高效降解黄曲霉毒素B1的微嗜酸寡养单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物学及生物降解领域，具体涉及一种高效降解黄曲霉毒素b1的微嗜酸寡养单胞菌及其应用。

背景技术：

黄曲霉毒素(aflatoxin,aft)属于真菌毒素，是由寄生曲霉和黄曲霉产生的一类次级代谢产物(abrarm,anjumfm,buttms,etal.aflatoxins:biosynthesis,occurrence,toxicity,andremedies[j].criticalreviewsinfoodscience&nutrition,2013,53(8):862-874.)，具有强毒性、致癌性、致突变性以及致畸性，分布范围较为广泛，主要存在于土壤、动植物以及各类坚果中，特别容易污染花生、玉米、大豆、小麦等粮油产品。世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，黄曲霉毒素在ⅰ类致癌物清单中(zuckerman,ja.iarcmonographsontheevaluationofcarcinogenicriskstohumans[j].journalofclinicalpathology,1995,48(7):691-691.)。黄曲霉毒素是一组在结构和性质上相似性的剧毒物质，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，主要包括黄曲霉毒素b1、afb2、afg1、afg2、afm1、afm2等(丁炜.黄曲霉毒素解毒酶基因的克隆与表达研究[d].内蒙古农业大学,2010.)，其中黄曲霉毒素b1分布最为广泛，毒性也是最强的，毒性作用主要是对肝脏的损害。近些年来，我国乳制品、粮油食品以及饲料行业发生黄曲霉毒素超标事件发生较为频繁，已经引起政府和食品安全部门的高度重视，随着人们对真菌毒素危害性认识的逐步加深，对曲霉类真菌毒素检测、污染防控和脱毒技术方面研究工作也不断深入，其与人们生活、健康和经济利益密切相关。

近几年，发现了多种微生物对黄曲霉毒素具有显著的降解或吸附作用。例如，嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、藤黄单胞菌(luteimonassp.)、泉水单胞菌(silanimonassp.)、溶杆菌(lysobactersp.)、乳酸杆菌(lactobacillussp.)、地衣芽孢杆菌cfr1(bacilluslicheniformiscfr1)、红串红球菌(rhodococcuserythropolis)等。目前报道的绝大多数脱毒菌种在实际应用中存在如下两方面的共性问题：一，有部分菌种的脱毒机理属于物理吸附，并没有实现生物降解，菌体吸附毒素，通过动物或人体内发生解吸附作用，无脱毒意义；二，已报道的菌种对黄曲霉毒素的脱毒时间一般都在72h左右，脱毒时间较长，而且降解效率很少有能达到90％以上，实践意义和应用价值不太理想。因此，需要寻找能够高效降解黄曲霉毒素的菌种，能够真正应用到农业生产和食品安全领域。

昆虫作为一种营养丰富、高效、可持续的动物蛋白和热量来源，越来越受到人们的关注。一些昆虫由于其在特殊的自然环境下生长繁殖，能够以受到霉菌毒素污染的营养食物为能源，因此在昆虫进化过程中已经对霉菌毒素以及其它毒素产生了应对能力。

已有文献报道，zeng等人用不同浓度的人工饲料评估黄曲霉毒素b1对玉米螟不同阶段(一，三，五龄)的毒性(zengrsl,niug,wenz,etal.toxicityofaflatoxinb1tohelicoverpazeaandbioactivationbycytochromep450monooxygenases[j].journalofchemicalecology,2006,32(7):1459-1471.)。低浓度(1-20ng/g)下没有急性毒性，但黄曲霉毒素b1具有显著的慢性效应，包括持续发育,死亡率增加,化蛹率降低和蛹重减轻。而中浓等度(200ng/g)导致一龄幼虫完全死亡,相同浓度对五龄幼虫遇到黄曲霉毒素b1没有可察觉的不利影响.然而,在较高浓度(1μg/g)下食用黄曲霉毒素b1的五龄幼虫，在蛹化过程中表现出形态畸形。zeng等人用粉纹夜蛾评估了黄曲霉毒素b1对不同发育阶段的粉纹夜蛾毛虫的毒性，发现黄曲霉毒素b1的耐受性随着幼虫发育而显著增加(zengrs,wenz,niug,etal.aflatoxinb1:toxicity,bioactivationanddetoxificationinthepolyphagouscaterpillar\r,trichoplusiani[j].insectscience,2013,20(3):318-328.)。guidobosch等人用添加不同浓度黄曲霉毒素b1的家禽饲料去饲喂黑水虻幼虫(guidob,fels-klerxh,theor,etal.aflatoxinb1toleranceandaccumulationinblacksoldierflylarvae(hermetiaillucens)andyellowmealworms(tenebriomolitor)[j].toxins,2017,9(6):185.)，结果显示饲料中的黄曲霉毒素b1对黑水虻幼虫的存活率和体重没有影响，黑水虻幼虫对黄曲霉毒素b1的耐受性高达0.415mg/kg，比欧盟饲料原料的法定限值(0.02mg/kg)高出约20倍，表明黑水虻幼虫对黄曲霉毒素b1具有高度耐受性。饲喂含黄曲霉毒素b1的饲料的黑水虻幼虫，检测不到黄曲霉毒素b1，即低于0.10μg/kg的检测极限，在残渣中同样没有检测到afm1，这表明黄曲霉毒素b1在黑水虻体内并没有转化成afm1而排出体外，在这个过程中黑水虻幼虫肠道的贡献相对较大。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种高效降解黄曲霉毒素b1的微嗜酸寡养单胞菌及其应用，解决上述背景技术中提出的现有的绝大多数脱毒菌种在实际应用中存在如下两方面的共性问题：一，有部分菌种的脱毒机理属于物理吸附，并没有实现生物降解，菌体吸附毒素，通过动物或人体内发生解吸附作用，无脱毒意义；二，已报道的菌种对黄曲霉毒素的脱毒时间一般都在72h左右，脱毒时间较长，而且降解效率很少有能达到90％以上，实践意义和应用价值不太理想。

为实现本发明目的，本发明从用添加黄曲霉毒素b1标品的受污染花生饼饲喂黑水虻幼虫，幼虫长至5龄，抽取幼虫肠道，分离出一种能够高效降解黄曲霉毒素b1的黑水虻幼虫肠道共生菌。在显微镜下观察，所述黑水虻幼虫肠道共生菌的主要形态学特征为：革兰氏阴性，无芽孢。该菌在牛肉膏固体培养基37℃培养了72h后，呈现黄色的圆形菌落，边缘整齐，表面湿润光滑有光泽，菌体呈杆状。

根据所述黑水虻幼虫肠道共生菌的形态学特征和16srdna序列，将该黑水虻幼虫肠道共生菌鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(stenotrophomonasacidaminiphila)a-2。所述微嗜酸寡养单胞菌a-2于2018年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno：16752。

黄曲霉毒素b1降解实验表明，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2在短时间内具有显著的黄曲霉毒素b1的降解效果。在黄曲霉毒素b1终浓度为100μg/kg的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种微嗜酸寡养单胞菌a-2，37℃、220r/min震荡培养24h，对黄曲霉毒素b1降解率为91.91％，48h降解率可以到达96.4％；所述微嗜酸寡养单胞菌a-2还具有极强的耐热性，在100℃水煮处理和121℃，30min的高温灭菌处理后，仍能保持降解活性。

进一步地，本发明还提供一种所述微嗜酸寡养单胞菌a-2用于降解黄曲霉毒素b1的应用。

进一步地，所述降解黄曲霉毒素b1的具体步骤如下：在无菌条件下，将微嗜酸寡养单胞菌a-2接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，恒温震荡培养，将培养后的菌液进行离心，取上清液加入含有黄曲霉毒素b1的培养基中避光反应，即可。

进一步地，所述用于培养微嗜酸寡养单胞菌a-2的牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，nacl5g/l,以水配制。

进一步地，所述用于培养微嗜酸寡养单胞菌a-2的牛肉膏蛋白胨液体培养基的培养条件为：ph＝7.2-7.4，37℃，220r/min震荡培养24h。

进一步地，所述避光反应的时间为72h。

进一步地，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2经培养和离心后的上清液中的活性成分是微嗜酸寡养单胞菌a-2的胞外分泌物质。

进一步地，本发明还提供一种所述微嗜酸寡养单胞菌a-2用于霉变食品原料或饲料的脱毒处理的应用。

进一步地，所述霉变食品原料或饲料中黄曲霉毒素b1含量均分别为100μg/kg及以下。

进一步地，本发明还提供一种所述微嗜酸寡养单胞菌a-2用于制备黄曲霉毒素b1生物降解剂的应用。

本发明的有益效果是：

本发明从黑水虻肠道中筛选出了一种能够高效降解黄曲霉毒素b1的黑水虻幼虫肠道共生菌，即微嗜酸寡养单胞菌a-2，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2在黑水虻幼虫体内即可降解黄曲霉毒素b1，属于生物降解，安全可靠；

所述微嗜酸寡养单胞菌a-2降解黄曲霉毒素b1的效果极佳，在37℃、220r/min的条件下培养24h，黄曲霉毒素b1降解率可达91.91％，48h时黄曲霉毒素b1降解率可高达96.4％，脱毒时间短，效率高；

除此之外，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2还具有极强的耐热性，在100℃水煮处理和121℃，30min的高温灭菌处理后，仍能保持降解活性，具有很大的实践意义和应用价值。

附图说明

图1是样品经前处理后的毒素检测结果；

图2是微嗜酸寡养单胞菌a-2结晶紫染色镜检图片；

图3是微嗜酸寡养单胞菌a-2在牛肉膏蛋白胨平板上的生长形态；

图4是微嗜酸寡养单胞菌a-2不同组分降解黄曲霉毒素b1的结果；

图5是微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液不同处理后降解黄曲霉毒素b1的结果；

图6是实施例3中微嗜酸寡养单胞菌a-2降解黄曲霉毒素b1的结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图1～图6，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所涉及的elisa试剂盒购于北京华安麦科生物技术有限公司；黄曲霉毒素b1标品购于sigma；香豆素购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1

为黄曲霉毒素b1降解菌的筛选、鉴定和培养。

1.菌株的筛选

实验所用的黑水虻幼虫是武汉品系。取0.5cm左右的黑水虻幼虫100条，放于六角玻璃瓶中，添加100g发霉的花生饼，其中发霉的花生饼粉碎过后混匀，加水到70％，100g发霉的花生饼分三次添加，一周左右幼虫长至5龄左右，以相同方法做三组平行实验。

将三组5龄幼虫分别抽取肠道，第一组剪碎放入–80℃预冻2h，然后放入冷冻干燥机进行冻干，然后按elisa试剂盒说明书所述步骤检测黄曲霉毒素b1残余量；第二组剪碎放入香豆素液体培养基37℃、220r/min培养72h，；第三组剪碎放入添加黄曲霉毒素b1标品的牛肉膏蛋白胨培养基(黄曲霉毒素b1母液浓度为100ppm)，37℃、220r/min培养72h，三组实验瓶中剩余的花生饼残渣分别放入80℃烘箱，烘干至恒重，按elisa试剂盒说明书检测黄曲霉毒素b1残余量(图1)。

将培养了72h的香豆素液体培养基和加了黄曲霉毒素b1标品的牛肉膏蛋白胨液体培养基在超净工作台中，分别取0.2ml菌液均匀涂布在香豆素平板上，然后将两组香豆素平板均放在37℃培养箱中培养72h。

将两组香豆素平板上生长的菌落，分别用接种环在牛肉膏蛋白胨平板上划线、培养，重复多次直到得到单个菌落。把所述牛肉膏蛋白胨平板置于37℃培养箱中1-2d后挑取单个菌落。

将所述单个菌落分别接种于两个牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在两所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中均添加20μl黄曲霉毒素b1标品(100ppm),黄曲霉毒素b1终浓度为100ppb，并设置一个未接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基加入黄曲霉毒素b1标品作为空白对照，于37℃、220r/min培养24h后按elisa试剂盒说明书检测黄曲霉毒素b1含量。

黄曲霉毒素b1的提取。分别取200μl上述三个牛肉膏蛋白胨液体培养基内的菌液添加1ml的氯仿，涡旋5min后12000r/min离心10min，吸取20μl下层氯仿相转移到新管中，在通风厨晾干后加入100μl70％甲醇水溶液，充分涡旋后加入100μl去离子水，混匀后12000r/min离心2min，取50μl按照elisa试剂盒说明书进行检测。

上述实验所用的培养基，牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g/l，nacl5g/l,蛋白胨5g/l，琼脂20g/l；调节ph＝7.2-7.4，121℃灭菌30min。

香豆素培养基：kh2po40.25g/l，nh4no31g/l,cacl20.25g/l,mgso40.25g/l,琼脂20g/l；121℃灭菌30min，再将配制的0.2％的香豆素溶液过滤除菌，与灭过菌的无机溶液等体积混合，确保香豆素是唯一碳源和能源，可以在香豆素中生长的菌株具有能够利用香豆素的能力。

2.菌株的鉴定

微嗜酸寡养单胞菌a-2的形态学特征是：黄色的圆形菌落，边缘整齐，表面湿润光滑有光泽，菌体呈杆状，属于革兰氏阴性菌(图2、3)。

16srdna鉴定：利用细菌的16srdna通用引物(27f5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’),提取微嗜酸寡养单胞菌a-2的基因组dna作为模板，进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序。

3.菌株的培养

微嗜酸寡养单胞菌a-2用牛肉膏蛋白胨液体培养基进行培养，其成分是：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，nacl5g/l,以水配制；培养条件为：ph＝7.2-7.4，37℃，220r/min震荡培养24h。

实施例2

为黄曲霉毒素b1elisa快速检测试剂盒检测微嗜酸寡养单胞菌a-2的降解特性。

1.微嗜酸寡养单胞菌a-2不同组分对黄曲霉毒素b1的降解特性

微嗜酸寡养单胞菌a-2降解实验过程：将微嗜酸寡养单胞菌a-2接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、220r/min震荡培养48h，获得两组新鲜的微嗜酸寡养单胞菌a-2菌液。第一组微嗜酸寡养单胞菌a-2菌液：在4℃、8000r/min离心10min后，将微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液作为检测降解黄曲霉毒素b1的上清材料，取1ml所述微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液加入1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，37℃避光反应72h后，检测残留的黄曲霉毒素b1含量；第二组微嗜酸寡养单胞菌a-2菌液：在4℃、8000r/min离心20min后，倒掉上清液，收集菌体，菌体用pbs洗涤、离心，重复3次后加入20mlpbs重悬，制成微嗜酸寡养单胞菌a-2细胞悬浮液，取所述微嗜酸寡养单胞菌a-2细胞悬浮液1ml加入1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，37℃避光反应72h后，检测残留的黄曲霉毒素b1含量；取10ml所述微嗜酸寡养单胞菌a-2的细胞悬浮液，用超声细胞破碎仪在冰上破碎，然后4℃、12000r/min离心10min，用0.22μm滤膜过滤，即为微嗜酸寡养单胞菌a-2胞内提取物，取1ml所述微嗜酸寡养单胞菌a-2胞内提取物加入1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，37℃避光反应72h后，检测残留的黄曲霉毒素b1含量。

2.微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液不同处理对黄曲霉毒素b1的降解特性

对微嗜酸寡养单胞菌a-2的上清液进行活性检测：将微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液置于沸水中煮沸20min，取处理后的样品1ml与1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，在37℃避光反应72h后，检测黄曲霉毒素b1残余量；将微嗜酸寡养单胞菌a-2的上清液用0.22μm滤膜过滤，取处理后的样品1ml与1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，在37℃避光反应72h后，检测残留的黄曲霉毒素b1含量；将微嗜酸寡养单胞菌a-2的上清液用0.22μm滤膜过滤，然后取20ml放于高压灭菌锅中，121℃、30min进行高压灭菌处理，取处理后的样品1ml与1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，在37℃避光反应72h后，检测残留的黄曲霉毒素b1含量；将微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液先放于–80℃冰箱预冻2h，然后置于小型冷冻干燥机中处理15h，取冷冻浓缩后的样品1ml与1μl黄曲霉毒素b1(100ppm)，在37℃避光反应72h后，检测黄曲霉毒素b1含量。

微嗜酸寡养单胞菌a-2的检测结果显示，在黄曲霉毒素b1终浓度为100ppb的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液的降解率明显高于微嗜酸寡养单胞菌a-2菌悬液以及微嗜酸寡养单胞菌a-2菌胞内提取物，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液的降解率为89.22％，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2菌悬液几乎没有降解能力，所述微嗜酸寡养单胞菌a-2胞内提取物的降解率为15.81％，降解能力微弱，因此可以排除微嗜酸寡养单胞菌a-2的细胞吸附能力。这个结果表明所述微嗜酸寡养单胞菌a-2降解黄曲霉毒素b1的活性物质属于胞外分泌物质(图4)。

微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液活性检测结果显示，在黄曲霉毒素b1终浓度为100ppb的液体培养基中，微嗜酸寡养单胞菌a-2上清液经沸水处理、浓缩20倍以及高压灭菌处理后降解黄曲霉毒素b1的能力有所增强，其中浓缩了20倍之后降解率高达96.32％，只有过滤处理后黄曲霉毒素b1的降解率有所降低，为84.95％，这就否定了微嗜酸寡养单胞菌a-2活性物质是蛋白的可能性，说明微嗜酸寡养单胞菌a-2降解黄曲霉毒素b1的过程不是一个酶促反应的过程，推测是一种小分子化合物，而且耐热性能好，煮沸和浓缩都会促进黄曲霉毒素b1的降解(图5)。

实施例3

为微嗜酸寡养单胞菌a-2在玉米豆粕型饲料脱毒处理中的应用

1.实验材料

菌种活化培养基ⅰ：胰蛋白胨17.0g/l，大豆胨3.0g/l，葡萄糖2.5g/l，nacl5.0g/l，k2hpo42.5g/l，琼脂20.0g/l。

菌种活化培养基ⅱ：蛋白胨5.0g/l，牛肉膏30.0g/l，nacl5.0g/l，ph＝7.0-7.2。

上述培养基均在120℃下高压灭菌15min，实验饲料为玉米豆粕型日粮。

2.实验方法

向50ml磷酸盐缓冲液中加入适量黄曲霉毒素b1标准储备液，混匀后立即倾注于100g已粉碎好的饲料样品中，搅拌均匀，使黄曲霉毒素b1的终浓度达到100.0μg/kg，饲料于阴凉通风处晾干待用。在固体活化培养基ⅰ上连续活化待测菌种2代，将活化后的菌种接种于150ml液体活化培养基ⅱ培养48h，获得od600＝1.0的新鲜菌液。取100ml新鲜菌液与100g制备好的复合污染饲料混合均匀，将配制好的样品在37℃条件下培养，于24h和48h取样，每个降解实验设置3个重复。同时，以100ml新鲜空白培养基与100g制备好的污染毒素混合均匀混合作为阴性对照处理。处理组和空白对照组每次取样5g，立即进行黄曲霉毒素b1提取和分析。

毒素的提取。称取5.0g具有代表性的样本置入100ml具塞三角瓶中，加入60％甲醇25ml与其混合；于恒温震荡要床上振荡10min，转速为220r/min(手摇或者涡旋均需10min以上)；取液体于8000r/min离心10min(或静止3min，再用定量滤纸过滤)；取上清或滤液1ml，再加入4ml去离子水(稀释后的液体需要用1％naoh调节ph＝6-8之间)；振荡5s或手摇匀，取50μl检测黄曲霉毒素b1含量。

实验结果表明(图6)，微嗜酸寡养单胞菌a-2处理毒素复合污染的饲料(终浓度为100μg/kg)，24h对黄曲霉毒素b1降解效率为89％，48h对黄曲霉毒素b1降解效率为98％。说明微嗜酸寡养单胞菌a-2对复杂基质中的黄曲霉毒素b1的降解效果较好。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。