双重信号增强纸基生物传感器在miRNA检测中的应用的制作方法

本发明涉及成本低、灵敏度高、可视化的生物小分子分析检测技术领域，更具体地说是一种能够检测mirna的荧光/比色双模式传感器制备，本发明还涉及采用了核酸酶切信号放大技术。

背景技术：

mirna属于内源性小分子非编码rna，其长度约为19~22个成熟的核苷酸。迄今为止，mirna在所有动植物中都有发现，约占所有基因组的4%。同时，mirna已被证明对细胞分裂，生长和凋亡有重要影响，一些常见疾病包括癌症，心脑血管疾病，病毒感染等均与某些特定mirna的非正常表达密切相关。每个mirna在特定的器官、组织或细胞中的确切作用和功能仍有待研究。然而，mirna的一系列特性，如短序列，低含量，易降解以及同家族成员之间相似的序列成为准确检测的限制因素。因此，无论是在组织或细胞水平上，灵敏的mirna检测方法的发展都将成为mirna生物学的一个重要里程碑。

迄今为止，mirna检测手段越来越受到人们的重视，各种各样的检测技术已被运用到mirna的准确表达之中。其中northern印迹被认为是标准示例法，其他很多关键的检测技术，比如阵列杂交技术，定量逆转录聚合酶链反应（rt-pcr），等温指数扩增技术等等都在mirna的检测中发挥了巨大的实用价值。虽然如此，高灵敏度，高通量，特异性好的检测技术仍然是个挑战。因此，迫切需要开发一个有效的平台，不仅能解决上述问题，而且可以实现可靠且便携的mirna检测。

为了提高mirna检测的灵敏度，我们在石墨相氮化碳对贵金属纳米团簇的猝灭效应和核酸循环信号放大的基础上建立了一种新型多功能荧光/比色双模生物传感器。同时采用微流控纸基平台生长贵金属纳米材料，此操作不仅大大增加了纸芯片的比表面积和表面粗糙度，而且有效降低了纸芯片的背景荧光。贵金属纳米团簇作为荧光生物探针，其独特的物理和化学性质，如生物相容性好，充电性能和发光性能优异，易于制备等优点，使得其比有机荧光分子具有更好的应用前景；此外，贵金属纳米团簇内在特有的类辣根过氧化酶催化性能在科学技术领域同样引起了巨大的关注。最重要的是，基于双信号输出模式，同时实现了比色法的初步测定和荧光法的进一步定量检测，加之核酸循环信号放大技术，实现了对mirna的超灵敏表达。我们的发明为设计传感器开辟了独特的视角，并提供了一种经济高效，方便快捷且一次性的纸芯片，可快速直观地检测mirna，且该方法有很强的实用性，可以用于各种mirna和dna的检测，对开创超灵敏、高稳定的生物分析检测和临床医学中具有很好的前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种长有铂纳米粒子（ptnps）的纸芯片及基于石墨相氮化碳纳米片（g-c3n4nss）对钯纳米团簇（pdncs）的猝灭作用的核酸循环信号放大技术实现荧光/比色双模式生物传感器的制备方法，用于小分子mirna的快速、灵敏检测。该生物传感器的制备步骤如下：

（1）设计纸芯片荧光层和比色层的疏水蜡打印区域和亲水工作区域（附图1）；

（2）在荧光区域和亲水工作区域生长ptnps；

（3）将g-c3n4nss固定在步骤（2）所得的纸芯片的工作区域，随后将dna修饰的钯纳米链（dna-pdncs）固定上去，完成荧光猝灭；

（4）将待测mirna链固定在步骤（3）所得的纸芯片的工作区域，引入双工特定核酸酶（dsn）进行核酸循环信号放大；

（5）比色预测定：将步骤（4）所得的纸芯片折叠（附图2），在比色层的工作区域滴加显色底物、ph为4~6的缓冲溶液和过氧化氢，进行比色分析；

（6）精确荧光测定：将步骤（4）所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长380nm和发射波长460nm下进行荧光测定。

本发明所述的纸材料为色谱纸，所获得的荧光/比色双模式纸芯片图案用adobeillustratorcs4软件设计，该微流控纸芯片制备过程如下：在计算机上设计微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图2所示，该微流控纸芯片包括左侧比色反应区域，中间工作区域，右边荧光反应区域，其中亲水区域直径尺寸为6mm，通道宽度为2mm。

本发明所述荧光层和工作区域生长ptnps的步骤为：将新鲜制备的10-100μl氯铂酸（h2ptcl6，浓度为20mm）和10-100μl硼氢化钠（nabh4，浓度为20mm）快速混合均匀，然后将混合液滴加至纸芯片工作区域并于室温下干燥20min。随后，使用超纯水彻底洗涤上述纸芯片3次，然后在室温下干燥30min。

本发明所述将g-c3n4nss固定在步骤（2）所得的纸芯片的工作区域，随后将dna-pdncs固定上去，完成荧光猝灭的步骤为：

（1）合成g-c3n4nss：首先，称量1-5g三聚氰胺粉末置于带有盖子的瓷坩埚中，在通风状态下于600℃下加热2h，其中加热和冷却过程的速率均为3℃/min，合成黄色大块石墨相氮化碳（g-c3n4）。随后，将g-c3n4研磨至超细粉末，称取10-200mg分散在10-200ml超纯水中，超声18h。超声后得到的悬浮液以8000r/min的速度离心，以除去剩余的未剥离的g-c3n4。最后，在60℃真空条件下收集并浓缩上清液，得到的乳状悬浮液即为g-c3n4nss；

（2）合成dna-pdncs：将10-200μlpdcl2溶液（浓度为0.1m）和10-20ml二甲基甲酰胺（dmf）混合在一起，5min后，将混合溶液在150℃下加热回流6h，得到黄色溶液。然后，将溶液以8000r/min离心以获得pdncs。随后，将50-300μldna（浓度为10μm）引入所制备的pdncs溶液（1-5ml）中，在室温下反应45min，以获得dna-pdncs；

（3）猝灭反应：在生长ptnps的纸芯片上，引入10-200μlg-c3n4nss，于室温下静置20min，待其干燥后，滴加10-200μldna-pdncs，随后在室温下孵育30min。最后，使用超纯水彻底洗涤上述纸芯片3次，于室温下干燥30min。

本发明所述将待测mirna链固定在步骤（3）所得的纸芯片的工作区域，引入dsn进行核酸循环信号放大的步骤为：将10-200μl标准mirna溶液滴加到步骤（3）所得的纸芯片的工作区域，并在室温下孵育30min以形成dna-rna异源双链体。随后加入10-200μldsn（dsn可以选择性地切割双链dna或dna-rna异源双链体中的dna）破坏上述异源双链体，释放的mirna可以在随后的反应循环中重复使用，进行循环信号放大。

本发明所述的显色底物为3,3̍,5,5̍-四甲基联苯胺，邻苯二胺，2,2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐。

本发明所述的ph为4~6的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，tris盐酸缓冲溶液。

本发明所述mirna比色预测定步骤，分别滴加显色底物、ph为4~6的缓冲溶液和过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与mirna浓度的标准曲线，实现mirna的可视化预检。

本发明所述mirna荧光测定步骤，将纸芯片放入荧光皿中，在激发波长380nm和发射波长460nm下进行样品的测定，绘制荧光强度与mirna浓度的标准曲线，实现mirna的精确检测；

本发明的有益效果

（1）pdncs代替荧光染料，比有机荧光分子具有更好的荧光特性，且其具有优异的过氧化物酶活性，开创了超灵敏、高稳定以及长发光寿命的生物分析检测技术；

（2）ptnps的使用，增大了纸芯片比表面积并有效减少了纸的背景荧光，提高了检测的灵敏度；

（3）采用dsn进行核酸循环，有效实现了荧光和比色信号的双重放大；

（4）通过比色/荧光双模式生物传感器的联用，基于双信号输出模式，实现了mirna的超灵敏检测；

（5）通过改变适配体序列，可以实现不同mirna以及dna的可视化比色初检及精确的荧光测量。

附图说明

图1：纸芯片疏水蜡打印图案。

图2：纸芯片的尺寸及各区域功能；纸芯片的折叠方式。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。

实施例1

荧光/比色双模式纸芯片在检测let-7a中的应用，其特征是包括以下步骤：

（1）设计纸芯片荧光层和比色层的疏水蜡打印区域和亲水工作区域（附图1）。本发明所述的纸材料为色谱纸，所获得的荧光/比色双模式纸芯片图案用adobeillustratorcs4软件设计，该微流控纸芯片制备过程如下：在计算机上设计微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图1所示，该微流控纸芯片包括左侧比色反应区域，中间工作区域，右边荧光反应区域，其中亲水区域直径尺寸为6mm，通道宽度为2mm；

（2）在荧光区域和亲水工作区域生长ptnps。将新鲜制备的50μlh2ptcl6（浓度为20mm）和50μlnabh4（浓度为20mm）快速混合，然后将混合液滴加到纸芯片工作区域并于室温下干燥20min。随后，使用超纯水彻底洗涤上述纸芯片3次，在室温下干燥30min；

（3）将g-c3n4nss固定在步骤（2）所得的纸芯片的工作区域，随后将dna-pdncs固定上去，完成荧光猝灭。第一步合成g-c3n4nss：称量3g三聚氰胺置于带有盖子的瓷坩埚中，在通风状态下于600℃下加热2h，其中加热和冷却过程的速率均为3℃/min，合成黄色大块g-c3n4。随后，将g-c3n4研磨至超细粉末，称取100mg分散在100ml超纯水中，并超声18h。超声后得到的悬浮液以8000r/min的速度离心，从而除去剩余的未剥离的g-c3n4。最后，在60℃真空条件下收集并浓缩上清液，得到的乳状悬浮液即为g-c3n4nss。第二步合成dna-pdncs：将150μlpdcl2（浓度为0.1m）和15mldmf混合，5min后，将混合液在150℃下加热回流6h，得到黄色溶液。然后，将溶液于8000r/min下离心以获得pdncs。随后，将200μldna（浓度为10μm）引入所制备的pdncs溶液（3ml）中，在室温下反应45min，以获得dna-pdnc。最后进行猝灭反应：在生长ptnps的纸芯片上，引入100μlg-c3n4nss，室温下静置20min，待其干燥后，滴加100μldna-pdncs，于室温下孵育30min。随后，使用超纯水彻底洗涤上述纸芯片3次，然后在室温下干燥30min；

（4）将待测let-7a链固定在步骤（3）所得的纸芯片的工作区域，引入dsn进行核酸循环信号放大。将100μl标准let-7a溶液滴加到步骤（3）所得的纸芯片的工作区域，，并在室温下孵育30min以形成dna-rna异源双链体。随后加入100μldsn（dsn可以选择性地切割双链dna或dna-rna异源双链体中的dna）破坏上述异源双链体，释放的let-7a可以在随后的反应循环中重复使用，进行循环信号放大；

（5）将步骤（4）所得的纸芯片折叠，在比色层的工作区域滴加30µl显色底物3,3̍,5,5̍-四甲基联苯胺（tmb）、ph为4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和过氧化氢，进行比色预测定，绘制灰度与let-7a浓度的标准曲线，实现let-7a的可视化预检；

（6）精确荧光测定：将步骤（4）所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长380nm和发射波长460nm下进行荧光测定，绘制荧光强度与let-7a浓度的标准曲线，实现let-7a的精确检测。

实施例2

检测步骤同例1，不同之处是：将检测物质let-7a换成其他mirna或者dna等小分子，相应的步骤（3）所用的dna序列也需改变。

序列表

<110>济南大学

<120>双重信号增强纸基生物传感器在mirna检测中的应用

<130>2019

<141>2019-01-07

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uugauauguuggaugauggagu22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aactatacaacctactacctca22