某些实施例中，rna指导的核酸酶可以是尺寸经优化的或截短的，例如通过一个或多个缺失来进行，所述缺失减小核酸酶的尺寸，同时仍保留grna关联、靶标和pam识别以及裂解活性。在某些实施例中，rna指导的核酸酶以共价或非共价方式，任选地通过接头结合至另一多肽、核苷酸或其他结构。示例性结合的核酸酶和接头描述于guilinger等人,naturebiotechnology[自然生物技术]32,577-582(2014)中，所述文献出于所有目的通过引用并入本文中。rna指导的核酸酶还任选地包括标签，例如但不限于核定位信号，以促进rna指导的核酸酶蛋白移动至细胞核中。在某些实施例中，rna指导的核酸酶可以并入c末端和/或n末端核定位信号。核定位序列是本领域中已知的并且描述于maeder和其他文献中。前述修饰列表旨在具有示例性，并且技术人员根据本披露将了解，在某些应用中，其他修饰可以是可能的或期望的。因此，为简洁起见，参考特定rna指导的核酸酶呈现本披露的示例性系统、方法和组合物，但应理解，所用rna指导的核酸酶可以不改变其操作原理的方式经修饰。此类修饰在本披露的范围内。编码rna指导的核酸酶的核酸本文提供编码rna指导的核酸酶(例如cpf1或其功能片段)的核酸。先前已描述编码rna指导的核酸酶的示例性核酸(参见，例如，cong2013；wang2013；mali2013；jinek2012)。在一些情形中，编码rna指导的核酸酶的核酸可以是合成的核酸序列。例如，合成核酸分子可以经化学修饰。在某些实施例中，编码rna指导的核酸酶的mrna将具有一种或多种(例如，所有)以下特性：其可以被加帽；多聚腺苷酸化；以及经5-甲基胞苷和/或假尿苷取代。合成的核酸序列也可以经密码子优化，例如，至少一个非常见密码子或较不常见的密码子已经常见密码子替代。例如，合成的核酸可以指导优化的信使mrna的合成(例如，针对在哺乳动物表达系统(例如，本文描述的)中的表达进行优化)。密码子优化的cas9编码序列的实例呈现于cotta-ramusino中。另外，或可替代地，编码rna指导的核酸酶的核酸可包含核定位序列(nls)。核定位序列是本领域中已知的。候选分子的功能分析候选rna指导的核酸酶、grna和其复合物可以通过本领域中已知的标准方法来评估。参见，例如cotta-ramusino等人。rnp复合物的稳定性可通过差示扫描荧光法来评估，如下文所述。差示扫描荧光法(dsf)包含grna和rna指导的核酸酶的核糖核蛋白(rnp)复合物的热稳定性可以通过dsf来测量。dsf技术测量蛋白质的热稳定性，所述热稳定性可以在有利条件下(如添加结合rna分子，例如grna)增加。dsf测定可以根据任何适合的方案来进行，并且可以用于任何适合的环境中，包括但不限于(a)测试不同条件(例如grna:rna指导的核酸酶蛋白的不同化学计量比，不同缓冲溶液等)以鉴定rnp形成的最佳条件；和(b)测试rna指导的核酸酶和/或grna的修饰(例如，化学修饰、序列改变等)以鉴定改进rnp形成或稳定性的那些修饰。dsf测定的一个读出是rnp复合物的熔融温度的位移；相对高的位移表明，相对于特征为较低位移的参考rnp复合物，rnp复合物更稳定(并且可能因此具有更高活性或更有利的形成动力学、降解动力学或另一功能特征)。在作为筛选工具布置dsf测定时，可指定阈值熔融温度位移，使得输出是熔融温度位移等于或高于阈值的一种或多种rnp。例如，阈值可以是5℃-10℃(例如5°、6°、7°、8°、9°、10°)或更高，并且输出可以是一种或多种特征为熔融温度位移大于或等于所述阈值的rnp。dsf测定条件的两个非限制性实例在下面阐述(虽然条件参考了cas9的用途，但相对于cpf1可以使用类似的条件)：为了确定形成rnp复合物的最佳溶液，将水+10xsypro(生命技术公司(lifetechonologies)目录号s-6650)中固定浓度(例如，2μm)的cas9分配至384孔板中。然后添加稀释于具有不同ph和盐的溶液中的等摩尔量的grna。在室温下孵育10分钟并短暂离心以移除任何气泡后，使用bio-radcfx384tmreal-timesystemc1000touchtm热循环仪和bio-radcfxmanager软件运行从20℃至90℃的梯度，每10秒温度增加1℃。第二测定由以下步骤组成：在来自上文测定1的最适缓冲液中混合不同浓度的grna与固定浓度(例如2μm)的cas9，并在384孔板中孵育(例如，在室温下10分钟)。添加等体积的最适缓冲液+10xsypro(生命技术公司目录号s-6650)，并且将板用b粘合剂(msb-1001)密封。在短暂离心以移除任何气泡后，使用bio-radcfx384tmreal-timesystemc1000touchtm热循环仪和bio-radcfxmanager软件运行从20℃至90℃的梯度，每10秒温度增加1℃。基因组编辑策略在本披露的各个实施例中，上述基因组编辑系统用于在细胞内或从细胞获得的dna的靶向区中产生编辑(即修饰)。本文描述产生特定编辑的各种策略，并且这些策略通常是在所需修复结果、个别编辑(例如，ssb或dsb)的数目和定位以及此类编辑的靶位点方面加以描述。涉及ssb或dsb的形成的基因组编辑策略是通过修复结果来表征，这些修复结果包括：(a)缺失全部或部分靶向区；(b)插入或替代全部或部分靶向区；或(c)中断全部或部分靶向区。此分组并不旨在具有限制性，或结合于任何具体理论或模型，而仅是为了便于呈现而提供。技术人员将了解，所列结果不会相互排斥，并且一些修复可导致其他结果。除非另外指定，否则对特定编辑策略或方法的描述不应理解为需要特定的修复结果。所靶向区域的替代通常涉及用同源序列替代所靶向区域内现有序列的全部或部分，例如通过基因修正或基因转变来进行，两种修复结果是通过hdr路径介导。hdr是通过使用供体模板来促进，所述供体模板可以是单链或双链的，如下文更详细地描述。单链或双链模板可以是外源的，在这种情形中其将促进基因修正，或者所述模板可以是内源的(例如细胞基因组内的同源序列)，以促进基因转变。外源模板可以具有不对称悬突(即，模板中与dsb位点互补的部分可在3’或5’方向上偏移，而不是位于供体模板内的中心)，例如如richardson等人所述(naturebiotechnology[自然生物技术]34,339-344(2016)，(richardson)，通过引用并入)。在模板为单链的情况下，其可以对应于所靶向区域的互补(顶部)或非互补(底部)链。在一些情形中，通过在所靶向区域中或周围形成一个或多个切口来促进基因转变和基因修正，如在ran和cotta-ramusino等人中所述。在一些情形中，双重切口酶策略用于形成两个偏移ssb，其又形成具有悬突(例如5’悬突)的单一dsb。所靶向序列的全部或部分的中断和/或缺失可通过多种修复结果来实现。作为一个实例，可通过同时产生两个或更多个侧接所靶向区域的dsb使序列缺失，然后在修复dsb时切除所述所靶向区域，如在maeder中针对lca10突变所述。作为另一实例，可在修复前通过以下方式产生的缺失来中断序列：形成具有单链悬突的双链断裂，之后对悬突进行核酸外切加工。靶序列中断的一个特定子集是通过在所靶向序列内形成indel来介导，其中修复结果典型地是通过nhej路径(包括alt-nhej)来介导。nhej由于其与indel突变的关联而称为“错误倾向”修复路径。然而，在一些情形中，dsb是通过nhej修复，并且不改变其周围的序列(所谓的“完美”或“无瘢痕”修复)；这通常需要dsb的两端完美连接。同时，indel被认为是从游离dna末端在连接前的酶加工产生，其在一个或两个游离末端的一条或两条链中添加和/或移除核苷酸。由于游离dsb末端的酶加工可具有随机性，indel突变往往是可变的，沿分布发生，并且可能受到多种因素影响，包括特定靶位点、所用细胞类型、所用基因组编辑策略等。即使如此，有可能引起关于indel形成的有限泛化：通过修复单一dsb形成的缺失最常在1-50bp范围内，但是可能达到大于100-200bp。通过修复单一dsb形成的插入往往较短，并且常包括紧密围绕断裂位点的序列的短重复。然而，有可能获得大的插入，并且在这些情形中，插入的序列通常已经被追溯至基因组的其他区域或追溯至存在于细胞中的质粒dna。indel突变和经配置以产生indel的基因组编辑系统可用于例如在不需要产生特定的最终序列时和/或在可耐受移码突变的情况下中断靶序列。其还可以用于偏好特定序列的环境中，只要某些所需序列往往优先通过给定位点处的ssb或dsb的修复而发生即可。indel突变还是可用于评估或筛选特定基因组编辑系统和其组分的活性的工具。在这些和其他环境中，indel可以通过以下各项来表征：(a)其在与基因组编辑系统接触的细胞的基因组中的相对和绝对频率，和(b)相对于未编辑序列的数值差异的分布，例如，±1、±2、±3等。作为一个实例，在先导发现(lead-finding)环境中，可基于在受控条件下的indel读出筛选多个grna，以鉴定最有效驱动靶位点处的切割的那些grna。可以选择以阈值频率或以高于阈值的频率产生indel或产生indel的特定分布的指导以供进一步研究和开发。indel频率和分布还可以用作读出，用于评估不同的基因组编辑系统实施或配置和递送方法，例如通过保持grna不变并改变某些其他反应条件或递送方法。多重策略虽然上文讨论的示例性策略集中于通过单一dsb介导的修复结果，但根据本披露的基因组编辑系统还可用于产生在相同基因座中或在不同基因座中的两个或更多个dsb。涉及形成多个dsb或ssb的编辑策略描述于例如cotta-ramusino等人中。如本文所述，本披露涵盖的方法和组合物可以通过修饰两个或更多个t细胞表达基因(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc基因)来影响t细胞增殖、存活、持久性和/或功能。供体模板设计供体模板设计详细描述于文献中，例如cotta-ramusino中。dna寡聚体供体模板(寡脱氧核苷酸或odn)可以是单链(ssodn)或双链(dsodn)的，可以用于促进基于hdr的dsb修复，并且尤其可用于将修饰引入靶dna序列中、将新序列插入靶序列中、或完全替代靶序列。不论是单链或双链，供体模板通常包括与待裂解的靶序列内或附近(例如，侧接或邻近)的dna区域同源的区域。这些同源区域在本文中称作“同源臂”，并且示意性地示于下文中：[5’同源臂]-[替代序列]-[3’同源臂]。同源臂可具有任何适宜长度(如果仅使用一个同源臂，包括0个核苷酸)，并且3’和5’同源臂可以具有相同长度或可以具有不同长度。适当同源臂长度的选择可能受到多种因素影响，例如对避免与某些序列(例如alu重复序列或其他极为常见的元件)的同源性或微同源性的期望。例如，可以缩短5’同源臂以避免序列重复元件。在其他实施例中，可以缩短3’同源臂以避免序列重复元件。在某些实施例中，可以同时缩短5’和3’同源臂以避免包括某些序列重复元件。另外，一些同源臂设计可以改进编辑效率或增加所需修复结果的频率。例如，richardson等人(naturebiotechnology[自然生物技术]34,339-344(2016)(richardson)，所述文献是通过引用并入)发现，单链供体模板的3’和5’同源臂的相对不对称性影响修复率和/或结果。供体模板中的替代序列已描述于其他文献中，包括cotta-ramusino等人中。替代序列可以是任何适宜长度(如果所需修复结果是缺失，那么包括0个核苷酸)，并且相对于需要编辑的细胞内的天然存在的序列，典型地包括1、2、3或更多个序列修饰。一种常见序列修饰涉及改变天然存在的序列以修复突变，所述突变与需要治疗的疾病或病症相关。另一常见序列修饰涉及改变一个或多个序列，所述序列与rna指导的核酸酶的pam序列或用于产生ssb或dsb的一个或多个grna的靶向结构域互补或编码所述pam序列或靶向结构域，以在将替代序列并入靶位点中之后减少或消除靶位点的重复裂解。如果使用线性ssodn，其可以经配置以(i)退火至靶核酸的带切口链，(ii)退火至靶核酸的完整链，(iii)退火至靶核酸的正链，和/或(iv)退火至靶核酸的负链。ssodn可具有任何适合的长度，例如约、至少或不超过150-200个核苷酸(例如，150、160、170、180、190或200个核苷酸)。应注意，模板核酸也可以是核酸载体，例如病毒基因组或环状双链dna，例如质粒。包含供体模板的核酸载体可以包括其他编码或非编码元件。例如，模板核酸可以作为病毒基因组的部分来递送(例如在aav或慢病毒基因组中)，其包括某些基因组骨架元件(例如在aav基因组情形中，末端反向重复序列)并且任选地包括编码grna和/或rna指导的核酸酶的另外的序列。在某些实施例中，供体模板可以邻近或侧接由一个或多个grna识别的靶位点，以促进在供体模板的一端或两端上形成游离dsb，所述供体模板可以参与使用相同grna修复在细胞dna中形成的相应ssb或dsb。适合用作供体模板的示例性核酸载体描述于cotta-ramusino等人中。不论使用何种形式，模板核酸都可以设计为避免不期望的序列。在某些实施例中，可以缩短一个或两个同源臂以避免与某些序列重复元件(例如，alu重复、line元件等)重叠。靶向整合本披露进一步提供了包含供体模板的基因组编辑系统，所述供体模板被专门设计用于定量评估在细胞中靶核酸的切割位点处切割事件拆分后发生的基因编辑事件。本文所述基因组编辑系统的供体模板是dna寡核苷酸(odn)，其可以是单链(ssodn)或双链(dsodn)，并且可以用于促进基于hdr的双链断裂修复。供体模板尤其可用于将修饰引入靶dna序列，将新序列插入靶序列，或完全替代靶序列。本披露提供了包含负荷、一个或两个同源臂和一个或多个引发位点的供体模板。供体模板的一个或多个的引发位点以这样的方式在空间上排列，使得供体模板的一部分整合到靶核酸中的频率可以容易地评估和量化。图44a、44b、和44c是说明代表性的供体模板和从使用这些供体模板中产生的潜在的靶向整合结果的图。使用本文所述的示例性供体模板导致靶核酸中的至少一个引发位点的靶向整合，所述靶核酸可用于产生扩增子，所述扩增子可被测序以确定负荷(例如，转基因)靶向整合至靶细胞中的靶核酸的频率。例如，图44a示出了一个示例性供体模板，所述供体模板从5’到3’包含第一同源臂(a1)、第一填充序列(s1)、第二引发位点(p2’)、负荷、第一引发位点、第二填充序列和第二同源臂。供体模板的第一同源臂(a1)基本上与靶核酸的第一同源臂相同，而供体模板的第二同源臂(a2)基本上与靶核酸的第二同源臂相同。供体模板被设计使得第二引发位点(p2’)基本上与靶核酸(p1)的第一引发位点相同，并且使得第一引发位点(p1’)基本上与靶核酸(p2)的第二引发位点相同。使用本文所述的核酸酶进行靶核酸切割事件拆分后，可以使用单个引物对组来扩增围绕靶核酸的切割位点的核酸序列(即，存在于p1和p2之间、p1和p2’之间以及p1’和p2之间的核酸)。有利地，没有靶向整合或具有靶向整合的情况下，从切割事件拆分产生的扩增子(展示为扩增子x、y和z)的大小大致相同。然后可以对扩增子进行评估(例如通过测序，或与探针序列杂交)以确定靶向整合的频率。可替代地，图44b和44c示出了示例性供体模板，所述供体模板包含位于负荷核酸序列的3’(图44b)或5’(图44c)的单个引发位点。同样，使用本文所述的核酸酶的靶核酸切割事件拆分后，设计这些示例性供体模板以使得单个引物对组可用于扩增围绕靶核酸切割位点的核酸序列，从而获得两个大小大致相同的扩增子。当供体模板的引发位点位于负荷核酸3’处时，对应于非靶向整合事件的扩增子或对应于靶向整合位点5’连接的扩增子可以被扩增。当供体模板的引发位点位于负荷核酸5’处时，对应于非靶向整合事件的扩增子或对应于靶向整合位点3’连接的扩增子可以被扩增。这些扩增子可以被测序，以确定靶向整合的频率。根据本披露的供体模板可以任何适合的方式实施，包括但不限于单链或双链dna，线性或环状，裸或包含在载体内，和/或与指导rna共价或非共价缔合(例如，通过直接杂交或夹板杂交)。在某些实施例中，所述供体模板是ssodn。如果使用线性ssodn，其可以经配置以(i)退火至靶核酸的带切口链，(ii)退火至靶核酸的完整链，(iii)退火至靶核酸的正链，和/或(iv)退火至靶核酸的负链。ssodn可具有任何适宜长度，例如约或不大于150-200个核苷酸(例如，150、160、170、180、190或200个核苷酸)。在其他实施例中，供体模板是dsodn。在某些实施例中，供体模板包含第一链。在另一个实施例中，供体模板包含第一链和第二链。在某些实施例中，供体模板是外源寡核苷酸，例如，不是细胞中天然存在的寡核苷酸。应注意，供体模板也可以被包含在核酸载体(如病毒基因组或环状双链dna(例如质粒))内。在某些实施例中，供体模板可以是狗骨头形状的dna(参见，例如美国专利号9,499,847)。包含供体模板的核酸载体可以包括其他编码或非编码元件。例如，供体模板核酸可以作为病毒基因组的部分来递送(例如在aav或慢病毒基因组中)，其包括某些基因组骨架元件(例如在aav基因组情形中，末端反向重复序列)并且任选地包括编码grna和/或rna指导的核酸酶的另外的序列。在某些实施例中，供体模板可以邻近或侧接由一个或多个grna识别的靶位点，以促进在供体模板的一端或两端上形成游离dsb，所述供体模板可以参与使用相同grna修复在细胞dna中形成的相应ssb或dsb。适合用作供体模板的示例性核酸载体描述于cotta-ramusino等人中。同源臂不论是单链或双链，供体模板通常包括与待切割的靶序列(例如切割位点)内或附近(例如，侧接或邻近)的dna(例如靶核酸)区域同源的一个或多个区域。这些同源区域在本文中称作“同源臂”，并且示意性地示于下文中：[5’同源臂]-[替代序列]-[3’同源臂]。本文所述的供体模板的同源臂可以是任何适合的长度，前提是这样的长度足以允许通过需要供体模板的dna修复过程有效地拆分靶向核酸上的切割位点。在某些实施例中，在需要通过例如pcr对同源臂进行扩增的情况下，同源臂的长度使得可以进行扩增。在某些实施例中，在需要对同源臂进行测序的情况下，同源臂的长度使得测序可以进行。在某些实施例中，在需要定量评估扩增子的情况下，同源臂的长度使得例如通过具有类似的g/c含量、扩增温度等来实现每个扩增子的相似数量的扩增。在某些实施例中，同源臂是双链的。在某些实施例中，双链的同源臂是单链的。在某些实施例中，5’同源臂的长度在50至250个核苷酸之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度在50至2000个核苷酸之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度在50至1500个核苷酸之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度在50至1000个核苷酸之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度在50-500个核苷酸之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度在150至250个核苷酸之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是2000个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是1500个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是1000个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是700个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是650个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是600个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是550个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是500个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是400个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是300个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是250个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是200个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是150个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度小于100个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50个核苷酸或更少。在某些实施例中、5’同源臂的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是20个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是40个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是50个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是70个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是100个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是200个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是300个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是400个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是500个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是600个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是700个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是1000个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是1500个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度至少是2000个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度是约20个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度是约40个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度是250个核苷酸或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是约100个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度是约200个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度在50至250个核苷酸之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度在50-2000个核苷酸之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度在50-1500个核苷酸之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度在50-1000个核苷酸之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度在50-500个核苷酸之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度在150至250个核苷酸之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是2000个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是1500个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是1000个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是700个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是650个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是600个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是550个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是500个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是400个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是300个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是200个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是150个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是100个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50个核苷酸或更少。在某些实施例中、3’同源臂的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是20个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是40个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是50个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是70个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是100个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是200个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是300个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是400个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是500个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是600个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是700个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是1000个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是1500个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度至少是2000个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度是约20个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度是约40个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度是250个核苷酸或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是约100个核苷酸。在某些实施例中，3’同源臂的长度是约200个核苷酸。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50至250个碱基对之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50-2000个碱基对之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50-1500个碱基对之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50-1000个碱基对之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50-500个碱基对之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是150个碱基对至250个碱基对之间。在某些实施例中，5’同源臂的长度是2000个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是1500个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是1000个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是700个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是650个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是600个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是550个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是500个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是400个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是300个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是200个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度是150个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂的长度小于100个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂的长度是50个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是250，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，90，80，70，60，50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21或20个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少20个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少40个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少50个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少70个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少100个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少200个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少300个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少400个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少500个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少600个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少700个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少1000个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少1500个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是至少2000个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是大约20个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是大约40个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是大约100个碱基对。在某些实施例中，5’同源臂在长度上是大约200个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50至250个碱基对之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50-2000个碱基对之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50-1500个碱基对之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50-1000个碱基对之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50-500个碱基对之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是150个碱基对至250个碱基对之间。在某些实施例中，3’同源臂的长度是2000个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是1500个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是1000个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是700个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是650个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是600个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是550个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是500个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是400个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是300个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是200个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是150个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度小于100个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是250，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，90，80，70，60，50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21或20个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少20个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少40个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少50个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少70个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少100个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少200个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少300个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少400个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少500个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少600个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少700个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少1000个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少1500个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是至少2000个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是大约20个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是大约40个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是大约100个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是大约200个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是200个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是150个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是100个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂的长度是50个碱基对或更少。在某些实施例中，3’同源臂在长度上是250，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，90，80，70，60，50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21或20个碱基对。在某些实施例中，3’同源臂的长度是40个碱基对。5’和3’同源臂的长度可以相同，或可以不同。在某些实施例中，5’和3’同源臂被扩增以允许在靶核酸处定量评估基因编辑事件，如靶向整合。在某些实施例中，基因编辑事件的定量评估可依赖于通过在单个扩增反应中使用一对pcr引物扩增同源臂的全部或部分，从而在靶向整合位点扩增5’连接和3’连接。因此，尽管5’和3’同源臂的长度可能不同，但每个同源臂的长度应能够根据需要进行扩增(例如，使用pcr)。此外，当需要在单个pcr反应中扩增5’以及5’和3’同源臂的长度差异时，5’和3’同源臂之间的长度差异应允许使用一对pcr引物进行pcr扩增。在某些实施例中，5’和3’同源臂的长度差异不超过75个核苷酸。因此，在某些实施例中，当5’和3’同源臂长度不同时，同源臂之间的长度差异小于70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸或碱基对。在某些实施例中，5’和3’同源臂长度差异至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个核苷酸。在某些实施例中，5’和3’同源臂之间的长度差异至少为70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个碱基对。在某些实施例中，5’和3’同源臂长度差异至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个碱基对。本披露的供体模板设计用于促进与具有切割位点的靶核酸的同源重组，其中靶核酸从5’到3’包含，p1--h1--x--h2--p2，其中p1是第一引发位点；h1是第一同源臂；x是切割位点；h2是第二同源臂；并且p2是第二引发位点；并且其中供体模板从5’至3’包含，a1--p2’--n--a2，或a1--n--p1’--a2，其中a1是基本上与h1相同的同源臂；其中p2’是基本上与p2相同的引发位点；n是负荷；其中p1’是基本上与p1相同的引发位点；并且a2是基本上与h2相同的同源臂。在某些实施例中，靶核酸是双链的。在某些实施例中，靶核酸包含第一链和第二链。在另一个实施例中，靶核酸是单链的。在某些实施例中，靶核酸包含第一链。在某些实施例中，供体模板从5’至3’包含，a1--p2’--n--a2。在某些实施例中，供体模板从5’至3’包含，a1--p2’--n--p1’--a2。在某些实施例中，靶核酸从5’至3’包含，p1--h1--x--h2--p2，其中p1是第一引发位点；h1是第一同源臂；x是切割位点；h2是第二同源臂；并且p2是第二引发位点；并且供体模板的第一链从5’至3’包含，a1--p2’--n--a2，或a1--n--p1’--a2，其中a1是基本上与h1相同的同源臂；其中p2’是基本上与p2相同的引发位点；n是负荷；其中p1’是基本上与p1相同的引发位点；并且a2是基本上与h2相同的同源臂。在某些实施例中，供体模板的第一链从5’至3’包含，a1--p2’--n--p1’--a2。在某些实施例中，供体模板的第一链从5’至3’包含，a1--n--p1’--a2。在某些实施例中，a1的长度是700个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度是650个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度是600个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度是550个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度是500个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度是400个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度是300个碱基对或更少。在某些实施例中，a1的长度小于250个碱基对。在某些实施例中，a1的长度小于200个碱基对。在某些实施例中，a1的长度小于150个碱基对。在某些实施例中，a1的长度小于100个碱基对。在某些实施例中，a1的长度小于50个碱基对。在某些实施例中、a1的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个碱基对。在某些实施例中，a1的长度是40个碱基对。在某些实施例中，a1的长度是30个碱基对。在某些实施例中，a1的长度是20个碱基对。在某些实施例中，a2的长度是700个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是650个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是600个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是550个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是500个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是400个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是300个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度小于250个碱基对。在某些实施例中，a2的长度小于200个碱基对。在某些实施例中，a2的长度小于150个碱基对。在某些实施例中，a2的长度小于100个碱基对。在某些实施例中，a2的长度小于50个碱基对。在某些实施例中、a2的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个碱基对。在某些实施例中，a2的长度是40个碱基对。在某些实施例中，a2的长度是30个碱基对。在某些实施例中，a2的长度是20个碱基对。在某些实施例中，a1的长度是700个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度是650个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度是600个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度是550个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度是500个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度是400个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度是300个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1的长度小于250个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度小于200个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度小于150个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度小于100个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度小于50个核苷酸。在某些实施例中、a1的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度是至少40个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度是至少30个核苷酸。在某些实施例中，a1的长度是至少20个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度是700个核苷酸或更少。在某些实施例中，a2的长度是650个碱基对或更少。在某些实施例中，a2的长度是600个核苷酸或更少。在某些实施例中，a2的长度是550个核苷酸或更少。在某些实施例中，a2的长度是500个核苷酸或更少。在某些实施例中，a2的长度是400个核苷酸或更少。在某些实施例中，a2的长度是300个核苷酸或更少。在某些实施例中，a2的长度小于250个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度小于200个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度小于150个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度小于100个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度小于50个核苷酸。在某些实施例中、a2的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度是至少40个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度是至少30个核苷酸。在某些实施例中，a2的长度是至少20个核苷酸。在某些实施例中，a1的核酸序列基本上与h1的核酸序列相同。在某些实施例中，a1具有与h1相同或差异不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的序列。在某些实施例中，a1具有与h1相同或包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对的序列。在某些实施例中，a2的核酸序列基本上与h2的核酸序列相同。在某些实施例中，a2具有与h2相同或差异不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的序列。在某些实施例中，a2具有与h2相同或包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对的序列。不论使用何种形式，供体模板都可以设计为避免不期望的序列。在某些实施例中，可以缩短一个或两个同源臂以避免与某些序列重复元件(例如，alu重复、line元件等)重叠。引发位点本文所述的供体模板包含至少一个引发位点，其序列基本上与靶核酸内的引发位点的序列类似或相同，但相对于供体模板中的同源序列/同源臂具有不同的空间顺序或空间取向。当供体模板与靶核酸同源重组时，一个或多个引发位点有利地并入靶核酸，从而允许扩增产生自重组事件的经修饰的核酸序列的一部分。在某些实施例中，供体模板包含至少一个引发位点。在某些实施例中，供体模板包含第一和第二引发位点。在某些实施例中，供体模板包含三个或更多个引发位点。在某些实施例中，供体模板包含引发位点p1’，其基本上与靶核酸内的引发位点p1类似或相同，其中在靶核酸处整合供体模板后，p1’并入在p1下游。在某些实施例中，供体模板包含第一引发位点p1’和第二引发位点p2’；其中，p1’基本上与靶核酸内的第一引发位点p1类似或相同；其中，p2’基本上与靶核酸内的第二引发位点p2类似或相同；并且其中p1和p2基本上不类似或不相同。在某些实施例中，供体模板包含第一引发位点p1’和第二引发位点p2’；其中，p1’基本上与靶核酸内的第一引发位点p1类似或相同；其中，p2’基本上与靶核酸内的第二引发位点p2类似或相同；其中p2位于靶核酸上p1的下游；其中p1和p2基本上不类似或不相同；并且其中，在靶核酸处整合供体模板时，p1’并入在p1下游。p2’并入在p2上游，并且p2’并入在p1上游。在某些实施例中，靶核酸包含第一引发位点(p1)和第二引发位点(p2)。靶核酸中的第一引发位点可以在第一同源臂内。可替代地，靶核酸中的第一引发位点可以在5’且邻近第一同源臂。靶核酸中的第二引发位点可以在第二同源臂内。可替代地，靶核酸中的第二引发位点可以在3’且邻近第二同源臂。供体模板可以包含负荷序列、第一引发位点(p1’)、和第二引发位点(p2’)，其中p2’位于负荷序列的5’，其中p1’位于负荷序列的3’(即，a1--p2’--n--p1’--a2)，其中p1’基本上与p1相同，并且其中p2’基本上与p2相同。在这种情况下，包含靶向p1’和p1的寡核苷酸的引物对和包含p2’和p2的寡核苷酸可用于扩增靶基因座，从而产生三个大小类似的扩增子，所述扩增子可以被测序以确定是否发生靶向整合。第一扩增子，扩增子x，产生自p1和p2之间的核酸序列的扩增，这是靶核酸的非靶向整合的结果。第二扩增子，扩增子y，产生自靶核酸处靶向整合事件后p1和p2’之间的核酸序列扩增，从而扩增5’连接。第三扩增子，扩增子z，产生自靶核酸处靶向整合事件后p1’和p2之间的核酸序列扩增，从而扩增3’连接。在其他实施例中，p1’可以与p1相同。此外，p2’可以与p2相同。在某些实施例中，供体模板包含负荷和引发位点(p1’)，其中p1’位于负荷核酸序列(rnpa1--n--p1’--a2)的3’，并且p1’基本上与p1相同。在这种情况下，包含靶向p1’和p1的寡核苷酸的引物对和靶向p2的寡核苷酸可用于扩增靶基因座，从而产生两个大小类似的扩增子，所述扩增子可以被测序以确定是否发生靶向整合。第一扩增子，扩增子x，产生自p1和p2之间的核酸序列的扩增，这是靶核酸的非靶向整合的结果。第二扩增子，扩增子z，产生自靶核酸处靶向整合事件后p1’和p2之间的核酸序列扩增，从而扩增3’连接。在其他实施例中，p1’可以与p1相同。此外，p2’可以与p2相同。在某些实施例中，靶核酸包含第一引发位点(p1)和第二引发位点(p2)，并且供体模板包含引发位点p2’，其中p2’位于负荷核酸序列(即a1--p2’--n--a2)的5’，并且p2’与p2基本相同。在这种情况下，包含靶向p2’和p2的寡核苷酸的引物对和靶向p1的寡核苷酸可用于扩增靶基因座，从而产生两个大小类似的扩增子，所述扩增子可以被测序以确定是否发生靶向整合。第一扩增子，扩增子x，产生自p1和p2之间的核酸序列的扩增，这是靶核酸的非靶向整合的结果。第二扩增子，扩增子y，产生自靶核酸处靶向整合事件后p1和p2’之间的核酸序列扩增，从而扩增5’连接。在其他实施例中，p1’可以与p1相同。此外，p2’可以与p2相同。供体模板的引发位点可以是任何长度，其允许通过扩增和/或对靶核酸的一部分进行测序来定量评估靶核酸处的基因编辑事件。例如，在某些实施例中，靶核酸包含第一引发位点(p1)并且供体模板包含引发位点(p1’)。在这些实施例中，p1’引发位点和p1引物位点的长度使得单个引物可以特异性退火到两个引发位点(例如，在某些实施例中，p1’引发位点和p1引发位点的长度使得两者具有相同或非常相似的gc含量)。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度是60个核苷酸。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于60个核苷酸。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于50个核苷酸。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于40个核苷酸。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于30个核苷酸。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度是60个碱基对。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于60个碱基对。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于50个碱基对。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于40个碱基对。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度小于30个碱基对。在某些实施例中，供体模板的引发位点的长度是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碱基对。在某些实施例中，在靶核酸中切割位点处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p1)的第一引发位点与现在整合的p2’引发位点之间的距离是600个碱基对或更少。在某些实施例中，在切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p1)的第一引发位点与现在整合的p2’引发位点之间的距离是550、500、450、400、350、300、250、200、150个碱基对或更少。在某些实施例中，在靶核酸处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p1)的第一引发位点与现在整合的p2’引发位点之间的距离是600个核苷酸或更少。在某些实施例中，在靶核酸处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p1)的第一引发位点与现在整合的p2’引发位点之间的距离是550、500、450、400、350、300、250、200、150个核苷酸或更少。在某些实施例中，靶核酸包含第二引发位点(p2)并且供体模板包含基本上与p2相同的引发位点(p2’)。在某些实施例中，在靶核酸处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p2)的第二引发位点与现在整合的p1’引发位点之间的距离是600个碱基对或更少。在某些实施例中，在靶核酸处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p2)的第二引发位点与现在整合的p1’引发位点之间的距离是550、500、450、400、350、300、250、200、150个碱基对或更少。在某些实施例中，在靶核酸处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p2)的第二引发位点与现在整合的p1’引发位点之间的距离是600个核苷酸或更少。在某些实施例中，在靶核酸处的切割事件拆分以及供体模板与靶核酸的同源重组后，靶核酸(p2)的第二引发位点与现在整合的p1’引发位点之间的距离是550、500、450、400、350、300、250、200、150个核苷酸或更少。在某些实施例中，p2’的核酸序列包含在a1的核酸序列内。在某些实施例中，p2’的核酸序列紧邻a1的核酸序列。在某些实施例中，p2’的核酸序列紧邻n的核酸序列。在某些实施例中，p2’的核酸序列包含在n的核酸序列内。在某些实施例中，p1’的核酸序列包含在a2的核酸序列内。在某些实施例中，p1’的核酸序列紧邻a2的核酸序列。在某些实施例中，p1’的核酸序列紧邻n的核酸序列。在某些实施例中，p1’的核酸序列包含在n的核酸序列内。在某些实施例中，p2’的核酸序列包含在s1的核酸序列内。在某些实施例中，p2’的核酸序列紧邻s1的核酸序列。在某些实施例中，p1’的核酸序列包含在s2的核酸序列内。在某些实施例中，p1’的核酸序列紧邻s2的核酸序列。负荷本文所述的基因编辑系统的供体模板包含负荷(n)。为了实现希望的结果，负荷可以是所需的任何长度。例如，负荷序列的长度可以小于2500个碱基对或小于2500个核苷酸。在其他实施例中，负荷序列可以是12kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是10kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是7kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是5kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是4kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是3kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是2kb或更少。在其他实施例中，负荷序列可以是1kb或更少。在某些实施例中，负荷的长度可以在约5-10kb之间。在另一个实施例中，负荷的长度可以在约1-5kb之间。在另一个实施例中，负荷的长度可以在约0-1kb之间。例如，在示例性实施例中，负荷的长度可以是约1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100个碱基对或核苷酸。在其他示例性实施例中，负荷的长度可以是约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个碱基对或核苷酸。本领域技术人员将容易地确定当供体模板使用大小限制的递送运载体(例如，病毒递送运载体，如腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、整合缺陷型慢病毒(idlv)或单纯疱疹病毒(hsv)递送运载体)递送时，供体模板(包括负荷)的大小不应超过递送系统的大小限制。在某些实施例中，负荷包含替代序列。在某些实施例中，负荷包含基因序列的外显子。在某些实施例中，负荷包含基因序列的内含子。在某些实施例中，负荷包含cdna序列。在某些实施例中，负荷包含转录调控元件。在某些实施例中，负荷包含替代序列的反向互补序列、基因序列的外显子、基因序列的内含子、cdna序列或转录调控元件。在某些实施例中，负荷包含替代序列的部分、基因序列的外显子、基因序列的内含子、cdna序列或转录调控元件。在某些实施例中，负荷是转基因序列。在某些实施例中，负荷将缺失引入靶核酸。在某些实施例中，负荷包含外源序列。在其他实施例中，负荷包含内源序列。供体模板中的替代序列已描述于其他文献中，包括cotta-ramusino等人中。替代序列可以是任何适宜长度(如果所需修复结果是缺失，那么包括0个核苷酸)，并且相对于需要编辑的细胞内的天然存在的序列，典型地包括1、2、3或更多个序列修饰。一种常见序列修饰涉及改变天然存在的序列以修复突变，所述突变与需要治疗的疾病或病症相关。另一常见序列修饰涉及改变一个或多个序列，所述序列与rna指导的核酸酶的pam序列或用于产生ssb或dsb的一个或多个grna的靶向结构域互补或编码所述pam序列或靶向结构域，以在将替代序列并入靶位点中之后减少或消除靶位点的重复裂解。基于要编辑的细胞类型、靶核酸和要实现的效果，可以为给定应用选择特定的负荷。例如，在某些实施例中，可能需要在靶细胞中在选定的染色体基因座处“敲入”所需的基因序列。在这种情况下，负荷可以包含所需的基因序列。在某些实施例中，基因序列编码所需的蛋白质，例如，外源蛋白、同源蛋白或内源蛋白或其组合。在某些实施例中，负荷可以含有野生型序列，或者包含相对于野生型序列的一个或多个修饰的序列。例如，在希望校正细胞中靶基因突变的实施例中，负荷可以设计为将野生型序列恢复到靶蛋白。在其他实施例中，可能还令人希望的是“敲除”靶细胞中所选择的染色体基因座处的基因序列。在这种情况下，负荷可以被设计成在干扰靶基因序列的表达的位点处(例如在靶基因序列的编码区，或者在靶基因序列的表达控制区(例如，靶基因序列的启动子或增强子))整合。在其他实施例中，负荷可被设计为破坏靶基因序列。例如，在某些实施例中，负荷可将缺失、插入、终止密码子或移码突变引入靶核酸。在某些实施例中，供体被设计为缺失靶核酸序列的全部或部分。在某些实施例中，供体的同源臂可设计成侧接所需的缺失位点。在某些实施例中，供体不含有同源臂之间的负荷序列，导致供体的靶向整合后位于同源臂之间的靶核酸部分缺失。在其他实施例中，供体含有与靶核酸同源的负荷序列，其中靶核酸序列的一个或多个核苷酸不存在于负荷中。在供体的靶向整合后，靶核酸将包含在负荷序列中不存在的残基处的缺失。缺失的大小可以基于靶核酸的大小和所需效果来选择。在某些实施例中，供体被设计为在靶向整合后在靶核酸中引入1-2000个核苷酸的缺失。在某些实施例中，供体被设计为在靶向整合后在靶核酸中引入1-1000个核苷酸的缺失。在某些实施例中，供体被设计为在靶向整合后在靶核酸中引入1-500个核苷酸的缺失。在某些实施例中，供体被设计为在靶向整合后在靶核酸中引入1-100个核苷酸的缺失。在示例性实施例中，供体被设计为在靶向整合后在靶核酸中引入约2000、1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸的缺失。在其他实施例中，供体被设计为在靶向整合后引入靶核酸的超过2000个核苷酸的缺失，例如，约2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个核苷酸或更多个的缺失。在某些实施例中，负荷可以包含启动子序列。在其他实施例中，负荷被设计为在靶细胞内源启动子控制下的位点处整合。在某些实施例中，编码外源或同源蛋白或多肽的负荷可整合到编码蛋白质的染色体序列中，使得染色体序列失活，但表达外源序列。在其他实施例中，负荷序列可以整合到染色体序列而不改变染色体序列的表达。这可以通过在“安全港”基因座(如rosa26基因座、hprt基因座或aav基因座)处整合负荷来实现。在某些实施例中，负荷编码与疾病或障碍相关的蛋白质。在某些实施例中，负荷可以编码蛋白质的野生型形式，或被设计以恢复蛋白质的野生型形式的表达，其中所述蛋白质在患有疾病或障碍的受试者中缺乏。在其他实施例中，负荷编码与疾病或病症相关的蛋白质，其中由负荷编码的蛋白质包含至少一种修饰，使得所述蛋白质的改变版本预防疾病或障碍的发展。在其他实施例中，负荷编码包含至少一种修饰的蛋白质，使得所述蛋白质的改变版本引起或加重疾病或障碍。在某些实施例中，负荷可用于将来自一个物种的基因插入到不同物种的基因组中。例如，“人源化”动物模型和/或“人源化”动物细胞可以通过将人类基因靶向整合到非人类动物物种(例如小鼠、大鼠或非人类灵长类物种)的基因组中来生成。在某些实施例中，此类人源化动物模型和动物细胞含有编码一种或多种人类蛋白质的整合序列。在另一个实施例中，负荷编码赋予植物物种(包括作物，如谷物、水果或蔬菜)益处的蛋白质。例如，负荷可以编码蛋白质，所述蛋白质允许植物在较高的温度下栽培，在收获后具有延长的贮存期限，或赋予植物抗病性。在某些实施例中，负荷可编码赋予对疾病或害虫抗性的蛋白质(参见，例如，jones等人(1994)science[科学]266:789(cloningofthetomatocf-9geneforresistancetocladosporiumfulvum[对黄枝孢霉的抗性的番茄cf-9基因的克隆])；martin等人(1993)science[科学]262:1432；mindrinos等人(1994)cell[细胞]78:1089(rsp2geneforresistancetopseudomonassyringae[对丁香假单胞菌的抗性的rsp2基因])；pct国际专利公开号wo96/30517(resistancetosoybeancystnematode[大豆囊胞线虫的抗性])。在其他实施例中，负荷可编码编码对除草剂抗性的蛋白质，如us2013/0326645a1中所述，其全部内容通过引用并入本文。在另一个实施例中，负荷编码赋予植物细胞价值增加的性状的蛋白质，例如且不限于：修饰的脂肪酸代谢，降低的植酸酯含量，和例如，通过用编码改变淀粉分枝型式的酶的基因转化植物而影响的修饰的碳水化合物组成(参见，例如，shiroza等人(1988)j.bacteol.[细菌学杂志]170:810(nucleotidesequenceofstreptococcusmutantfructosyltransferasegene[链球菌果糖基转移酶突变基因的核苷酸序列])；steinmetz等人(1985)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]20:220(levansucrasegene[果聚糖合酶基因])；pen等人(1992)bio/technology[生物/技术]10:292(α-amylase[α-淀粉酶])；elliot等人(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21:515(nucleotidesequencesoftomatoinvertasegenes[番茄转化酶基因的核苷酸序列])；sogaard等人(1993)j.biol.chem.[生物化学杂志]268:22480(barleyα-amylasegene[大麦α-淀粉酶基因])；和fisher等人(1993)plantphysiol.[植物生理学]102:1045(maizeendospermstarchbranchingenzymeii[玉米胚乳淀粉分枝酶ii]))。us2013/0326645a1中描述了可用于在植物细胞中靶向整合的其他示例性负荷，其全部内容通过引用并入本文。基于要编辑的细胞类型、靶核酸和要实现的效果，技术人员可以为给定应用选择其他负荷。填充物在某些实施例中，供体模板可任选地包含一个或多个填充序列。通常，填充序列是异源或随机核酸序列，其被选择以(a)促进(或不抑制)靶向整合本披露的供体模板到靶位点，以及随后根据本披露的某些方法扩增包含填充序列的扩增子，但是(b)以避免驱动整合供体模板到另一位点。例如，填充序列可以定位在同源臂a1和引物位点p2’之间，以调节当供体模板序列整合到靶位点时生成的扩增子的大小。作为一个实例，可以使用此类大小调节来平衡由整合的和非整合的靶位点产生的扩增子的大小，并因此平衡在单个pcr反应中产生的每个扩增子的效率；这又可以促进基于反应混合物中两个扩增子的相对丰度来定量评估靶向整合的速率。为了促进靶向整合和扩增，可选择填充序列以最小化二级结构的形成，所述二级结构可能会干扰通过dna修复机机制(例如，经由同源重组)进行的切割位点的拆分或可能干扰扩增。在某些实施例中，供体模板从5’至3’包含，a1--s1--p2’--n--a2，或a1--n--p1’--s2--a2；其中s1是第一填充序列，并且s2是第二填充序列。在某些实施例中，供体模板从5’至3’包含，a1--s1--p2’--n--p1’--s2--a2，其中s1是第一填充序列，并且s2是第二填充序列。在某些实施例中，填充序列包含与整个细胞基因组大约相同的鸟嘌呤胞嘧啶含量(“gc含量”)。在某些实施例中，填充序列包含与靶基因座大约相同的gc含量。例如，当靶细胞是人类细胞时，填充序列包含约40％的gc含量。在某些实施例中，填充器序列可以通过生成包含所需gc含量的随机核酸序列的序列来设计。例如，为了生成包含40％gc含量的填充序列，可以设计具有以下核苷酸分布的核酸序列：a＝30％，t＝30％，g＝20％，c＝20％。用于测定基因组的gc含量或靶基因座的gc含量的方法是本领域技术人员已知的。因此，在某些实施例中，填充序列包含20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％60％、65％、70％或75％的gc含量。本文提供具有40％±5％gc含量的示例性2.0千碱基填充序列，如seqidno:23-123所示。在某些实施例中，第一填充物具有包含seqidno:23-123所示的至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475或至少500个核苷酸序列的序列。在另一个实施例中，第二填充物具有包含seqidno:23-123所示的至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475或至少500个核苷酸序列的序列。优选的是填充序列不干扰靶核酸处切割位点的拆分。因此，填充序列应该与靶核酸切割位点处的核酸序列具有最小的序列同一性。在某些实施例中，填充序列与来自靶核酸切割位点的500、450、400、350、300、250、200、150、100、50个核苷酸内的任何核酸序列具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，填充序列与来自靶核酸切割位点的500、450、400、350、300、250、200、150、100、50个碱基对内的任何核酸序列具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。为了避免脱靶分子重组事件，优选的是填充序列与靶细胞基因组中的核酸序列具有最小的同源性。在某些实施例中，填充序列与靶细胞基因组中的核酸具有最小的序列同一性。在某些实施例中，填充序列与靶细胞基因组中相同长度(如以碱基对或核苷酸测量的)的任何核酸序列具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，填充序列的20个碱基对段与靶细胞基因组的任何至少20个碱基对段的核酸具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，填充序列的20个核苷酸段与靶细胞基因组的任何至少20个核苷酸段的核酸具有小于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，填充序列与供体模板中的核酸序列(例如，负荷的核酸序列，或供体模板中存在的引发位点的核酸序列)具有最小的序列同一性。在某些实施例中，填充序列与供体模板中相同长度(如以碱基对或核苷酸测量的)的任何核酸序列具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，填充序列的20个碱基对段与供体模板的任何20个碱基对段的核酸具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，填充序列的20个核苷酸段与供体模板的任何20个核苷酸段的核酸具有小于80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％的同一性。在某些实施例中，第一同源臂及其邻近填充序列(即a1+s1)的长度大约等于第二同源臂及其邻近填充序列(即a2+s2)的长度。例如，在某些实施例中，a1+s1的长度与a2+s2的长度相同(如以碱基对或核苷酸测定的)。在某些实施例中，a1+s1的长度与a2+s2的长度差异25个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1+s1的长度与a2+s2的长度差异24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸或更少。在某些实施例中，a1+s1的长度与a2+s2的长度差异25个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+s1的长度与a2+s2的长度差异24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+h1的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+h1的长度是200个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+h1的长度是150个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+h1的长度是100个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+h1的长度是50个碱基对或更少。在某些实施例中，a1+h1的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个碱基对。在某些实施例中，a1+h1的长度是40个碱基对。在某些实施例中，a2+h2的长度是250个碱基对或更少。在某些实施例中，a2+h2的长度是200个碱基对或更少。在某些实施例中，a2+h2的长度是150个碱基对或更少。在某些实施例中，a2+h2的长度是100个碱基对或更少。在某些实施例中，a2+h2的长度是50个碱基对或更少。在某些实施例中，a2+h2的长度是250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个碱基对。在某些实施例中，a2+h2的长度是40个碱基对。在某些实施例中，a1+s1的长度与h1+x+h2的长度相同(如以核苷酸或碱基对测定的)。在某些实施例中，a1+s1的长度与h1+x+h2的长度差异小于25个核苷酸。在某些实施例中，a1+s1的长度与h1+x+h2的长度差异24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。在某些实施例中，a1+s1的长度与h1+x+h2的长度差异小于25个碱基对。在某些实施例中，a1+s1的长度与h1+x+h2的长度差异24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基对。在某些实施例中，a2+s2的长度与h1+x+h2的长度相同(如以核苷酸或碱基对测定的)。在某些实施例中，a2+s2的长度与h1+x+h2的长度差异小于25个核苷酸。在某些实施例中，a2+s2的长度与h1+x+h2的长度差异24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。在某些实施例中，a2+s2的长度与h1+x+h2的长度差异小于25个碱基对。在某些实施例中，a2+s2的长度与h1+x+h2的长度差异24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基对。靶细胞根据本披露的基因组编辑系统可以用于操作或修饰细胞，例如以编辑或修饰靶核酸。在各个实施例中，操作可在体内进行或离体进行。可以根据本披露的实施例操作或修饰多种细胞类型，并且在一些情形中，例如在体内应用中，例如通过将根据本披露的基因组编辑系统递送至多个细胞类型来修饰或操作多个细胞类型。然而，在其他情形中，可能需要将操作或修饰限制于特定的一个或多个细胞类型。例如，在一些情况下可能需要编辑具有有限分化潜力的细胞或最终分化细胞，例如在maeder情形中的感光细胞，其中预期基因型的修饰会导致细胞表型变化。然而，在其他情形中，可能需要编辑分化程度较低的、多潜能或多能性的干细胞或祖细胞。举例来说，细胞可以是胚胎干细胞、诱导型多能干细胞(ipsc)、造血干细胞/祖细胞(hspc)或其他干细胞或祖细胞类型，其分化为与给定应用或适应证相关的细胞类型在某些实施例中，被操作的细胞是真核细胞。例如，但并非进行限制，细胞是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物、山羊、猪、鸟、鸡、火鸡、牛、马、绵羊、鱼、灵长类动物或人类细胞。在某些实施例中，被操作的细胞是体细胞、生殖细胞或产前细胞。在某些实施例中，被操作的细胞是合子细胞、囊胚细胞、胚细胞、干细胞、有丝分裂感受态细胞或减数分裂感受态细胞。在某些实施例中，被操作的细胞不是人类胚胎的一部分。在某些实施例中，被操作的细胞是t细胞、cd8+t细胞，cd8+天然t细胞、cd4+中枢记忆t细胞、cd8+中枢记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+t细胞、cd4+干细胞记忆t细胞、cd8+干细胞记忆t细胞、cd4+辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4+天然t细胞、th17cd4+t细胞、th1cd4+t细胞、th2cd4+t细胞、th9cd4+t细胞、cd4+foxp3+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞、cd4+cd25+cd127-foxp3+t细胞。在某些实施例中，所述操作的细胞是长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、淋巴样祖细胞、髓样祖细胞、普通髓样祖细胞、红系祖细胞、巨核细胞红系祖细胞、视网膜细胞、感光细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜色素上皮细胞、小梁细胞、耳蜗毛细胞、外毛细胞、内毛细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺上皮祖细胞、横纹肌细胞、心肌细胞、肌卫星细胞、神经元、神经元干细胞、间充质干细胞、诱导型多能干细胞(ips)、胚胎干细胞、单核细胞、巨核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、网织红细胞、b细胞，例如祖代b细胞、前b细胞、prob细胞、记忆b细胞、血浆b细胞、胃肠上皮细胞、胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞、肠干细胞、肝细胞、肝星形细胞、库普弗细胞、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胰岛细胞(例如，β细胞、α细胞、δ细胞)、胰腺外分泌细胞、施旺细胞或少突胶质细胞。在某些实施例中，被操作的细胞是植物细胞，例如，单子叶细胞或双子叶细胞。在某些实施例中，靶细胞是循环血细胞，例如，网织红细胞、巨核细胞红系祖细胞(mep)、髓样祖细胞(cmp/gmp)、淋巴样祖细胞(lp)、造血干细胞/祖细胞(hsc)、或内皮细胞(ec)。在某些实施例中，靶细胞是骨髓细胞(例如，网织红细胞、红系细胞(例如，成红细胞)、mep细胞、髓样祖细胞(cmp/gmp)、lp细胞、红系祖细胞(ep)、hsc、多能祖细胞(mpp)、内皮细胞(ec)、造血内皮细胞(he)、或间充质干细胞)。在某些实施例中，靶细胞是髓样祖细胞(例如，普通髓样祖细胞(cmp)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子祖细胞(gmp))。在某些实施例中，靶细胞是淋巴样祖细胞，例如，淋巴共同祖细胞(clp)。在某些实施例中，靶细胞是红系祖细胞(例如，mep细胞)。在某些实施例中，靶细胞是造血干细胞/祖细胞(例如，长期hsc(lt-hsc)、短期hsc(st-hsc)、mpp细胞、或谱系限制性祖细胞(lrp))。在某些实施例中，靶向细胞是cd34+细胞、cd34+cd90+细胞、cd34+cd38-细胞、cd34+cd90+cd49f+cd38-cd45ra-细胞、cd105+细胞、cd31+、或cd133+细胞、或cd34+cd90+cd133+细胞。在某些实施例中，靶向细胞是脐血cd34+hspc、脐带静脉内皮细胞、脐带动脉内皮细胞、羊水cd34+细胞、羊水内皮细胞、胎盘内皮细胞或胎盘造血cd34+细胞。在某些实施例中，靶细胞是动员的外周血造血cd34+细胞(在患者用动员剂例如，g-csf或普乐沙福(plerixafor)治疗之后)。在某些实施例中，靶向细胞是外周血内皮细胞。作为推论，根据所靶向的一种或多种细胞类型和/或所需编辑结果，所修饰或操作的细胞不同地为分裂细胞或非分裂细胞。在离体操作或修饰细胞时，细胞可以立即使用(例如，施用给受试者)，或可以维持或储存细胞以供将来使用。本领域技术人员将了解，可以使用本领域已知的任何适合的方法将细胞维持在培养中或储存(例如冷冻于液氮中)。基因组编辑系统的实施方式：递送、配制和施用途径如上文所讨论的，本披露的基因组编辑系统可以用任何适宜方式来实施，意味着此类系统的组分(包括但不限于rna指导的核酸酶、grna和可选供体模板核酸)可以用任何适宜形式或形式的组合来递送、配制或施用，从而在细胞、组织或受试者中导致基因组编辑系统的转导、表达或引入和/或引起所需的修复结果。表10和11展示基因组编辑系统实施方式的若干非限制性实例。但本领域技术人员将了解，这些列表不是综合性的，并且其他实施是可能的。尤其参照表10，该表列示包含单一grna和任选供体模板的基因组编辑系统的若干示例性实施方式。然而，根据本披露的基因组编辑系统可以并入多个grna、多个rna指导的核酸酶以及其他组分，例如蛋白质，并且基于该表中所示的原理，多种实施将为技术人员所了解。在该表中，[n/a]指示，基因组编辑系统不包括所指示的组分。表10表11总结了用于如本文所述的基因组编辑系统的组分的各种递送方法。同样，该列表旨在是示例性而不是限制性的。表11基因组编辑系统的基于核酸的递送可以通过本领域已知的方法或如本文所述将编码根据本披露的基因组编辑系统的各种元件的核酸施用于受试者或递送至细胞。例如，可以通过例如载体(例如，病毒或非病毒载体)、非载体基方法(例如，使用裸dna或dna复合物)或其组合递送编码rna指导的核酸酶的dna和/或编码grna的dna、以及供体模板核酸。编码基因组编辑系统或其组分的核酸可以作为裸dna或rna直接递送至细胞，例如借助转染或电穿孔来递送，或者可以缀合至促进靶细胞(例如，红血球、hsc)摄取的分子(例如，n-乙酰半乳糖胺)。也可以使用核酸载体，如表11中总结的载体。核酸载体可以包含编码基因组编辑系统组分(例如rna指导的核酸酶、grna和/或供体模板)的一个或多个序列。载体还可以包含编码信号肽(例如，用于核定位、核仁定位或线粒体定位)的序列，其与编码蛋白质的序列缔合(例如插入其中或与其融合)。作为一个实例，核酸载体可以包括cpf1编码序列，其包括一个或多个核定位序列(例如，来自sv40的核定位序列)。核酸载体还可以包括任何适合数目的调节/控制元件，例如，启动子、增强子、内含子、多聚腺苷酸化信号、科扎克(kozak)共有序列或内部核糖体进入位点(ires)。这些元件为本领域中所熟知，并且描述于cotta-ramusino等人中。根据本披露的核酸载体包括重组病毒载体。示例性病毒载体展示于表11中，并且其他适合的病毒载体以及其使用和产生描述于cotta-ramusino等人中。还可以使用本领域已知的其他病毒载体。另外，可以使用病毒颗粒来递送呈核酸和/或肽形式的基因组编辑系统组分。例如，可以组装“空”病毒颗粒以含有任何适宜负荷。病毒载体和病毒颗粒也可以经工程化以并入靶向配体，从而改变靶组织特异性。除了病毒载体以外，可以使用非病毒载体来递送编码根据本披露的基因组编辑系统的核酸。非病毒核酸载体的一个重要分类是纳米颗粒，其可以是有机的或无机的。纳米颗粒为本领域所熟知，并且概述于cotta-ramusino等人中。可以使用任何适宜的纳米颗粒设计来递送基因组编辑系统组分或编码此类组分的核酸。例如，在本披露的某些实施例中，有机(例如，脂质和/或聚合物)纳米颗粒可以适合用作递送运载体。用于纳米颗粒配制品和/或基因转移的示例性脂质显示于表12中，并且表13列示用于基因转移和/或纳米颗粒配制品的示例性聚合物。表12.用于基因转移的脂质表13.用于基因转移的聚合物非病毒载体任选地包括靶向修饰以改进摄取和/或选择性靶向某些细胞类型。这些靶向修饰可以包括例如细胞特异性抗原、单克隆抗体、单链抗体、适体、聚合物、糖(例如，n-乙酰半乳糖胺(galnac))和细胞穿透肽。此类载体还任选地使用致融性和核内体去稳定肽/聚合物，经历酸触发的构象变化(例如，加速负荷的核内体逃逸)，和/或并入刺激可裂解的聚合物，例如用于在细胞区室中释放。例如，可以使用在还原性细胞环境中裂解的基于二硫化物的阳离子型聚合物。在某些实施例中，除了基因组编辑系统的组分(例如，本文所述的rna指导的核酸酶组分和/或grna组分)以外，递送一种或多种核酸分子(例如，dna分子)。在某些实施例中，该核酸分子是与基因组编辑系统的一个或多个组分同时递送。在某些实施例中，所述核酸分子是在递送基因组编辑系统的一个或多个组分之前或之后(例如，小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周或4周)递送。在某些实施例中，所述核酸分子是通过与递送基因组编辑系统的一个或多个组分(例如，rna指导的核酸酶组分和/或grna组分)不同的方式来递送。该核酸分子可以通过本文所述的任何递送方法来递送。例如，核酸分子可以通过病毒载体(例如，整合缺陷型慢病毒)来递送，并且rna指导的核酸酶分子组分和/或grna组分可以通过电穿孔来递送，例如，使得可以降低由核酸(例如，dna)引起的毒性。在某些实施例中，所述核酸分子编码治疗性蛋白质，例如，本文所述的蛋白质。在某些实施例中，所述核酸分子编码rna分子，例如，本文所述的rna分子。rnp和/或编码基因组编辑系统组分的rna的递送可以通过本领域已知的方法将rnp(grna与rna指导的核酸酶的复合物)和/或编码rna指导的核酸酶和/或grna的rna递送至细胞中或施用给受试者，其中一些方法描述于cotta-ramusino等人中。在体外，编码rna指导的核酸酶的和/或编码grna的rna可以通过例如显微注射、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压来递送(参见，例如，lee2012)。还可以使用脂质介导的转染、肽介导的递送、galnac或其他缀合物介导的递送和其组合进行体外和体内递送。在体外，经由电穿孔递送包含将细胞与编码rna指导的核酸酶和/或grna的rna(具有或不具有供体模板核酸分子)在盒、室或比色皿中混合，并且施加一个或多个限定持续时间和幅度的电脉冲。用于电穿孔的系统和方案为本领域中已知，并且任何适宜的电穿孔工具和/或方案可以结合本披露的各个实施例使用。示例性系统包括但不限于nucleofectortm技术(龙沙公司(lonza))，genepulserxcelltm(伯乐公司(biorad))，flowelectroporationtm转染系统(maxcyte公司)和neontm转染系统(赛默飞世尔公司(thermofisher))。施用途径可以通过任何适合的模式或途径(局部或全身)将基因组编辑系统或使用此类系统修饰或操作的细胞施用于受试者。全身施用模式包括口服和肠胃外途径。肠胃外途径包括例如静脉内、骨髓内、动脉内、肌内、真皮内、皮下、鼻内和腹膜内途径。全身施用的组分可以经修饰或配制以靶向例如hsc(造血干细胞/祖细胞)或红系祖细胞或前体细胞。局部施用模式包括例如骨髓内注射至骨小梁中或股骨内注射到髓隙中，以及输注至门静脉中。在某些实施例中，与全身施用(例如，静脉内)时相比，在局部施用(例如，直接施用至骨髓中)时，显著较少量的组分(与全身方法相比)可以发挥作用。局部施用模式可以降低或消除在全身性施用治疗有效量的组分时可能发生的潜在毒副作用的发生率。给予可以作为定期推注(例如静脉内)或作为持续输注从内部储库或从外部储库(例如从静脉内注射袋或可植入泵)提供。组分可以局部施用，例如，通过从持续释放药物递送装置中连续释放。另外，组分可以经配制以容许经延长时段释放。释放系统可以包括生物可降解材料或通过扩散释放所并入组分的材料的基质。所述组分可以在释放系统中均匀或者非均匀分配。多种释放系统可以是有用的，但适当系统的选择将取决于具体应用所需要的释放速率。不可降解和可降解的释放系统均可以被使用。适宜释放系统包括聚合物和聚合基质、非聚合基质或无机和有机赋形剂和稀释剂，例如但不限于碳酸钙和糖(例如，海藻糖)。释放系统可以是天然的或合成的。然而，合成释放系统是优选的，因为其通常更可靠、更具可重现性并且产生更明确的释放曲线。可以选择释放系统材料，使得具有不同分子量的组分是通过穿过材料扩散或通过材料降解而释放。代表性的合成生物可降解聚合物包括例如：聚酰胺，例如聚(氨基酸)和聚(肽)；聚酯，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(己内酯)；聚酸酐；聚原酸酯；聚碳酸酯；和其化学衍生物(取代、添加化学基团，例如，烷基、亚烷基、羟化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、共聚物和其混合物。代表性的合成非生物可降解聚合物包括例如：聚醚，例如聚(氧化乙烯)、聚(乙二醇)和聚(环氧丁烷)；乙烯基聚合物-聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，例如甲基、乙基、其他烷基、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸和其他，例如聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和聚(乙酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纤维素和其衍生物，例如烷基、羟烷基、醚、酯、硝化纤维素和各种醋酸纤维素；聚硅氧烷；和其任何化学衍生物(取代、添加化学基团，例如，烷基、亚烷基、羟化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、共聚物和其混合物。也可以使用聚(丙交酯共乙交酯)微球。典型地，微球是由乳酸和乙醇酸的聚合物构成，其经结构化以形成空心球体。球体的直径可以是约15-30微米，并且可以加载本文所述的组分。组分的多模或差别递送技术人员根据本披露将了解，本文所披露的基因组编辑系统的不同组分可以一起或分开并且同时或不同时递送。可能尤其期望基因组编辑系统组分的分开和/或异步递送以提供对基因组编辑系统功能的时间或空间控制并限制由其活性引起的某些效应。如本文所用，不同或差别模式是指递送模式，这些递送模式赋予受试组分分子(例如，rna指导的核酸酶分子、grna、模板核酸或有效负载)不同的药效学或药物代谢动力学特性。例如，递送的模式可以导致不同的组织分布，不同的半衰期、或不同的时间分布(例如，在选定的区室、组织、或器官中)。一些递送的模式(例如，通过例如通过自主复制或插入进细胞核酸中而持续存在于细胞、或细胞子代中的核酸载体的递送)导致组分更为持续的表达和存在。实例包括病毒(例如，aav或慢病毒)递送。举例来说，基因组编辑系统的组分(例如，rna指导的核酸酶和grna)可以通过在所递送组分在体内或在特定区室、组织或器官中的所得半衰期或持久性方面不同的模式进行递送。在某些实施例中，grna可以通过此类模式进行递送。rna指导的核酸酶分子组分可以通过导致在身体或特定区室或组织或器官中更低持久性或更少暴露的模式进行递送。更通常地，在某些实施例中，使用第一递送模式来递送第一组分，并且使用第二递送模式来递送第二组分。第一递送模式赋予第一药效学或药物代谢动力学特性。第一药效动力学特性可以是，例如，组分或编码该组分的核酸在体内、区室、组织、或器官中的分布、持久性、或暴露。第二递送模式赋予第二药效学或药物代谢动力学特性。第二药效动力学特性可以是，例如，组分或编码该组分的核酸在体内、区室、组织、或器官中的分布、持久性、或暴露。在某些实施例中，第一药效学或药物代谢动力学特性(例如，分布、持久性或暴露)比第二药效学或药物代谢动力学特性更受限。在某些实施例中，第一递送模式经选择以优化(例如，最小化)药效学或药物代谢动力学特性(例如，分布、持久性或暴露)。在某些实施例中，第二递送模式经选择以优化(例如，最大化)药效学或药物代谢动力学特性(例如，分布、持久性或暴露)。在某些实施例中，第一递送模式包含使用相对持久的元件，例如，核酸，例如，质粒或病毒载体，例如，aav或慢病毒。由于此类载体相对持久，从其转录的产物将相对持久。在某些实施例中，第二递送模式包含相对瞬时元件，例如，rna或蛋白质。在某些实施例中，第一组分包含grna，并且递送模式相对持久，例如，grna是从质粒或病毒载体(例如，aav或慢病毒)转录。这些基因的转录将具有极小生理学意义，因为这些基因不编码蛋白质产物，并且这些grna不能够单独起作用。第二组分(rna指导的核酸酶分子)是以瞬时方式递送，例如，作为mrna或作为蛋白质递送，从而确保完整的rna指导的核酸酶分子/grna复合物仅在短时段内存在并有活性。此外，这些组分可以不同的分子形式或用不同的互为补充以增强安全性和组织特异性的递送载体进行递送。差别递送模式的使用可以增强性能、安全性和/或功效，例如，可以减少最终脱靶修饰的可能性。通过较不持久的模式递送免疫原性组分(例如，cas9分子)可以降低免疫原性，因为来自细菌衍生的cas酶的肽通过mhc分子被展示在细胞表面上。两部分式递送系统可以改善这些缺点。差别递送模式可以用于将组分递送至不同但重叠的靶区域。在靶区域的重叠以外，活性复合物的形成被最小化。因此，在某些实施例中，第一组分(例如，grna)是通过第一递送模式进行递送，其导致第一空间(例如，组织)分布。第二组分(例如，rna指导的核酸酶分子)是通过第二递送模式进行递送，其导致第二空间(例如，组织)分布。在某些实施例中，第一模式包含选自脂质体、纳米颗粒(例如，聚合纳米颗粒)和核酸的第一元件，例如，病毒载体。第二模式包含选自该组的第二元件。在某些实施例中，第一递送模式包含第一靶向元件，例如，细胞特异性受体或抗体，并且第二递送模式不包括所述元件。在某些实施例中，第二递送模式包括第二靶向元件(例如，第二细胞特异性受体或第二抗体)。当在病毒递送载体、脂质体或聚合纳米颗粒中递送rna指导的核酸酶分子时，存在递送至多个组织并且在多个组织中具有治疗活性的可能性，但此时可能希望仅靶向单一组织。两部分式递送系统可以解决这一挑战并且增强组织特异性。如果将grna分子和rna指导的核酸酶分子包装于具有不同但重叠的组织向性的分开的递送运载体中，那么完全功能复合物仅在两种载体所靶向的组织中形成。示例性非限制性实施例a.在某些非限制性实施例中，本发明披露的主题提供了一种来自普雷沃菌属和弗朗西斯菌属1(cpf1)rna指导的核酸酶的分离的crispr，其包含核定位信号(nls)。a1.前述a的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶在所述核酸酶的n末端处或附近包含nls。a2.前述a的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶在所述核酸酶的c末端处或附近包含nls。a3.前述a1的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶在所述核酸酶的n末端处或附近包含两个nls序列。a4.前述a2的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶在所述核酸酶的c末端处或附近包含两个nls序列。a5.前述a的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶在所述核酸酶的n末端和c末端两者处或附近包含nls。a6.前述a的cpf1rna指导的核酸酶，其中如果所述cpf1rna指导的核酸酶包含多于一个nls序列，所述nls序列相同或不同。a7.前述a的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述一个或多个nls序列选自由以下组成的组：核质蛋白nls(nnls)(seqidno:1)和猿猴病毒40“sv40”nls(snls)(seqidno:2)。a8.前述a的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶的序列选自由以下组成的组：his-ascpf1-nnls(seqidno:3)；his-ascpf1-snls(seqidno:4；his-ascpf1-snls-snls(seqidno:5)；his-snls-ascpf1(seqidno:6)；his-snls-snls-ascpf1(seqidno:7)；snls-snls-ascpf1(seqidno:8)；his-snls-ascpf1-snls(seqidno:9)；和his-snls-snls-ascpf1-snls-snls(seqidno:10)。b.在某些非限制性实施例中，本发明披露的主题提供了包含半胱氨酸氨基酸缺失或取代的分离的cpf1rna指导的核酸酶。b1.前述b的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶包含野生型ascpf1氨基酸序列的c65、c205、c334、c379、c608、c674、c1025或c1248处的缺失或取代。b2.前述b1的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶包含相对于野生型ascpf1氨基酸序列选自由以下组成的组的取代：c65s/a、c205s/a、c334s/a、c379s/a、c608s/a、c674s/a和c1025s/a。b3.前述b1的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶包含野生型ascpf1氨基酸序列的c334和c674或c334、c379和c674处的缺失或取代。b4.前述b3的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶包含相对于野生型ascpf1氨基酸序列选自由以下组成的组的取代：(1)c334s/a和c674s/a；和(2)c334s/a、c379s/a和c674s/ab5.前述b的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶进一步包含nls。b6.前述b5的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶的序列选自his-ascpf1-nnlscys-less(seqidno:11)和his-ascpf1-nnlscys-low(seqidno:12)c.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了编码前述a-a8和b-b8中任一项的cpf1rna指导的核酸酶的分离的核酸。d.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含：指导rna(grna)；和前述a-a8和b-b8中任一项或由前述c的核酸编码的cpf1rna指导的核酸酶。e.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种用于修饰细胞中目的靶序列的方法，所述方法包括使细胞与以下接触：与目的靶序列互补的grna；和前述a-a8和b-b8中任一项或由前述c的核酸编码的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶修饰所述目的靶序列。e1.前述e的方法，其中所述细胞是t细胞、造血干细胞(hsc)或人脐带血来源的红系祖细胞(hudep细胞)。e2.前述e1的方法，其中所述hsc是cd34+细胞、cd34+cd90+细胞、cd34+cd38-细胞、cd34+cd90+cd49f+cd38-cd45ra-细胞、cd105+细胞、cd31+或cd133+细胞或cd34+cd90+cd133+细胞。e3.前述e1的方法，其中所述t细胞是cd8+t细胞，cd8+天然t细胞、cd4+中枢记忆t细胞、cd8+中枢记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+t细胞、cd4+干细胞记忆t细胞、cd8+干细胞记忆t细胞、cd4+辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4+天然t细胞、th17cd4+t细胞、th1cd4+t细胞、th2cd4+t细胞、th9cd4+t细胞、cd4+foxp3+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞或cd4+cd25+cd127-foxp3+t细胞。e4.前述e的方法，其中所述cpf1rna指导的核酸酶修饰所述目的靶序列，以实现至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的编辑。e5.前述e的方法，所述方法进一步包括与目的第二靶序列互补的第二grna。e6.前述e的方法，所述方法进一步包括第二rna指导的核酸酶。e7.前述e的方法，其中所述目的靶序列选自由以下组成的组：hbg1基因序列的一部分；和bcl11a基因序列的一部分。e8.前述e7的方法，其中所述hbg1基因序列的一部分是所述hbg基因的-110nt启动子区。e9.前述e8的方法，其中所述hbg1基因序列的一部分是所述hbg基因的-110nt启动子区的caat盒。e10.前述e7的方法，其中所述bcl11a基因序列的一部分是所述bcl11a基因的内含子2的+58dhs区。e11.前述e10的方法，其中所述bcl11a基因序列的一部分是所述bcl11a基因的内含子2的+58dhs区的gata1基序。e12.前述e的方法，其中所述目的靶序列选自由以下组成的组：fas基因序列的一部分；bid基因序列的一部分；ctla4基因序列的一部分；pdcd1基因序列的一部分；cblb基因序列的一部分；ptpn6基因序列的一部分；b2m基因序列的一部分；trac基因序列的一部分；和trbc基因序列的一部分。e13.前述e12的方法，其中所述目的靶序列选自由以下组成的组：b2m基因序列的一部分；trac基因序列的一部分；和trbc基因序列的一部分。e14.前述e13的方法，其中所述b2m基因序列的部分在所述b2m基因的编码序列的前500bp内。e15.前述e13的方法，其中所述b2m基因序列的部分在所述b2m基因的编码序列的第501个核苷酸和最后一个核苷酸之间。e16.前述e12的细胞，其中所述trac基因序列的部分在所述trac基因的编码序列的前500bp内。e17.前述e12的细胞，其中所述trbc基因序列的部分在所述trbc基因的编码序列的前500bp内。f.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括使来自受试者的细胞与以下接触：与靶核酸的靶序列互补的grna；和前述a-a8和b-b8中任一项的cpf1rna指导的核酸酶。f1.前述f的方法，其中所述cpf1分子在靶核酸中形成双链断裂。f2.前述f或f1的方法，其中所述cpf1分子选自由以下组成的组：氨基酸球菌属菌株bv3l6cpf1分子(ascpf1)、毛螺菌科细菌nd2006cpf1分子(lbcpf1)和毛螺菌科细菌ma2020(lb2cpf1)。f3.前述f-f2中任一项的方法，其中所述受试者患有血红蛋白病。f4.前述f3的方法，其中所述血红蛋白病是镰状细胞病或β-地中海贫血。f5.前述f-f4中任一项的方法，其中所述细胞是t细胞、造血干细胞(hsc)或人脐带血来源的红系祖细胞(hudep细胞)。f6.前述f5的方法，其中所述t细胞是cd8+t细胞，cd8+天然t细胞、cd4+中枢记忆t细胞、cd8+中枢记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+t细胞、cd4+干细胞记忆t细胞、cd8+干细胞记忆t细胞、cd4+辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4+天然t细胞、th17cd4+t细胞、th1cd4+t细胞、th2cd4+t细胞、th9cd4+t细胞、cd4+foxp3+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞或cd4+cd25+cd127-foxp3+t细胞。f7.前述f5的方法，其中所述hsc细胞是cd34+细胞、cd34+cd90+细胞、cd34+cd38-细胞、cd34+cd90+cd49f+cd38-cd45ra-细胞、cd105+细胞、cd31+、或cd133+细胞、或cd34+cd90+cd133+细胞。f8.前述f-f7中任一项的方法，其中所述接触离体地进行。f9.前述f-f8中任一项的方法，其中将所述接触的细胞返回所述受试者体内。g.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种反应混合物，所述反应混合物包含：(a)前述a-a8和b-b8中任一项的cpf1rna指导的核酸酶，(b)与靶核酸的靶序列互补的grna，以及(c)来自受试者的细胞，所述受试者将受益于所述靶核酸的一个或多个修饰。h.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：(a)前述a-a8和b-b8中任一项的cpf1rna指导的核酸酶，或编码所述cpf1rna指导的核酸酶的核酸组合物，以及(b)与靶核酸的靶序列互补的grna或核酸组合物grna。i.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种细胞，所述细胞包含经由前述d的基因组编辑系统引入的靶核酸序列中的修饰。i1.前述i的细胞，其中所述修饰是对hbg1基因序列或bcl11a基因序列的修饰。i2.前述i1的细胞，其中修饰的hbg1基因序列是hbg基因的-110nt启动子区。i3.前述权利要求i1的细胞，其中修饰的hbg1基因序列是hbg基因的-110nt启动子区的caat盒。i4.前述权利要求i1的细胞，其中修饰的bcl11a基因序列是bcl11a基因的内含子2的+58dhs区。i5.前述权利要求i1的细胞，其中修饰的bcl11a基因序列是bcl11a基因的内含子2的+58dhs区的gata1基序。j.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种用于对通过测试性cpf1rna指导的核酸酶进行的crispr/cpf1介导的靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节进行评估的方法，所述方法包括：(a)确定所述测试性cpf1rna指导的核酸酶在包含匹配位点靶核酸序列的靶核酸序列的编辑和/或表达的调节方面的活性；(b)在包含所述匹配位点靶核酸序列的所述靶核酸序列的编辑和/或表达的调节方面，将所述测试性cpf1rna指导的核酸酶的活性与对照rna指导的核酸酶的活性进行比较。j1.前述j的方法，其中匹配侧靶核酸序列选自由以下组成的组：匹配位点1(seqidno:13)、匹配位点5(seqidno:14)、匹配位点11(seqidno:15)和匹配位点18(seqidno:16)。j2.前述j的方法，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对不同细胞类型中的活性进行测定。j3.前述j的方法，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对不同配制品中的活性进行测定。j4.前述j的方法，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对不同浓度处的活性进行测定。j5.前述j的方法，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对经由不同方法制造后的活性进行测定。j6.前述j的方法，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对经由不同方法递送至细胞后的活性进行测定。j7.前述j的方法，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶包含不同的氨基酸序列。k.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了包含crispr系统的细胞，所述crispr系统能够下调选自由以下组成的组的内源基因的基因表达：bc11a和hbg1。k1.前述k的细胞，其中所述crispr系统包含与bc11a基因序列的一部分互补的grna。k2.前述k1的细胞，其中所述bc11a基因序列的一部分是所述bcl11a基因的内含子2的+58dhs区。k3.前述k1的细胞，其中所述bc11a基因序列的一部分是所述bcl11a基因的内含子2的+58dhs区的gata1基序。k4.前述k的细胞，其中所述crispr系统包含与hbg1基因序列的一部分互补的grna。k5.前述k4的细胞，其中所述hbg1基因序列的一部分是所述hbg1基因的-110nt启动子区。k6.前述k4的细胞，其中所述hbg1基因序列的一部分是所述hbg1基因的-110nt启动子区的caat盒。k7.前述k的细胞，其中所述细胞是cd34+细胞、cd34+cd90+细胞、cd34+cd38-细胞、cd34+cd90+cd49f+cd38-cd45ra-细胞、cd105+细胞、cd31+或cd133+细胞或cd34+cd90+cd133+细胞。l.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了包含crispr系统的细胞，所述crispr系统能够下调选自由以下组成的组中的至少一种内源基因的基因表达：fas、bid、ctla4、pdcd1、cblb、ptpn6、b2m、trac、ciita和trbc。l1.前述l的细胞，其中所述crispr系统包含与b2m基因序列的一部分互补的grna。l2.前述l1的细胞，其中所述b2m基因序列的部分在所述b2m基因的编码序列的前500bp内。l3.前述l1的细胞，其中所述b2m基因序列的部分在所述b2m基因的编码序列的第501个核苷酸和最后一个核苷酸之间。l4.前述l-l3中任一项的细胞，其中所述crispr系统包含与trac基因序列的一部分互补的grna。l5.前述l4的细胞，其中所述trac基因序列的部分在所述trac基因的编码序列的前500bp内。l6.前述l-l5中任一项的细胞，其中所述crispr系统包含与trbc基因序列的一部分互补的grna。l7.前述l6的细胞，其中所述trbc基因序列的部分在所述trbc基因的编码序列的前500bp内。l8.前述l-l7中任一项的细胞，其中所述crispr系统包含与ciita基因序列的一部分互补的grna。l9.前述l8的细胞，其中所述ciita基因序列的部分在所述ciita基因的编码序列的前500bp内。l10.前述l的细胞，其中所述crispr系统能够下调选自由以下组成的组的基因表达：b2m、trac和ciita。l11.前述l的细胞，其中所述crispr系统能够下调选自由以下组成的组的基因表达：b2m、trac、trbc和ciita。l12.前述l-l11中任一项的细胞，其中所述细胞是cd8+t细胞，cd8+天然t细胞、cd4+中枢记忆t细胞、cd8+中枢记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+效应记忆t细胞、cd4+t细胞、cd4+干细胞记忆t细胞、cd8+干细胞记忆t细胞、cd4+辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4+天然t细胞、th17cd4+t细胞、th1cd4+t细胞、th2cd4+t细胞、th9cd4+t细胞、cd4+foxp3+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞或cd4+cd25+cd127-foxp3+t细胞。m.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种用于对通过测试性cpf1rna指导的核酸酶进行的crispr/cpf1介导的靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节进行评估的测定，所述测定包含：(a)确定所述测试性cpf1rna指导的核酸酶在包含匹配位点靶核酸序列的靶核酸序列的编辑和/或表达的调节方面的活性；(b)在包含所述匹配位点靶核酸序列的所述靶核酸序列的编辑和/或表达的调节方面，将所述测试性cpf1rna指导的核酸酶的活性与对照rna指导的核酸酶的活性进行比较。m1.前述m的测定，其中匹配侧靶序列选自由以下组成的组：匹配位点1(seqidno:13)、匹配位点5(seqidno:14)、匹配位点11(seqidno:15)和匹配位点18(seqidno:16)。m2.前述m1的测定，其中测试性cpf1rna指导的核酸酶和对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对不同细胞类型中的活性进行测定。m3.前述m2的测定，其中测试性cpf1rna指导的核酸酶和对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对不同配制品中的活性进行测定。m4.前述m的测定，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对不同浓度处的活性进行测定。m5.前述m的测定，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对经由不同方法制造后的活性进行测定。m6.前述m的测定，其中所述测试性cpf1rna指导的核酸酶和所述对照rna指导的核酸酶：(a)具有相同的氨基酸序列；和(b)针对经由不同方法递送至细胞后的活性进行测定。n.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种多重基因组编辑系统，所述多重基因组编辑系统包含：第一指导rna(grna)，所述指导rna包含与第一基因的靶序列互补的第一靶向结构域；第二grna分子，所述grna分子包含与第二基因的靶序列互补的第二靶向结构域；和前述a-a8和b-b8中任一项或由前述c的核酸编码的cpf1rna指导的核酸酶。n1.前述n的多重基因组编辑系统，其中所述第一基因和所述第二基因选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组。n2.前述n的多重基因组编辑系统，其进一步包含：第三grna分子，所述grna分子包含与第三基因的靶序列互补的第三靶向结构域。n3.前述n2的多重基因组编辑系统，其中所述第一基因、所述第二基因和所述第三基因选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组。n4.前述n2的多重基因组编辑系统，其进一步包含：第四grna分子，所述grna分子包含与第四基因的靶序列互补的第四靶向结构域。n5.前述n4的多重基因组编辑系统，其中所述第一基因、所述第二基因、所述第三基因和所述第四基因选自由b2m、trac、ciita和trbc组成的组。o.在某些实施例中，本发明披露的主题提供了一种用于修饰细胞中多个基因的方法，所述方法包括使所述细胞与以下接触：第一(grna)，所述grna包含与第一基因的靶序列互补的第一靶向结构域；第二grna分子，所述grna分子包含与第二基因的靶序列互补的第二靶向结构域；和前述a-a8和b-b8中任一项或由前述c的核酸编码的cpf1rna指导的核酸酶，其中所述cpf1rna指导的核酸酶修饰所述第一基因和所述第二基因。o1.前述o的方法，其进一步包括：第三grna分子，所述grna分子包含与第三基因的靶序列互补的第三靶向结构域，其中所述cpf1rna指导的核酸酶修饰所述第一基因、所述第二基因和所述第三基因。o2.前述o1的方法，其进一步包括：第四grna分子，所述grna分子包含与第四基因的靶序列互补的第四靶向结构域，其中所述cpf1rna指导的核酸酶修饰所述第一基因、所述第二基因、所述第三基因和所述第四基因。o3.前述o2的方法，其中所述第一基因、所述第二基因、所述第三基因和所述第四基因选自由b2m、trac、ciita和trbc基因组成的组。o4.前述o的方法，其中所述细胞是t细胞。实例以下实例仅仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围或内容。实例1-通过基准测定使用匹配位点评估使用化脓链球菌cas9和ascpf1变体对成熟cd34+细胞的有效编辑crispr/cpf1介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节可以通过在靶核酸序列(例如，“匹配位点”靶核酸序列)方面，比较测试crispr/cpf1编辑系统的活性与对照crispr/rna指导的核酸酶编辑系统的活性而进行评估。作为匹配位点靶核酸序列包含有待被cpf1以及第二rna指导的核酸酶(例如，cas9)编辑的要求。例如，在本实例中，使用tttvascpf1野生型原型间隔子邻近基序(“pam”)和nggspcas9野生型pam。如上所述，测试的cpf1蛋白可以包含一个或多个相对于野生型cpf1蛋白的修饰。此类修饰的实例包括但不限于，上述修饰并入一个或多个nls序列，并入六组氨酸纯化序列，以及cpf1蛋白半胱氨酸氨基酸的改变，及其组合。在本实例中使用的示例性匹配位点靶核酸序列包括匹配位点1(“ms1”；seqidno:13)，匹配位点5(“ms5”；seqidno:14)，匹配位点11(“ms11”；seqidno:15)，和匹配位点18(“ms18”；seqidno:18)(图2)。为了评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列在特定细胞类型(例如cd34+hsc)中表达的调节，将crispr/cpf1基因组编辑系统(即包含cpf1rna指导的核酸酶和与靶核酸(包含匹配位点靶)的至少一部分互补的grna的系统)引入(例如，作为rnp或经由使用编码所述系统的组分的载体)到目的细胞类型的细胞中。如在此所披露检测靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节。将靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节的检测与当使用crispr/cas9基因组编辑系统用相同的匹配位点靶和相同的细胞类型检测靶核酸序列的编辑和/或靶核酸序列表达的调节时进行比较。上述描述的对比crispr/cpf1介导的对crispr/cas9介导的(或通过另一基于crispr的系统编辑)靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节的方法允许对所使用的crispr/cpf1介导的编辑系统的特定属性进行评估。例如，但并非进行限制，此类方法可用于评估crispr/cpf1介导的对比crispr/cas9介导的靶核酸序列编辑和/或靶核酸序列表达的调节以鉴定不同制造过程制备的cpf1rna指导的核酸酶和/或grna活性的差异。此类方法还可以鉴定不同配制品中存在的cpf1rna指导的核酸酶和/或grna的活性以及那些使用不同递送策略的活性的差异。在此实例中，将野生型(wt)化脓链球菌(sp)cas9和ascpf1核酸酶的编辑的基线水平在成熟的动员的外周血cd34+造血干细胞/祖细胞中进行比较。这些cd34+细胞是治疗血液病(例如，β-血红蛋白病)的临床指标，其中通过核酸酶修饰的基因型可以校正疾病表型。为了确定cd34+细胞中spcas9和ascpf1的基线编辑，细胞解冻并且在细胞因子中预刺激，并且然后与跟指导rna(靶向人类基因组中匹配位点(ms))复合的ascpf1或spcas9蛋白电穿孔(图2)。术语“匹配位点”指的是，尽管ascpf1和spcas9利用了不同的pam序列(分别为ngg和tttv)，但核酸酶靶向的位点对于两者都是相同的事实。为了确定在cd34+细胞中有效编辑所需的核糖核蛋白(rnp)的最低有效浓度，在cd34+细胞中对几个匹配位点进行了rnp剂量反应，其中两个在图3a中描绘。为了确定靶位点的编辑百分比，从ascpf1或spcas9电穿孔的细胞中提取基因组(g)dna，对靶位点进行扩增pcr，然后进行dna测序分析。图3a描绘了在一个实例中，ascpf1在编辑相同靶位点(ms5)方面比spcas9基本上更有效的结果，以及在一个实例中，与ascpf1(ms1)相比，spcas9在编辑相同靶位点方面更有效的结果。用于靶向ms5的grna是ms5指导rna。在这个实例中，约4μmcpf1rnp支持在匹配的位点5的有效的编辑(约60％)，并且与用靶向该位点的相同剂量spcas9rnp实现的编辑相比，编辑更高(图3a)。图3b描绘了用4.4μmrnp电穿孔后比较多个匹配位点的结果。这些结果确定，在位点发生编辑，其中：a)spcas9比ascpf1更有效，b)ascpf1比spcas9更有效，并且c)编辑的水平在spcas9和ascpf1之间是类似的。为了确定在cd34+细胞中编辑的最佳蛋白构型，合成了ascpf1蛋白，其中包含不同类型的nls序列，这些序列位于ascpf1蛋白的不同位置(例如c末端或n末端)。如本文所述，nnls代表核质蛋白nls，以及snls是指sv40nls(图4)。在此实例中分析了以下nls构型，his-ascpf1-nnls(seqidno:3)、his-snls-snls-ascpf1(seqidno:7)、his-snls-ascpf1(seqidno:6)、his-snls-ascpf1-snls(seqidno:9)、his-ascpf1-snls-snls(seqidno:5)和his-ascpf1-snls(seqidno:4)。将不同的蛋白变体与ms5grna复合，并且然后电穿孔到cd34+细胞、t细胞和hudep(4.4μmrnp)。在图4中，结果被描绘成归一化为针对每种细胞类型显示最大编辑的变体的％编辑。总之，这些数据表明，不同种类的核酸酶在cd34+细胞(还有了其他细胞)中的相同靶位点上具有可变活性，并且在cd34+细胞(还有其他细胞)中可以实现通过ascpf1的有效编辑。特别地，如图4所示，具有以下nls构型的蛋白质变体his-snls-snls-ascpf1，his-snls-ascpf1和his-ascpf1-snls-snls跨所有细胞类型在ms5处表现出高的编辑。实例2-电穿孔脉冲编码筛选为了鉴定电穿孔脉冲编码(其允许通过本发明的cpf1rna指导的核酸酶进行更高效的编辑)，对可能的脉冲编码进行了筛选。图18描绘了在hudep中对ascpf1的核转染筛选。剂量为2.2μm的ascpf1rnp，使用匹配位点5指导的rna，指导物:蛋白为2:1。ascpf1wt蛋白内毒素水平为<5eu/ml。用50,000hudep/条件使用不同脉冲程序测试lonza溶液se、sf和sg。脉冲编码ca-137和ca-138与溶液se显示了最佳编辑。图19描绘了在hsc中对ascpf1的核转染筛选。剂量为2.2um的ascpf1rnp，使用匹配位点5(ms5)指导的rna，指导物:蛋白为2:1。ascpf1wt蛋白内毒素水平为<5eu/ml。用50,000hsc/条件使用不同脉冲程序测试lonza溶液p1、p2、p3、p4和p5。脉冲编码ca-137(在本文中也称为“条件2”)和ca-138、以及ff-100和ff-104在溶液p2情况下显示了最佳编辑。图20确认在上述筛选中识别的脉冲编码的提高的效率。具体而言，图20描绘了在lonza-amaxa中使用特定脉冲编码使用各种grna和pam变体在hsc的bcl11a基因座处增加编辑。对所有指导物的剂量为4.4μm的rnp，具有2:1指导物:蛋白比率。每种条件处理50,000hsc。ascpf1wt、rr和rvr蛋白的内毒素水平为<5eu/ml。实例3-ascpf1在人类基因组中的与胎儿血红蛋白产生增加相关的靶位点处定向编辑cd34+细胞胎儿血红蛋白(hbf)的表达可以通过转录抑制因子bcl11a的红系细胞特异性表达的靶向破坏来诱导(canvers等人,nature[自然],527(12):192-197)。通过基因编辑策略增加hbf表达的潜在策略是引导cpf1破坏的bcl11a基因的红系特异性增强子中的gata1结合基序(其在bcl11a基因的内含子2的+58dhs区域中)。在实例中，评估了ascpf1介导的bcl11a基因内含子2的+58dhs区域中的靶位点的编辑。首先，在hudep2细胞中筛选具有不同pam(图1)的ascpf1变体指导rna，并且然后在mpbcd34+细胞中测试最有效的指导rna和核酸酶变体(图17)。在图17中测试的指导rna的序列在图7中提供。特别地，图17描绘了在hudep和hsc中用ascpf1wt和rr和rvrpam变体以及一个wtfncpf1靶筛选bcl11a增强子区。用ca-137脉冲程序和lonza溶液se进行hudep筛选。用脉冲编码eo-100和lonza溶液p3进行hsc筛选。还显示了bcl11a的对照指导物(在图17中命名为kobeh)。对所有指导物的剂量为4.4um的rnp，具有2:1指导物:蛋白比率。大约每种条件处理50,000hsc。ascpf1wt、rr和rvr蛋白的内毒素水平为<5eu/ml)。另一个增加hbf表达的潜在策略是通过a靶向破坏hbg基因，例如，hbg1或hbg2。图16描绘了在hudep和hsc中用ascpf1wt和rrpam变体靶向hbg1启动子区。在图16中测试的指导rna的序列在图6中提供。还测试了牛莫拉氏菌aax11_00205(mb3cpf1)，其在图6中称为mbcpf1。用ca-137脉冲程序和lonza溶液se进行hudep实验。用脉冲编码eo-100和lonza溶液p3进行hsc筛选。对所有指导物的剂量为4.4um的rnp，具有2:1指导物:蛋白比率。大约每种条件处理50,000hsc。ascpf1wt和rr蛋白内毒素水平为<5eu/ml。图34描绘了使用hbg1-1grna编辑hbg1基因座。ascpf1与grna在细胞中以1:4蛋白质:指导比率复合使最终的rnp剂量为8um。将rnp在rt下孵育30分钟进行复合。如图34所示，在hsc中使用hbg1-1grna导致大于60％的编辑。图16和图34所示的编辑效率之间的差异反映了进行实验的不同条件，例如，如电穿孔脉冲编码。总之，这些数据显示在cd34+细胞中在临床相关基因座(即，已知的hpfh靶位点)处ascpf1变体进行的有效编辑。实例4-半胱氨酸修饰的cpf1蛋白和rnp的产生由于已知二硫键的形成促进蛋白质的聚集，因此为了鉴定可以被改变以减少二硫键形成的可能性的半胱氨酸，对cpf1晶体结构和已知的cpf1一级氨基酸序列进行了分析(图13)。在cpf1中存在的八个半胱氨酸中，几个似乎是暴露于溶剂的，而另一些似乎是掩埋的并与其他分子间半胱氨酸不易接近，因此形成二硫键的风险不高(图13)。采用用alexafluor488c5马来酰亚胺(部分#a10254赛默飞世尔科技公司)进行的半胱氨酸标记测定，证明了与野生型和残基c379没有突变成丝氨酸的变体相比，培养48小时后在ascpf1c334sc379sc674s中半胱氨酸残基的可及性显著降低(图14)。“ascpf1无半胱氨酸”样品显示没有用马来酰亚胺试剂标记。ascpf1c334sc674s样品(在c379处未发生突变的变体)显示出几乎等同于野生型的标记，这表明晶体结构中部分暴露的c379容易与alexafluor488c5马来酰亚胺试剂接近。所有标记反应根据制造商的建议进行。简而言之，这需要20倍摩尔过量的alexafluor488c5马来酰亚胺染料与10μm蛋白质，在4℃下在h150缓冲液和10％dmso中培养至少24小时。图15比较了野生型和上述三种变体的编辑能力。由cys-lessascpf1、ascpf1-c334s-c674s和ascpf1-c334s-c379s-c674s变体的编辑获得的编辑水平与ascpf1野生型相似(图15)可观察到编辑减少。实例5-在原代t细胞中的crispr-cpf1高效编辑简介crispr-cpf1(cas12a)系统在离体基因组编辑治疗中比其他核酸酶提供几个潜在的优势，包括一种易于合成的较小的单个crrna，用野生型蛋白和工程化pam变体靶向富含t和富含c的pam的能力，以及可能导致不同的修复结果的5’交错切割。对于离体递送，使用核糖核蛋白(rnp)复合物在许多情况下比基于核酸的递送(如质粒dna)优选。在此，几个cpf1直向同源物被制作成rnp，并在多个基因组基因座上进行了稳健的编辑，这些基因座也可以被spcas9在多种细胞类型中靶向。用ascpf1及其工程化的rr和rvr-pam变体在t细胞中编辑被证实超过90％。cpf1rnp复合物活性在蛋白水平和指导物水平被证实都得到了改善，提高了跨细胞类型的功效。总之，这些发现强调了cpf1核酸酶的rnp递送在基因组编辑治疗上的前景。结果ascpf1选自几个测试的cpf1直向同源物。在原代t细胞中进行ascpf1筛选，得到几个适合的靶位点。图21和图25描绘了在trbc、trac和b2m基因座处用ascpf1及其rr变体和rvrpam变体筛选t细胞治疗性靶标。在图21中测试的指导rna的序列在表4中提供。对每个靶，使用amaxa核转染仪(龙沙公司)用脉冲编码ca-137和缓冲液p2，用2μl50μmcas9或cpf1trac指导物(指导物与蛋白比率为2:1)(最终浓度为4.4μm)电穿孔500,000个t细胞。通过流式细胞术测定蛋白的敲除百分比。大约30％的grna在初步筛选中显示超过50％的编辑，这与通常观察到的spcas9命中率相当，显示cpf1可潜在地用于患者t细胞在关键治疗基因座或多个治疗基因座处的基因编辑。图21、图25和图28中概述的结果表明，在四个同种异体t细胞靶(trbc、trac、b2m和ciita)上，对t细胞中的ascpf1wt、rr和rvr的编辑效率高，总结如图26所示。特别地，37％至43％之间的指导物提供了>50％的编辑，并被分类为命中。通过改变nls构型和电穿孔条件，获得了t细胞的有效编辑。car和tcr工程化t细胞治疗有成为免疫肿瘤学领域的变革性补充的潜能。如图32所示，某些电穿孔条件改善了t细胞中的最大编辑。图32中标记为rr-25的指导rna在本文中也被称为“b2m-2”、“b2m-29”和“b2m29-rr”。图32中标记为wt-11的指导rna在本文中也被称为“b2m-1”、“b2m-12”和“b2m12-wt”。此外，如图22所示，电穿孔脉冲编码的改变显著改善了在t细胞中在多个治疗靶基因座处的最大编辑。靶#2是trbc并且靶#3是b2m。脉冲编码#1是ds-130(本文也称为“条件1”)并且脉冲编码#2使ca-137(本文也称为“条件2”)。对每个靶，使用amaxa核转染仪(龙沙公司)用脉冲编码ds-130和缓冲液p2或用脉冲编码ca-137和缓冲液p2，用具有靶向trbc或b2m的指导物的2μl50μmcas9或cpf1rnp(指导物与蛋白比率为2:1)(每种rnp最终浓度为4.4μm)电穿孔500,000个t细胞。四天后通过流式细胞术测定蛋白的敲除百分比。如图33所示，改变nls构型也改善了t细胞的效力。aspcpf1nlsv2(本文也称为“his-ascpf1-snls-snls”)显示出比aspcpf1nlsv1(本文也称为“his-ascpf1-snls”)更好的编辑效率。用cpf1rnp在原代t细胞中在疾病相关基因座处获得有效的单个和多个敲除编辑。图23a描绘了用于离体细胞治疗的rnp工作流程。图23b所示为使用ascpf1或工程化pam变体在多个治疗相关的t细胞基因座(trac、trbc和b2m)处的有效单个敲除。比较了三个t细胞靶(trac、trbc和b2m)的单个敲除。对每个靶，使用amaxa核转染仪(龙沙公司)用脉冲编码ds-130和缓冲液p2，用2μl50μmcas9或cpf1rnp(指导物与蛋白比率为2:1)(最终浓度为4.4μm)电穿孔500,000个t细胞。四天后通过流式细胞术测定蛋白的敲除百分比。trac指导物是具有ascpf1rr酶的trac-140(本文也称为“trac-2”和“trac-140rr”)。trbc指导物是具有ascpf1wt酶的trbc-4。b2m指导物是具有ascpf1wt酶的b2m-12。图29显示了与spcas9相比，使用cpf1rnp在多个治疗相关的t细胞基因座上的单个敲除的效率。通过流式细胞术检测经cpf1-rnp处理的t细胞中两个治疗靶(tcr和b2m)的高效双敲除，如图24所示。图24显示了有效敲低trac和b2m的t细胞的分布。对每个靶，使用amaxa核转染仪(龙沙公司)用脉冲编码ds-130和缓冲液p2，用具有靶向trac的指导物的1μl100μmcas9或cpf1rnp以及具有靶向b2m的指导物的1μl100μmcas9或cpf1rnp(指导物与蛋白比率为2:1)(每种rnp最终浓度为4.4μm)电穿孔500,000个t细胞。四天后通过流式细胞术测定蛋白的％ko。trac指导物是具有ascpf1rr酶的trac-140。b2m指导物是具有ascpf1wt酶的b2m-12。图27示出了人原代t细胞中用cpf1或cas9进行两个t细胞靶标b2m和trac的双敲除。对每个靶，使用amaxa核转染仪(龙沙公司)用脉冲编码ca-137和缓冲液p2，用2μl50μmcas9或与trac或b2mcas9复合的cpf1蛋白或cpf1指导物(指导物与蛋白比率为4:1)(最终rnp浓度为4.4μm)电穿孔500,000个t细胞。通过流式细胞术测定蛋白的敲除百分比。如图27所示，大多数t细胞被成功地编辑以敲低b2m和trac。这些结果还表明，对于每个t细胞靶可以使用不同的核酸酶。使用的cpf1trac指导物是trac-140并且使用的cpf1b2m指导物是b2m-12。图30示出了在人原代t细胞中用cpf1rnp进行三个t细胞靶(trac、b2m和ciita)的三敲除。通过流式细胞术测定蛋白的敲除百分比。如图30所示，观察到所有三个t细胞靶的有效编辑。本实验用2.9μm的rnp(具有与trac指导物trac-140复合的ascpf1rr(pro282))、2.9μmrnp(含有与b2m指导物b2m-12复合的ascpf1wt(pro281))以及2.9μm的rnp(含有与ciita指导物ciita-34复合的ascpf1wt(pro281))一起递送，总rnp浓度为8.7μm。对于每种rnp，指导物:蛋白比率是2:1。在lonza系统上，使用脉冲编码ca-137和缓冲液p2将rnp递送至500,000个t细胞。通过流式细胞术和ngs对trac和b2m进行编辑评估，而对ciita只进行ngs评估。在相同的条件下使用trac指导物trac-13，b2m指导物b2m-29和ciita指导物ciita-45，ciita-41和ciita-10获得了相似的结果。图31a示出了用于鉴定或验证潜在脱靶的工作流。图31b总结了靠前的cpf1候选指导物对三个t细胞靶ciita、trac和b2m的特异性。如图31a和图31b所示，通过对来自电脑模拟(insilico)、digenome-seq和guide-seq测试的潜在脱靶位点进行靶向扩增测序，未发现可检测到的脱靶，并且所有检测的指导rna都具高编辑效率。图40显示了对于wtascpf1和rrascpf1变体，靠前的同种异体指导rna在t细胞中对t细胞靶trac、b2m和ciita的剂量反应。将来自用最高剂量rnp处理的细胞的基因组dna送去进行靶向扩增测序，以评估指导物各自靶位点的每个处的indel。本实验使用lonza电转化仪和脉冲编码ca-137在t细胞中进行。实例6-cpf1介导的ciita敲除的表型分析为了确定在t细胞中敲除ciita对主要组织相容性复合体ii类(mhc-ii)受体表达的影响，用工程化的rnp转染细胞，以靶向ciita基因的外显子。此基因参与mhcii受体的表面表达。外显子中的indel会导致截短，其失活ciita，阻止t细胞表面mhcii(hladr、dp、dq)受体的表达。ascpf1rnp通过将ascpf1变体与指导rna以1:2的比例组合复合而成。使用的grna为ciita-34(靶向外显子1)、ciita-41(靶向外显子2)、ciita-45(靶向外显子3)和ciita-10(靶向外显子6)(图37b)。grnaciita-45本文也称为“ciita-45rr”和“ciita-2”。grnaciita-41本文也称为“ciita-41rr”。grnaciita-34本文也称为“ciita-34wt”。grnaciita-10本文也称为“ciita-1”和“ciita-10wt。”然后在室温下孵育30分钟，然后将试管浸入液氮中，并在-80℃下储存，直到核感染。将3μlrnp转移到96孔lonza核转染板的每个孔中。将每种条件下的500,000个t细胞以1500rpm离心5分钟。对于每个样品将沉淀物重悬浮在20μl的lonzap2核转染缓冲液中，并且然后将20μl重悬浮的t细胞添加到lonza96孔板的每个孔中。用脉冲编码ca-137立即对细胞进行核转染。然后将80μl预热的(37c)扩增培养基混合到每个孔中。将全部体积(3μlrnp，在p2缓冲液中的20μlt细胞，和80μl培养基)转移到有100μl扩增培养基的预热的96孔非tc处理的板中。将细胞在37℃和5％co2下孵育，直到分析。在核转染后第4天，将一部分细胞裂解，并提交基因组dna进行illumina测序。将剩余细胞扩增直至核转染后第6天，并且然后用cd3/cd28珠在刺激培养基(高il-2、il-7和il-15)中激活，以刺激mhcii的表面表达。在第7天，将细胞从珠上洗涤下来，并用靶向mhcii(hladr、dp、dq)受体的单克隆抗体染色，以对ciita的敲除进行表型评估。通过流式细胞术对这种结合进行定量。图36中提供的图像示出了通过流式细胞仪检测mab上的fitc-a荧光团(在细胞表面上)。荧光强度与在细胞表面上存在或不存在与mhcii受体结合的mab直接相关。高荧光指示mhcii受体的高表面表达，同时无信号指示这些受体被成功敲除。x轴指示荧光强度在对数标度上的增加(从左到右)。y轴线性地代表事件(细胞)的发生率。阈值103被确定为将敲除群与未编辑群分开的点。103左边的任何细胞都被分类为敲除细胞，而这个阈值右边的细胞被认为是未编辑的。如图36所示，cpf1指导物ciita-45显示mhcii阳性细胞明显减少，而在未经处理的细胞中未观察到这一点。用脉冲编码ca-137使用lonza系统，用与ciita-45复合的ascpf1-rr处理t细胞。此外，指导物在ciita基因座处具有高编辑效率(图37a)。指导物ciita-41、ciita-10和ciita-34显示出与ciita-45类似的mhcii减少(图38)。此数据验证了四个指导物的每一个不仅有效地编辑ciita，而且还显示了所需的表型效应。已知以高效率编辑ciita的spcas9指导物显示为阳性对照。所有cpf1或spcas9ciita指导物均使用具有脉冲编码ca-137的lonza系统在t细胞中以4μmrnp剂量进行测试。将来自用最高剂量rnp处理的细胞的基因组dna送去进行靶向扩增测序，以评估脱靶位点处的indel。在ciita-45和ciita-10的预测的脱靶位点处未观察到检测阈值以上的indel形成，而ciita-34确实有一个脱靶(图39)。实例7-原型间隔子长度对于编辑效率指导rna的标准原型间隔子长度为20个核苷酸长，并且此序列与靶dna序列互补。通过增加或减少与靶序列互补的核苷酸数量，可以改变指导rna与其靶dna的结合能，并且可以改变形成的indel百分比。将长度调节为18和19减少了指导物b2m-12、b2m-29、trac-13(本文也称为“trac-13wt”和“trac-1”)、ciita-10和ciita-45(图41、图42和图43)的indel形成。此外，如图41、图42和图43所示，将长度从20增加到21、22或23个核苷酸对一些如trac-140的指导物的影响最小，并且增强了大多数其他如trac-13、b2m-12、b2m-29、ciita-10和ciita-45的效力。使用lonza电转化仪和脉冲编码ca-137用ascpf1wt或ascpf1rr在t细胞中进行了剂量反应实验。实例8-trac基因座处的靶向整合针对靶向t细胞受体α恒定(trac)基因座的grna，设计示例性dna供体模板，如图45中所示。每个供体含有相同的负荷(hpgk-gfp-polya序列)，但具有包括5’和3’悬突区的不同的同源臂序列(表14)。每个供体的同源臂长度和臂序列分别在表y和z中提供。供体1具有填充序列(表16)，以保持两者的供体长度类似。在原代cd4+t细胞中使用具有适合的grna的ascpf1rr核糖核蛋白和相关的aav供体模板在两种供体浓度下进行靶向整合实验。实验后进行细胞扩增至第7天，进行流式细胞术以通过gfp表达检查靶向整合速率。使用的grna是trac-140：gugacaagucugucugccua(rna序列)；gtgacaagtctgtctgccta(dna序列)。表14.针对在trac基因座处靶向整合的供体供体名称grnaha长度填充物负荷供体1trac-140短是pgk+gfp供体2trac-140长(500bp)否pgk+gfp表15.针对在trac基因座处靶向整合的供体模板中的同源臂(ha)长度5’ha长度3’ha长度供体1143bp+4bp悬突314bp+4bp悬突供体2500bp+4bp悬突500bp+4bp悬突表16.trac供体模板的同源臂(ha)序列表17中显示了使用较高的aav供体浓度在trac基因座处的靶向整合效率。表17.靶向整合频率流式细胞术(gfp)供体126.5％供体233.5％如表17中所示，含有长同源臂(500bp)的供体模板比含有较短同源臂的供体具有稍微更高水平的靶向整合。实例9：靶向hbg启动子区的cpf1grna的筛选为鉴定可以用作单个rnp的组分或与“增强元件”组合以增加cd34+细胞中hbg启动子区的编辑并诱导修饰的细胞的红系子代中胎儿血红蛋白表达的其他ascpf1grna，设计了靶向hbg启动子的几个结构域(表18)的his-ascpf1-nls-nls(“ascpf1”)；ascpf1s542r/k607r(“ascpf1rr)；或ascpf1s542r/k548v/n552r(“ascpf1rvr”)grna序列(在表19和图46中列出)。ascpf1rr和ascpf1rvr是工程化的ascpf1变体，其分别识别tycv/accc/cccc和tatv/ratrpam(gao2017)。表18.hbg基因组区的亚结构域表19.cpf1指导rna使用amaxa电转化仪设备(龙沙公司)，将含有与表19中单一grna复合的ascpf1蛋白、ascpf1rr蛋白或ascpf1rvr的rnp(5μm)(参见，使用的特定cpf1分子的grnaid名称；图46提供了grna的登记标识号)递送至动员的外周血(mpb)cd34+细胞。72小时后，从细胞中提取基因组dna，并通过pcr扩增的靶位点的illumina测序(ngs)分析靶位点处的插入/缺失水平。每种grna的编辑百分比(indel＝缺失和插入)显示于上表19中。在某些实施例中，包含表19(和图46)中展示的一种或多种grna的cpf1rnp可用于靶向表18中列出的区域以诱导hbf表达。为了产生rnp复合，将cpf1grna稀释至1xh150+镁(28.4μl，10nmol)中的352μm，并转移到ab1400pcr板上，放置在pcr机中，其在缓慢退火方案下运行(90℃至25℃，2％渐变，然后4℃)。向ab1400lpcr板中添加5μl的352um退火的指导物，并在1xhg300中将cpf1稀释至176μm，并向5μl352um的退火的指导物中添加5μl的176umcpf1以产生10μl88μmrnp。为了通过lonza核转染将rnp引入成熟hsc中，将130μl具有必要生长因子的完全hsc培养基添加到cellstar板中130μl，并放置在37℃的培养箱中直到需要。成熟hsc在countess上并基于以下公式，50k细胞/孔：2.50e6细胞/ml(10.5e6细胞，2个平板生物学重复)计数，并移取足够的细胞(以覆盖2个生物学重复(2个平板))到15ml或50ml锥形管中。然后将1管(相当于2个平板生物学重复)在贝克曼(beckman)离心机中以1000rpm的离心5分钟。移去培养基，并将细胞重新悬浮在p2溶液中(完整平板为4.2ml)。使用带有大容量分配芯片的mantis，nucleocuvette板的每个孔分配20μl的细胞溶液。使用具有p50管头的biomek，将2μl的rnp转移到含有细胞的nucleocuvette板中，并通过上下移液混合。然后将板放入amaxa穿梭机，并运行以下程序，cpf1：ca-137/溶液p2。使用具有p50管头的biomek，将细胞从nucleocuvette板转移到具有培养基的预热cellstar板上，并在37℃下孵育72小时。根据制造商的说明使用dnadvance试剂盒从细胞中提取基因组dna。使用靶位点的ngs分析对相对于hg38参考基因组的插入/缺失进行定量。通过引用并入本文提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其全文而特此结合，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用而结合一样。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。等效物本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在由以下权利要求涵盖。序列表<110>爱迪塔斯医药公司<120>用于基因编辑的cpf1-相关方法和组合物<130>084177.0210<150>62/597,118<151>2017-12-11<150>62/623,501<151>2018-01-29<150>62/664,905<151>2018-04-30<150>62/746,494<151>2018-10-16<160>123<170>patentin3.5版<210>1<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>核质蛋白nls（nnls）<400>1lysargproalaalathrlyslysalaglyglnalalyslyslyslys151015<210>2<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>猿猴病毒40“sv40”nls<400>2prolyslyslysarglysval15<210>3<211>1332<212>prt<213>人工序列<220><223>aspcpf1nlsv1<400>3metlyshishishishishishismetthrglnphegluglyphethr151015asnleutyrglnvalserlysthrleuargphegluleuileprogln202530glylysthrleulyshisileglngluglnglypheileglugluasp354045lysalaargasnasphistyrlysgluleulysproileileasparg505560iletyrlysthrtyralaaspglncysleuglnleuvalglnleuasp65707580trpgluasnleuseralaalaileaspsertyrarglysglulysthr859095glugluthrargasnalaleuileglugluglnalathrtyrargasn100105110alailehisasptyrpheileglyargthraspasnleuthraspala115120125ileasnlysarghisalagluiletyrlysglyleuphelysalaglu130135140leupheasnglylysvalleulysglnleuglythrvalthrthrthr145150155160gluhisgluasnalaleuleuargserpheasplysphethrthrtyr165170175pheserglyphetyrgluasnarglysasnvalpheseralagluasp180185190ileserthralaileprohisargilevalglnaspasnpheprolys195200205phelysgluasncyshisilephethrargleuilethralavalpro210215220serleuarggluhisphegluasnvallyslysalaileglyilephe225230235240valserthrserileglugluvalpheserpheprophetyrasngln245250255leuleuthrglnthrglnileaspleutyrasnglnleuleuglygly260265270ileserargglualaglythrglulysilelysglyleuasngluval275280285leuasnleualaileglnlysasnaspgluthralahisileileala290295300serleuprohisargpheileproleuphelysglnileleuserasp305310315320argasnthrleuserpheileleuglugluphelysseraspgluglu325330335valileglnserphecyslystyrlysthrleuleuargasngluasn340345350valleugluthralaglualaleupheasngluleuasnserileasp355360365leuthrhisilepheileserhislyslysleugluthrileserser370375380alaleucysasphistrpaspthrleuargasnalaleutyrgluarg385390395400argilesergluleuthrglylysilethrlysseralalysglulys405410415valglnargserleulyshisgluaspileasnleuglngluileile420425430seralaalaglylysgluleuserglualaphelysglnlysthrser435440445gluileleuserhisalahisalaalaleuaspglnproleuprothr450455460thrleulyslysglngluglulysgluileleulysserglnleuasp465470475480serleuleuglyleutyrhisleuleuasptrpphealavalaspglu485490495serasngluvalaspproglupheseralaargleuthrglyilelys500505510leuglumetgluproserleuserphetyrasnlysalaargasntyr515520525alathrlyslysprotyrservalglulysphelysleuasnphegln530535540metprothrleualaserglytrpaspvalasnlysglulysasnasn545550555560glyala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