水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用的制作方法

本发明属生物技术领域，涉及可用于贴壁型细胞黏附与扩增的水凝胶微载体技术以及可降解该微载体的裂解液体系技术，具体涉及水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用。

背景技术：

细胞的体外高效扩增是对细胞进行基础研究和功能研究的前提与关键。目前，二维细胞培养皿是最常用的细胞体外扩增系统(merten2015)。但是，这一系统还存在着一些无法解决的问题。首先，二维培养系统的低空间和培养基利用率使得其在大规模扩增细胞上受到局限，从而无法完全满足临床研究和治疗的需求。其次，普通二维培养系统的材料、生物信号、力学性质和拓扑结构等性能都与体内环境有很大的不同。这导致在通过使用二维培养皿传代培养之后，细胞无法完全保持其在体内的功能、形态和基因表达。因此，对细胞体外大规模扩增系统的研究受到越来越多人的关注。

在这一方面，三维微载体系统作为一种细胞培养工具表现出极大的优势：1、三维微载体能够在有限的空间里为细胞的大规模扩增提供足够大的表面积；2、对微载体材料、携带的生物分子、拓扑结构等性能的选择与改进，可以让细胞的培养环境与体内的更接近。3、微载体与生物反应器的联合使用能够方便地检测细胞培养过程中的各项指标(氧含量、ph和营养物质等)。

三维微载体培养系统的研究包括细胞黏附、增殖、传代、冻存和消化等方面。其中，细胞的消化是收获所得细胞的关键步骤。微载体系统的细胞消化方式主要有两大类：保留微球的细胞消化方式和降解微球的细胞消化方式。前一种消化方式，难以收获所有的细胞，且在细胞消化之后需要采取一定的措施将细胞与微球分离。

技术实现要素：

为了解决上述存在的问题，本发明提供了水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，水凝胶微载体由水溶性高分子、多糖和蛋白质组分中的一种或多种水溶性合成高分子，经过化学交联或紫外交联得到的。

进一步地，水溶性合成高分子选自明胶、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、丝素、壳聚糖和胶原蛋白中的一种或几种混合。

进一步地，水凝胶载体的形状为微球，微球的直径为50-1,000微米。本发明中的水凝胶载体还可以为其他形状。

进一步地，水凝胶微载体由以下步骤制备得到：

甲基丙烯酸酐化明胶与交联剂在紫外照射的条件下，交联形成水凝胶微载体，此处的水凝胶微载体为甲基丙烯酸酐化明胶微载体，其中，交联剂为苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，交联剂的质量体积浓度在1mg/ml-100mg/ml之间；甲基丙烯酸酐化明胶的质量体积浓度在10mg/ml-1000mg/ml之间；

交联时，交联剂与甲基丙烯酸酐化明胶的体积配比在0.001-0.1之间。

进一步地，水凝胶微载体可被酶降解液降解，酶降解液为胶原酶，胶原酶浓度为0.0005-0.02g/ml，其中，溶剂是1％pbs(ph＝7.4)。

进一步地，水凝胶微载体可被酶降解液降解，酶降解液为胶原酶与胰酶的混合液，胶原酶浓度在0.0005-0.02g/ml，胰酶浓度在0.0001-0.005g/ml，其中，溶剂均为1％pbs(ph＝7.4)。

进一步地，所述水凝胶微载体也可用于装载细胞生物活性因子。

进一步地，装载的细胞生物活性因子包括bfgf、egf、pdgf、acta、bmp-2、bmp-4、its、tgf-b3、地塞米松和维他命c。

进一步地，水凝胶微载体可由3d打印或微流控方法制得。可以用3d打印或微流控或其他制备微球的方法将甲基丙烯酸酐化明胶与交联剂混合溶液制备成甲基丙烯酸酐化明胶微球。

进一步地，甲基丙烯酸酐化明胶由以下步骤制备得到：

将明胶溶解于水中，得到明胶水溶液，向明胶水溶液中加入甲基丙烯酸酐，25-80摄氏度反应2-6小时，将反应混合液进行透析，冷冻干燥透析后的溶液，得到甲基丙烯酸酐化明胶，保存备用；其中，制备甲基丙烯酸酐化明胶时，甲基丙烯酸酐与明胶的体积质量之比在0.1-0.8之间。

本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的水凝胶微载体能够作为细胞培养载体，能够用于细胞的黏附、扩增、原位冻存和收获；细胞收获时，采用的胶原酶消化液或者胶原酶与胰酶能够降解水凝胶微载体，这样便可以收获所有的细胞，且收集过程方便易操作。

(2)本发明的水凝胶微载体可以在-80度冷冻保存，经过冻存的微载体仍可用于培养细胞，实现细胞的黏附、扩增与消化，可减少细胞传代的影响同时为细胞的储存与运输提供了有效的途径。

(3)本发明采用胶原酶消化液或者胶原酶与胰酶混合液能够快速降解水凝胶微载体，例如直径为300-500微米的微球，能够在3-5分钟内完全被降解，降解时间短，降解速度快。

(4)本发明制备的水凝胶微载体也可用于装载生物活性因子，促进细胞增殖。

(5)本发明制备的水凝胶微载体可用于干细胞、常规原代细胞及其他传代细胞的黏附、增殖、原位冻存、运输和收获；干细胞在水凝胶微载体上的黏附率和包裹率可达80％以上；干细胞在水凝胶微载体上培养4-7天，细胞可以扩增至细胞种植数量的4倍以上；干细胞可在水凝胶微载体上于-80℃和液氮条件下原位冻存。干细胞可在水凝胶微载体被酶降解后收获。

附图说明

图1是实施例4中拍摄的脂肪间充质干细胞在甲基丙烯酸酐化明胶微球上的黏附与增殖的显微镜图。

图2是实施例6中拍摄的甲基丙烯酸酐化明胶微球降解过程的显微镜图。

图3是实施例5中拍摄的不同浓度的胶原酶对甲基丙烯酸酐化明胶微载体的降解过程的显微镜对比图。

图4是实施例7中拍摄的冻存之后的甲基丙烯酸酐化明胶微载体用于细胞培养的显微镜观察图。

图5是实施例7中拍摄的冻存之后的甲基丙烯酸酐化明胶微载体在细胞消化过程的显微镜观察图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的具体实施方案做进一步详细说明，应当指出的是，实施例只是对本发明的具体阐述，不应视为对本发明的限定。

明胶购自于sigma试剂公司，甲基丙烯酸酐购自于aladdin试剂公司，其他所用到的试剂也是购买所得。

实施例1

甲基丙烯酸酐化明胶的制备：称取50克明胶于500毫升单蒸水中，并置于40摄氏度水浴锅中，加热溶解。将溶解的明胶溶液置于磁力搅拌器上，转速为1,000转每分钟，温度为55摄氏度，置于通风橱中。边搅拌边缓慢逐滴加入5毫升甲基丙烯酸酐，50摄氏度，反应4小时。将反应混合溶液装入透析袋中(该透析袋的截留分子量是8kd～14kd)，置于双蒸水中透析，放在磁力搅拌器上，转速为310转每分钟，温度为50摄氏度，每两天换一次水。一周后，取出透析袋中的胶体溶液，4摄氏度放置4小时后，转移到-80摄氏度过夜。冷冻干燥4天后，-80摄氏度密封保存。

实施例2

甲基丙烯酸酐化明胶微球的准备：称取1克冻干后的甲基丙烯酸酐化明胶于10毫升1％pbs(ph＝7.4)中，置于40摄氏度水浴锅中溶解。溶解之后(约半小时，完全溶解)，加入25微升0.04g/ml的光敏剂和7.5微升0.004g/ml的酚红(溶剂为双蒸水)，121摄氏度高温灭菌8分钟。灭菌后的甲基丙烯酸酐化明胶通过3d打印的方法制备成甲基丙烯酸酐化明胶微球(此处，甲基丙烯酸酐化明胶微球作为水凝胶微载体)。通过3d打印，可以得到直径在10微米及以上的微球。交联是在3d打印的过程中完成的，3d打印机有紫外交联的过程，本实施例中，实验时将直径设置在400微米，通过3d打印制备得到的微球直径为400微米。

实施例3

细胞的提取与二维培养：脂肪间充质干细胞通过胶原酶消化的方法提取自人的脂肪组织。

将人的脂肪组织依次置于含有体积分数为10％，5％和1％青链霉素(gibco)的1％pbs(ph＝7.4)中分别润洗2分钟。再将0.002g/mli型胶原酶(gibco)与脂肪组织悬液按1：1的体积比混合，然后置于培养箱中消化，每半小时摇晃一次，观察消化程度。当脂肪组织的体积变为初始体积的5％左右时，离心终止消化。

将收获的细胞接种于10厘米培养皿，细胞完全培养基为含有10％(体积分数)胎牛血清(购自gibco)，1％(体积分数)青链霉素(购自gibco)的l-dmem(购自gibco)，每两天更换一次完全培养基，当细胞的面积占培养皿底部的面积达到80-90％时进行传代。传代时，先弃去培养基，用6毫升1％pbs(ph＝7.4)清洗一次，加入1毫升0.005g/ml胰酶(胰酶购自gibco，0.005g/ml胰酶，其中溶剂是1％pbs)，置于培养箱中消化3分钟。然后用1毫升完全培养基终止消化，离心收集细胞。原代(p0)细胞的接种密度为1000个细胞每平方厘米，扩增细胞的接种密度为5000个细胞每平方厘米。以下实施例中所接种的细胞的代次由第二代到第五代(p2-p5)。

实施例4

细胞黏附与扩增：细胞接种时，取200微升的浓度为100000个细胞每毫升完全培养基的细胞悬液加入到装有800颗直径为400微米的微球(此处的微球为甲基丙烯酸酐化明胶微球)的15毫升离心管中，吹打均匀，孵育4小时后，加入2毫升完全培养基。在第1、3、5、7天时，随机选取一个离心管，并对离心管中的微球进行活死染色。染色时，先弃去培养基，用1％pbs(ph＝7.4)(pbs和水的体积比为1％)清洗一次，加入500微升含有2微升pi碘化丙啶(购自dojindo)和2微升calcein-am(购自dojindo)染料的完全培养基，置于培养箱中染色30分钟。弃去染料，用1％pbs(ph＝7.4)(pbs和水的体积比为1％)清洗一次，再加入500微升完全培养基，将样品置于荧光显微镜下观察并拍照，如图1所示。

图1中：day1、day3、day5、day7分别表示第1天、第3天、第5天、第7天；从图1中可看出，第1天的染色结果表明，经过24小时后，细胞能够黏附在甲基丙烯酸酐化明胶微球上；第1、3、5、7天的染色结果表明，黏附在甲基丙烯酸酐化明胶微球上的细胞数量逐渐变多，细胞在第7天的增殖倍数约为4倍；这说明该甲基丙烯酸酐化明胶微球能够作为细胞培养的载体，用于细胞的黏附与增殖。

实施例5

不同胶原酶浓度的消化：将灭菌后的甲基丙烯酸酐化明胶按照5cm²/ml的比例加入3.5cm培养皿，覆盖均匀之后，紫外照射1分钟进行交联，得到厚度为200μm甲基丙烯酸酐化明胶涂层(即甲基丙烯酸酐化明胶微载体)；然后，接种细胞，加入3ml完全培养基。培养7天后，按照实施例4的方法进行细胞活死染色。将胶体分割成体积约为0.25平方毫米的小块，分别放入四个相同大小的3.5厘米培养皿中，置于荧光显微镜下，分别加入1毫升0.001g/ml，0.002g/ml，0.005g/ml和0.01g/ml的i型胶原酶，温度保持在25-30摄氏度，进行消化。每隔1分钟拍照一次，观察细胞的消化过程，如图3所示。

图3中，0.1％、0.2％、0.5％、1.0％分别表示：0.001g/ml，0.002g/ml，0.005g/ml和0.01g/ml的i型胶原酶；从图3中可看出，0.001g/ml-0.01g/ml的i型胶原酶都能够将甲基丙烯酸酐化明胶微载体消化；消化速度随着i型胶原酶浓度的增大而有所增加。

实施例6

细胞消化：此实施例6是接着实施例4进行的后续操作，将在甲基丙烯酸酐化明胶微球上培养7天后，按照实施例4的方法进行活死染色。将样品置于荧光显微镜下，加入1毫升0.002g/ml的i型胶原酶，温度保持在25-30摄氏度，进行消化。每隔1分钟拍照一次，观察细胞消化过程，如图2所示。

从图2中可看出，甲基丙烯酸酐化明胶微球在5分钟时被完全降解，细胞从微球上脱离下来。这说明该甲基丙烯酸酐化明胶微球能够作为细胞培养的载体，用于细胞消化；此水凝胶微载体系统的细胞消化方式为降解微球的细胞消化方式，通过降解微球的细胞消化方式，能够收获所有的细胞，并且后续收集过程比较方便、简单、容易操作。

实施例7

细胞在冻存的甲基丙烯酸酐化明胶微载体上的生长与消化：将灭菌后的甲基丙烯酸酐化明胶按照每毫升5平方厘米的比例加入3.5厘米培养皿，覆盖均匀之后，紫外照射1分钟进行交联，得到厚度为200μm甲基丙烯酸酐化明胶微涂层(即甲基丙烯酸酐化明胶微载体)；然后，加入1毫升完全培养基，用封口膜密封培养皿，放入-80摄氏度的冰箱中。一周后，取出培养皿，解冻，弃去培养基，接种细胞，加入3ml完全培养基，培养细胞。在第1、2、3、4天，按照实施例4的方法进行细胞活死染色，荧光显微镜下观察细胞并拍照，如图4所示。第5天，用实施例6中的方法对细胞进行消化，观察细胞的消化过程，并拍照，如图5所示。

图4中：day1、day2、day3、day4分别表示第1天、第2天、第3天、第4天；从图4中可看出，细胞能够贴附在冻存之后的甲基丙烯酸酐化明胶微载体上，并且细胞黏附在甲基丙烯酸酐化明胶微载体之后，能够不断增殖，细胞数量在1到4天持续增加；这说明经过冻存的甲基丙烯酸酐化明胶微载体依然能够作为细胞培养的载体，用于细胞的黏附与增殖。

从图5中可看出，冻存之后的甲基丙烯酸酐化明胶微载体能够被胶原酶消化。