本发明涉及木寡糖的制备方法。更具体地说，本发明涉及无需对底物进行化学预处理的木寡糖的制备方法。
背景技术：
木寡糖作为益生元广泛应用于保健食品产业，其还可作为保湿剂或低热量添加剂在食品中使用。农产品加工副产物中蕴含丰富的木聚糖资源。木寡糖是以木聚糖为底物通过木聚糖酶水解β-1,4木糖苷键而得到的以木二糖、木三糖和木四糖等为主要成分的低聚木糖混合物。玉米芯、甘蔗渣、稻壳中均有较高木聚糖含量，是制备木寡糖的理想天然原料。然而，由于天然木聚糖分子是一种杂合多聚糖，主链与侧链分子间的交联致使木聚糖形成了难以被酶解的复杂网络化底物结构，现有酶解木聚糖工艺存在酶解效率低，工艺成本高等问题。因此，亟需设计一种能够一定程度克服上述缺陷的方法。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种木寡糖的制备方法，其无需对底物进行化学预处理，酶解效率高，工艺成本低。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了木寡糖的制备方法，包括：
以天然木聚糖为酶解底物，依次用耐高温木聚糖内切酶和双功能木聚糖水解酶进行酶解，制得木寡糖；
其中，所述耐高温木聚糖内切酶至少包括氨基酸片段v-f-e-f-e-d-r-r-t-d-l-l-e-p-a-e，所述双功能木聚糖水解酶至少包括以下氨基酸片段e-n-q-n-d-i-p、g-g-g、f-s-a、d-d-p-v-e-r、d-d-s以及r-h-g。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述双功能木聚糖水解酶至少包括以下氨基酸片段e-n-q-n-d-i-p-l-f-d、g-g-g、l-g-f-s-a-g-g、d-k-k-n-d-d-p-v-e-r、s-d-d-s-s以及h-g-r-h-g-l-g-l。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述耐高温木聚糖内切酶为caldicellulosiruptorowensensis来源，所述双功能木聚糖水解酶为caldicellulosiruptorlactoaceticus来源。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述耐高温木聚糖内切酶在ncbi数据库中的编号为adq03732。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述双功能木聚糖水解酶在ncbi数据库中的编号为wp014043093。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，以天然木聚糖为酶解底物，加入耐高温木聚糖内切酶，在50～95℃下反应20～60h，然后向反应液中加入双功能木聚糖水解酶，在40～80℃下反应20～60h，从酶解液中分离木寡糖。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，以10～15wt％的天然木聚糖为酶解底物，加入50～500u/ml耐高温木聚糖内切酶，在50～95℃下反应24～48h，然后向反应液中加入100～500u/ml双功能木聚糖水解酶，在40～80℃下反应24～48h，从酶解液中分离木寡糖。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述耐高温木聚糖内切酶或双功能木聚糖水解酶的制备方法包括：根据耐高温木聚糖内切酶或双功能木聚糖水解酶基因构建重组质粒，将重组质粒转化进入宿主，得到基因工程菌，培养、诱导基因工程菌，从培养液中分离出耐高温木聚糖内切酶或双功能木聚糖水解酶。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述耐高温木聚糖内切酶的制备方法包括：根据耐高温木聚糖内切酶基因构建重组质粒，将重组质粒热激转化进入大肠杆菌宿主，得到表达耐高温木聚糖内切酶的基因工程菌，将基因工程菌于37℃培养，当菌液od600值达到0.8时，在37℃条件下，使用异丙基硫代吡喃半乳糖苷诱导6h，用高压均质法破碎菌体，将菌液上清依次过亲和层析柱、离子交换柱和分子筛，得耐高温木聚糖内切酶酶液。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述双功能木聚糖水解酶的制备方法包括：根据双功能木聚糖水解酶基因构建重组质粒，将重组质粒热激转化进入大肠杆菌宿主，得到表达双功能木聚糖水解酶的基因工程菌，将基因工程菌于37℃培养，当菌液od600值达到0.8时，降温至18℃，在18℃条件下，使用异丙基硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导12h，用高压均质法破碎菌体，将菌液上清依次过亲和层析柱和分子筛，得双功能木聚糖水解酶酶液。
优选的是，所述的木寡糖的制备方法，所述天然木聚糖包括甘蔗渣或玉米芯。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明首先使用包含特定氨基酸片段的耐高温木聚糖内切酶水解天然木聚糖底物，破坏木聚糖天然网状结构，切割木聚糖主链β-1,4木糖苷键。高温反应条件可提升分子平均动能、反应体系传质效率和底物溶解度等因素进而提高木聚糖酶解效率。进而使用包含特定氨基酸片段的双功能木聚糖水解酶进一步处理酶解液，协同切割木聚糖侧链酯键和主链β-1,4木糖苷键，实现木寡糖制备，无需对于底物进行化学预处理。双功能木聚糖水解酶的使用可以代替糖苷水解酶和羧酸酯酶的复合使用，直接从酶的投放量和催化条件耦合优化角度降低了工艺成本。本发明以来源广泛、价格廉价的玉米芯、甘蔗渣等农产品加工副产物为原料，通过耐热木聚糖内切酶和双功能木聚糖水解酶先后催化反应制备木寡糖，为木寡糖的酶法制备提供了新的工艺路径。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
耐高温木聚糖内切酶酶活测定及定义方法：将10μl酶溶液加入90μl磷酸盐缓冲液中(ph:7.0)预热10min后加入100μl4-硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷(1mm)，反应5min后，在410nm下测定产物吸光值。将每分钟生成1μl的水解产物所需的酶量定义为一个酶活单位u。以灭活的酶液执行相同方法作为空白对照。
双功能木聚水解糖酶酶活测定及定义方法：将10μl酶溶液加入90μl磷酸盐缓冲液中(ph:6.5)预热10min后加入100μl4-硝基苯基乙酸酯(1mm)，反应5min后，在410nm下测定产物吸光值。将每分钟生成1μl的水解产物所需的酶量定义为一个酶活单位u。以灭活的酶液执行相同方法作为空白对照。
木寡糖产物的检测方法：采用高效液相色谱(hplc)检测反应体系木寡糖的量。色谱条件为：watersatlantisdc18色谱液相柱，柱温为：25℃，流动相溶液为：磷酸盐缓冲液(40mm,ph8.0)和乙腈，比例为：79:21(v/v)，流速：0.5ml/min，检测波长为：245nm。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应木二糖木三糖木四糖的量。木寡糖(g)＝木二糖(g)+木三糖(g)+木四糖(g)。
实施例1：
1)耐高温木聚糖内切酶的制备：将以耐耐高温木聚糖内切酶基因构建的重组质粒pet-28b-coxyna热激转化进入escherichiacolitransetta(de3)宿主，构建表达耐高温木聚糖内切酶的基因工程菌。将上述基因工程菌于37℃培养，当菌液od600值达到0.8时，在37℃条件下，使用异丙基硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导6h，后经高压均质法破碎菌体后，将菌液上清依次过亲和层析柱(镍柱)、阴离子交换柱和分子筛(superdex75)后制得耐高温木聚糖内切酶酶液(5.1mg/ml)。耐高温木聚糖内切酶在ncbi数据库中的编号为adq03732。
2)双功能木聚糖水解酶的制备：将以双功能木聚糖水解酶基因构建的重组质粒pet-28b-clh10热激转化进入escherichiacolibl21-gold(de3)宿主，构建表达双功能木聚糖水解酶的基因工程菌。将上述基因工程菌于37℃培养，当菌液od600值达到0.8时，降温至18℃，在18℃条件下，使用异丙基硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导12h，后经高压均质法破碎菌体后，将菌液上清依次过亲和层析柱(镍柱)和分子筛(superdex75)后制得双功能木聚糖水解酶酶液(4.9mg/ml)。双功能木聚糖水解酶在ncbi数据库中的编号为wp014043093。
3)底物预处理：将玉米芯粉碎，烘干后过60目筛后称重。
4)酶解反应：在50ml的密闭容器中进行10ml酶催化体系。称取10％wt玉米芯为底物，加入300u/ml双功能木聚糖水解酶。在ph7.0，90℃水浴，摇床转速300rmp，反应24h。向上述所得反应液中加入200u/ml双功能木聚糖水解酶，在75℃水浴摇床，转速200rmp，反应24h，离心获得包含木寡糖的酶解上清液。以灭活的酶液执行相同方法作为空白对照。
5)产物分析：经hplc分析，产物中含木寡糖324mg，其中木二糖97mg、木三糖178mg、木四糖49mg。
实施例2：
采用实施例1相同的策略制备木寡糖，区别在于，使用不同的预处理底物：将甘蔗渣粉碎，烘干后过60目筛后称重。经过hplc分析产物，包含木寡糖279mg，其中木二糖57mg、木三糖159mg、木四糖63mg。
对比例1：
采用实施例1相同的策略制备木寡糖，区别在于，使用500u/mlbacillussubtilis来源的木聚糖内切酶，35℃水浴，水解底物48h后，经过hplc分析产物，产物中含木寡糖98mg，其中木二糖18mg、木三糖52mg、木四糖18mg。
对比例2：
采用实施例1相同的策略制备木寡糖，区别在于，使用500u/mlaspergillusniger来源的木聚糖内切酶，45℃水浴，水解底物48h后，经过hplc分析产物，产物中含木寡糖202mg，其中木二糖78mg、木三糖90mg、木四糖34mg。
可以看出，相比于对比例1和对比例2，实施例1的木寡糖产量明显更高，表明实施例1中包含特定氨基酸片段的耐高温木聚糖内切酶和包含特定氨基酸片段的双功能木聚糖水解酶的协同作用能够较好地破坏木聚糖天然网状结构，提高酶解效率，而对比例1和对比例2中使用普通的木聚糖内切酶不具备类似的作用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
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